山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中活性成分及風(fēng)味物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性

陳旭峰，王超宇，魏莎莎，朱 丹，郎繁繁，張曉宇，許 女*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.食醋發(fā)酵科學(xué)與工程山西省重點實驗室，山西 太原 030400；3.山西紫林醋業(yè)股份有限公司，山西 太原 030400）

我國是山楂、苦蕎的生產(chǎn)大國[1-2]。山楂（Crataegus pinnatifidaBunge）營養(yǎng)豐富，可供食用的同時還可作為一種常用的消食藥。山楂含有多種有機酸[3]，如山楂酸、檸檬酸，是促進消化的主要成分[4]；還有豐富的黃酮類物質(zhì)、氨基酸及礦物質(zhì)，食用山楂可以幫助人體改善循環(huán)，降低血壓、減少心血管類疾發(fā)病率[5-6]。

苦蕎（Fagopyrum tataricum）也可藥食兩用，我國古代便有苦蕎可治病防病的記錄[7]。苦蕎含有的營養(yǎng)素較多，據(jù)研究，苦蕎中有多種氨基酸和微量元素，有一定保健價值[8]。如苦蕎中含有其他谷物沒有的蘆丁，可以幫助舒張血管，抵抗炎癥，促進傷口愈合，降“三高”；含有的維生素E有較強的抗氧化能力，可以幫助清除過剩自由基；富含的黃酮類物質(zhì)具有抗氧化、抗炎、改善機體免疫力的功能[9]；含有的粗纖維可清潔消化壁，促進腸胃運動，增強消化功能，幫助人體排出有毒物質(zhì)，起到預(yù)防疾病的作用[10]。

山楂產(chǎn)品種類豐富，可以通過干制、發(fā)酵，做成山楂酒、罐頭等?？嗍w產(chǎn)品的種類多種多樣，如苦蕎沙琪瑪、苦蕎餅干、苦蕎酒等[11]。果糧復(fù)合醋是采用果實或果酒為原料，和糧食一起經(jīng)過微生物發(fā)酵，釀造而成。具有獨特的口味、較高的營養(yǎng)價值以及一定的保健功能。適當(dāng)飲用果糧復(fù)合醋可以幫助人體代謝、美容養(yǎng)膚、減緩細胞衰老，其中含有的有機酸、氨基酸等物質(zhì)具有預(yù)防高血壓、心臟病等作用[12]。目前關(guān)于果糧復(fù)合醋的研究越來越多，張海玲等[13]將山藥和梨混合釀造出山藥-梨復(fù)合醋，通過探究得出山藥汁與梨汁最佳配比為1∶3（V/V），并采用單因素試驗與正交試驗對其發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化。許艷俊[14]將蘋果、山楂、高粱復(fù)合，釀造出蘋果山楂果糧醋，優(yōu)化了該復(fù)合醋發(fā)酵工藝，且蘋果山楂果糧醋的風(fēng)味物質(zhì)種類及抗氧化活性優(yōu)于單一原料醋。

本實驗對山楂苦蕎果糧復(fù)合醋釀造生產(chǎn)過程中的總多酚、總黃酮含量、揮發(fā)性香氣成分含量及羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率、亞鐵離子螯合率進行測定，通過相關(guān)性分析，進一步了解山楂苦蕎醋總多酚、總黃酮、揮發(fā)性香氣物質(zhì)的變化及其與抗氧化活性的變化規(guī)律和特點，以期為山楂苦蕎果糧復(fù)合醋產(chǎn)品的研究開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

山楂、苦蕎、白砂糖：市售；釀酒酵母、巴氏醋桿菌、植物乳桿菌：均保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院生物工程實驗室。

1.1.2 試劑

果膠酶（酶活力≥2 500 U/g）、α-淀粉酶，糖化酶（酶活力≥2 000 U/g）：滄州夏盛酶生物技術(shù)有限公司；無水蘆?。ㄉV純）、DPPH（分析純）、福林試劑（生化試劑）：北京百奧萊博科技有限公司；氫氧化鈉、三氯乙酸、亞硝酸鈉、硝酸鋁、碳酸鈉（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar,PDA）培養(yǎng)基、醋酸菌培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司；722型可見分光光度計：浙江賽德儀器設(shè)備有限公司；Trace1300氣相色譜儀、TraceISQ質(zhì)譜分析儀：賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 山楂苦蕎醋的制備工藝流程與操作要點[15-16]

菌懸液制備：將釀酒酵母接種于1 mL PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)12 h進行活化，按接種量5%（V/V）接種于PDA培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)至OD600nm值為1，8 000 r/min離心10 min，用0.85%生理鹽水清洗菌泥，8 000 r/min二次離心10 min，離心后用與培養(yǎng)基等體積0.85%生理鹽水將菌泥重懸備用；將巴氏醋桿菌接種于1 mL醋酸菌培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h進行活化，按接種量5%（V/V）接種于醋酸菌培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)至OD600nm值為1，后續(xù)操作同釀酒酵母；將植物乳桿菌接種于1 mL MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h進行活化，按接種量5%（V/V）接種于MRS培養(yǎng)基中，后續(xù)操作同釀酒酵母菌。

原料預(yù)處理：將去核后的山楂切塊，加入4倍水，加熱至90 ℃進行軟化10 min，降溫后用榨汁機打漿，加入0.3%的果膠酶，45 ℃水浴酶解2～3 h，備用；將苦蕎用粉碎機粉粹為粉末狀，加入6倍水，加熱至85～95 ℃，不斷攪拌，進行糊化1～2 h后加入1.5%～4.5%α-淀粉酶，85～95 ℃條件下酶解至滴加碘液不變藍，降溫至60 ℃，加入0.3%糖化酶酶解1～3 h，備用。將酶解好的山楂漿與苦蕎漿按照1∶2（V/V）的比例混合，用白砂糖調(diào)糖度至11～13°Bx，60 ℃水浴30 min進行巴氏滅菌后按裝樣量為300 mL分裝至500 mL已滅菌的錐形瓶中，即為發(fā)酵原液。

酒精發(fā)酵：在無菌條件下向發(fā)酵原液中接入8%（V/V）釀酒酵母菌懸液，30 ℃恒溫發(fā)酵，第1天以8層紗布封口，每隔8 h振蕩一次。之后薄膜封口，靜置發(fā)酵，酒精度至7%vol～8%vol且穩(wěn)定即為酒精發(fā)酵結(jié)束。

醋酸發(fā)酵：在無菌條件下向發(fā)酵好的酒醪中接入10%（V/V）巴氏醋桿菌菌懸液和4%（V/V）植物乳桿菌菌懸液，8層紗布封口，30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min恒溫振蕩發(fā)酵，檢測總酸至（3～4）g/100 mL且不再上升即醋酸發(fā)酵結(jié)束。

過濾滅菌：將發(fā)酵好的醋液用8層紗布過濾，100 ℃煮2～3 min即得山楂苦蕎醋。

1.3.2 揮發(fā)性香氣物質(zhì)的測定方法

樣品的制備：分別于酒精發(fā)酵第0～5天隨機3個錐形瓶中各取酒醪樣品300 mL混合備用，編號為：AF0～AF5；分別于醋酸發(fā)酵第1～7天隨機3個錐形瓶中各取醋酸樣品300 mL混合備用，編號為：AAF1～AAF7。

取5 mL樣品通過頂空固相微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用法[17]進行測定。

氣相色譜條件：VF-5MS色譜柱（30m×0.25mm×0.25mm），載氣為氦氣（He），純度為99.999%；流量：不分流，流速1 mL/min進樣；程序升溫：40 ℃保持3 min，以速度為4 ℃/min升至160 ℃，維持1 min，以速度為10 ℃/min升至270 ℃維持5 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度、離子源溫度均為280 ℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍41～500 amu。

1.3.3 總多酚、總黃酮含量的測定方法

取樣品4 mL，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清，以Folin-Ciocalteu比色法[18]測定樣品中總多酚含量；取樣品5 mL，用10 g/L NaOH溶液調(diào)pH為中性，以蒸餾水定容至100 mL，搖勻備用，參考文獻[18]的方法測定樣品中總黃酮含量。

1.3.4 抗氧化活性的測定方法

取適量混勻的發(fā)酵樣，參考文獻[19]的方法，對羥基自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率、DPPH自由基清除率、亞鐵離子螯合率的方法進行測定。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016和SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中總多酚、總黃酮的動態(tài)變化

由圖1可知，在山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中，總多酚和總黃酮含量均在整體上呈現(xiàn)上升趨勢，二者在醋酸發(fā)酵第7天達到峰值，分別為2.43 mg/mL和1.29 mg/mL。山楂、苦蕎經(jīng)果膠酶、糖化酶酶解預(yù)處理，使其中的多酚、黃酮類物質(zhì)溶出。隨酒精發(fā)酵進行，酒醪中酒精度升高，多酚、黃酮類物質(zhì)在酒精中更易溶出，其含量快速升高。進入醋酸發(fā)酵后，總多酚、總黃酮含量較為穩(wěn)定。

圖1 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程總多酚及總黃酮含量的動態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of total polyphenols and total flavonoids contents during the fermentation of hawthorn and tartary buckwhea vinegar

2.2 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程揮發(fā)性香氣物質(zhì)的動態(tài)變化

2.2.1 山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵過程揮發(fā)性香氣物質(zhì)的動態(tài)變化

按1.3.2中的方法對山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵過程中的揮發(fā)性香氣進行測定，可知在山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵階段中檢測出58種揮發(fā)性物質(zhì)，包括29種酯類、10種醇類、5種酸類、4種醛類、1種酮類和9種其他類揮發(fā)性物質(zhì)。選取酒精發(fā)酵過程中各樣品共有的25種香氣成分繪制heatmap圖，結(jié)果見圖2。揮發(fā)性香氣成分主成分分析結(jié)果見圖3。

圖2 山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵過程揮發(fā)性香氣成分動態(tài)變化熱圖Fig.2 Heat map of dynamic changes of volatile aroma components during alcoholic fermentation of hawthorn and buckwheat vinegar

圖3 山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵過程揮發(fā)性香氣成分主成分分析得分圖（A）與載荷圖（B）Fig.3 Principal component analysis score (A) and loading (B)diagram of volatile aroma components during alcoholic fermentation of hawthorn and tartary buckwheat vinegar

由圖2可知，酒精發(fā)酵樣品AF1、AF2聚為一類，樣品AF3～AF5聚為一類，樣品AF0香氣成分較少且比例不協(xié)調(diào)，單獨成為一類。酒精發(fā)酵過程中主要的酯類物質(zhì)包括乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、辛酸異戊酯、壬酸乙酯、山梨酸乙酯等；醇類物質(zhì)主要是乙醇和異戊醇，乙醇含量隨著酒精發(fā)酵天數(shù)的增加而持續(xù)增加，異戊醇含量在酒精發(fā)酵前3天增加較多；醛類物質(zhì)含量較高的是正辛醛和壬醛。大部分揮發(fā)性香氣成分在酒精發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，發(fā)酵末期各種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量趨于穩(wěn)定。

由圖3可知，樣品AF0和AF1分別分布于第二、三象限，這是由于在發(fā)酵初期，發(fā)酵體系中反應(yīng)物充足，各反應(yīng)迅速進行，香氣種類增長較快[20]。樣品AF2和AF3分布于第四象限，樣品AF4和AF5分布于第一象限，這說明隨發(fā)酵進行，發(fā)酵體系中反應(yīng)物有所損耗，反應(yīng)逐漸平穩(wěn)，香氣種類趨于穩(wěn)定。結(jié)合載荷圖分析可知，樣品AF0和乙酸己酯、山梨酸乙酯等具有較高相關(guān)性；樣品AF1和己酸甲酯具有較高相關(guān)性；樣品AF2和AF3與癸醛、1-辛烯-3-醇、異戊醇、癸酸異戊酯等具有較高相關(guān)性；樣品AF4和AF5與癸酸甲酯、壬醛、α-松油醇、異丁醇等具有較高相關(guān)性。

2.2.2 山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵過程揮發(fā)性香氣物質(zhì)的動態(tài)變化

按1.3.2中的方法對山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵過程中的揮發(fā)性香氣變化進行測定，可知在山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵階段中共檢測到60種揮發(fā)性物質(zhì)，包括25種酯類、6種醇類、7種酸類、9種醛類、5種酮類、1種吡嗪類和7種其他類組分。與酒精階段相比，酸類物質(zhì)的總量和種類增加，醇類物質(zhì)的總量和種類減少。選取醋酸發(fā)酵過程中各樣品共有的36種香氣成分繪制heatmap圖，結(jié)果見圖4，揮發(fā)性香氣成分主成分分析結(jié)果見圖5。

圖4 山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵過程揮發(fā)性香氣動態(tài)變化熱圖Fig.4 Heat map of dynamic changes of volatile aroma components during acetic acid fermentation of hawthorn and buckwheat vinegar

圖5 山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵過程揮發(fā)性香氣成分主成分分析得分圖（A）與載荷圖（B）Fig.5 Principal component analysis score (A) and loading (B)diagram of volatile aroma components during acetic acid fermentation of hawthorn and tartary buckwheat vinegar

由圖4可知，醋酸發(fā)酵過程樣品AAF1、AAF2聚為一類，樣品AAF3、AAF4聚為一類，樣品AAF5、AAF6聚為一類，樣品AAF7香氣成分較多且比例協(xié)調(diào)，單獨成為一類。大部分揮發(fā)性香氣物質(zhì)在醋酸發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵初期，發(fā)酵液中α-松油醇、苯乙醇含量較高。隨著發(fā)酵進行，醋酸發(fā)酵樣品中香氣物質(zhì)含量發(fā)生變化，乙酸、2-甲基丁酸、乙酸乙酯、辛酸乙酯、異戊醇、正辛醛等物質(zhì)大量生成，其中乙酸含量呈現(xiàn)出不斷上升趨勢。揮發(fā)性酯類物質(zhì)多具有花果香味，山楂苦蕎醋中豐富的酯類物質(zhì)賦予其良好的風(fēng)味品質(zhì)[21-22]，發(fā)酵末期各種揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量趨于平衡。

由圖5可知，樣品AAF1、AAF2分布于第一象限，樣品AAF3～AAF5分布于第四象限，樣品AAF6、AAF7分布于第二象限，這是由于進入發(fā)酵后期，發(fā)酵液中成分接近穩(wěn)定。結(jié)合載荷圖分析可知，樣品AAF1、AAF2和異戊酸、辛酸、乙酸苯乙酯等具有較高相關(guān)性；樣品AAF3～AAF5和月桂酸乙酯、正辛醛、苯乙醇等具有較高相關(guān)性；樣品AAF6、AAF7和2-甲基丁酸、3-甲基辛酸、壬醛等具有較高相關(guān)性。

2.3 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中總多酚、總黃酮、揮發(fā)性香氣物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性

2.3.1 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中抗氧化活性動態(tài)變化

山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中抗氧化活性指標的變化見圖6。由圖6可知，4種抗氧化活性指標在發(fā)酵過程中均呈先上升后平穩(wěn)的趨勢。羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率和DPPH自由基清除率都在酒精發(fā)酵第5天達到最大，分別為81.4%、52.3%和99.8%；亞鐵離子螯合率在醋酸發(fā)酵第1天達到最高值90.6%。

圖6 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程抗氧化活性的動態(tài)變化Fig.6 Dynamic changes of antioxidant activity during fermentation of hawthorn tartary buckwheat vinegar

2.3.2 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中總多酚、總黃酮與抗氧化活性的相關(guān)性

通過皮爾森相關(guān)分析法，對發(fā)酵過程中總多酚、總黃酮的含量變化同抗氧化活性的相關(guān)性進行分析，結(jié)果見表1。由表1可知，總多酚和總黃酮的含量與4種抗氧化活性指標均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其中，總多酚含量與亞鐵離子螯合率、羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率相關(guān)性較強，且總多酚含量與抗氧化活性的相關(guān)性均高于總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性[23]。

表1 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中總多酚及總黃酮的含量和抗氧化能力的相關(guān)性Table 1 Correlation between total polyphenol content,total flavonoid content and antioxidant ability during hawthorn tartary buckwheat vinegar fermentation

2.3.3 山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中揮發(fā)性香氣物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性

目前有許多學(xué)者對揮發(fā)性香氣物質(zhì)的抗氧化活性進行研究，據(jù)報道，有一些揮發(fā)性香氣物質(zhì)具有一定的抗氧化能力[24-25]。李紅等[26]研究啤酒抗氧化指標與風(fēng)味保鮮期的相關(guān)性時，發(fā)現(xiàn)多酚是主要的天然抗氧化劑。另外糠醛、5-甲基糠醛也曾被報道可用作抗氧化劑。山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵與醋酸發(fā)酵過程揮發(fā)性成分與抗氧化能力之間的相關(guān)性分析見圖7。

圖7 山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵（A）及醋酸發(fā)酵（B）過程揮發(fā)性成分與抗氧化能力之間的相關(guān)性Fig.7 Correlation between volatile components and antioxidant capacity during alcoholic fermentation (A) and acetic acid fermentation (B) of hawthorn tartary buckwheat vinegar

由圖7A可知，山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵階段與抗氧化活性相關(guān)的揮發(fā)性成分有12種。其中，羥基自由基清除率與己酸異丁酯（R=0.999）和己酸乙酯（R=0.850）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。超氧陰離子清除率與乙酸異戊酯（R=0.970）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與己酸異丁酯未統(tǒng)計出相關(guān)性，除苯丙酸乙酯、己-4-烯酸乙酯、己酸乙酯、異己酸乙酯外，同其他6種揮發(fā)性成分均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。DPPH自由基清除率與苯丙酸乙酯（R=-0.991）呈極顯著負相關(guān)（P＜0.01），與己-4-烯酸乙酯（R=0.969）和異己酸乙酯（R=-0.923）分別呈顯著正相關(guān)和顯著負相關(guān)（P＜0.05）。亞鐵離子螯合率與苯丙酸乙酯（R=-0.986）、異己酸乙酯（R=-0.913）均呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），與己-4-烯酸乙酯（R=0.987）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。在山楂苦蕎醋酒精發(fā)酵階段，抗氧化活性均明顯上升，揮發(fā)性香氣物質(zhì)與超氧陰離子清除率的相關(guān)性較高。

由圖7B可知，山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵過程與抗氧化活性相關(guān)的揮發(fā)性成分有8種。其中，羥基自由基清除率與2-甲基丁基己酸酯（R=0.999）、正己酸乙酯（R=0.928）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與己酸異戊酯（R=0.927）、檸檬烯（R=0.950）均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。超氧陰離子清除率與己-4-烯酸乙酯（R=0.991）、檸檬烯（R=0.964）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與異戊酸己酯（R=0.997）、庚酸乙酯（R=0.993）、2-甲基辛酸丁酯（R=0.997）、己酸異戊酯（R=0.859）、正己酸乙酯（R=0.957）均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。DPPH清除率與己酸異戊酯（R=0.958）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與檸檬烯（R=0.881）呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。亞鐵離子螯合率與己酸異戊酯（R=0.972）和檸檬烯（R=0.921）呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。在山楂苦蕎醋醋酸發(fā)酵階段，抗氧化活性較穩(wěn)定，揮發(fā)性香氣物質(zhì)與抗氧化活性的相關(guān)性均較高。

3 結(jié)論

本研究主要對山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中總多酚含量、總黃酮含量、揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的變化規(guī)律，以及與羥基自由基清除率、超氧陰離子清除率、DPPH自由基清除率、亞鐵離子螯合率的相關(guān)性進行了分析。結(jié)果表明，在山楂苦蕎醋發(fā)酵過程中，總多酚、總黃酮含量呈現(xiàn)上升趨勢，在酒精發(fā)酵階段兩者含量增長明顯，醋酸發(fā)酵階段中較穩(wěn)定。總多酚、總黃酮的含量與4種抗氧化活性均呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），其中總多酚和總黃酮含量分別與亞鐵離子螯合率和DPPH自由基清除率的相關(guān)系數(shù)R最高，為0.984和0.870。在發(fā)酵過程中，大部分揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量在整體上呈現(xiàn)上升后下降的趨勢，香氣成分分布符合發(fā)酵天數(shù)走向。共有20種揮發(fā)性香氣成分與抗氧化活性具有相關(guān)性，抗氧化活性的變化主要在酒精發(fā)酵階段明顯遞增，且酒精發(fā)酵階段與抗氧化活性有相關(guān)性的揮發(fā)性香氣物質(zhì)種類明顯多于醋酸發(fā)酵階段。