多囊卵巢綜合征痰濕證患者血清差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究

高金金，王美玲，葛鵬玲，侯麗輝，李 妍

(1. 山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，山西 太原 030013；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合博士后流動站，黑龍江 哈爾濱 150040；3. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種發(fā)病多因性，臨床表現(xiàn)多態(tài)性的內(nèi)分泌和代謝紊亂綜合征，在育齡期女性發(fā)病率為15%～20%[1]，其臨床特征包括閉經(jīng)、不孕、卵巢多囊樣改變和高雄激素血癥。研究顯示，有50%～70%的PCOS患者存在胰島素抵抗(insulin resistance，IR)[2]，由于PCOS患者內(nèi)分泌失調(diào)導(dǎo)致高雄激素血癥和高胰島素血癥相互影響，患者存在發(fā)生2型糖尿病、心血管疾病和焦慮抑郁等遠期并發(fā)癥的風(fēng)險。痰濕證是 PCOS患者的常見證型[3]， PCOS痰濕證患者常伴有肥胖并以IR和高雄激素血癥為特點[4]。從生物信息學(xué)層面探討PCOS痰濕證的微觀物質(zhì)基礎(chǔ)機制，對PCOS痰濕證患者早期預(yù)測、篩查，并提前做出預(yù)防非常重要。為研究PCOS痰濕證患者的早期診斷標(biāo)志物，本研究以蛋白質(zhì)組學(xué)為切入點，采用相對和絕對定量同位素標(biāo)記技術(shù)(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)聯(lián)合超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)，對PCOS痰濕證患者異常表達蛋白進行生物學(xué)分析，探索PCOS痰濕證發(fā)病機制的特異血清生物標(biāo)志物，為臨床診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2019年4月—2020年10月于山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院和黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為PCOS痰濕證患者12例，年齡19～45歲，PCOS西醫(yī)診斷參照2003 年鹿特丹聯(lián)合修訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]，PCOS痰濕證診斷標(biāo)準(zhǔn)參照國家臨床研究基地單病種PCOS診療方案與路徑的中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則(試行)》[6]。排除其他原因所致的與PCOS臨床和內(nèi)分泌征象相仿的疾病；近3個月應(yīng)用過影響內(nèi)分泌的激素類藥物和避孕藥者；具有臨床意義的消化道系統(tǒng)疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、血液系統(tǒng)疾病、泌尿系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、精神疾病等嚴(yán)重疾病者。隨機另選取同期年齡相近的12例排除PCOS的健康者作為對照組。本研究經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過(ZXY2022JY003)。

1.2主要試劑與儀器 iTRAQ試劑盒，二硫素糖醇(DTT)，蛋白酶抑制劑，BCA蛋白定量試劑盒，測序級胰蛋白(Trypsin)。NanoAcuity超高壓納升級液相色譜；Q Exative HF質(zhì)譜儀；高pH反相色譜柱Acquity UPLC?BEH C18 1.7 μm, 2.1×50 mm；sep-Pak C18除鹽柱1 cc(100 mg)；納升級肽段分析柱Acclaim PepMap C18, 75 μm×250 mm。

1.3血清樣品的采集與保存 所有受試者于自然月經(jīng)周期或孕激素撤退出血的第3天上午采血，常溫靜置30 min，以3 000 r/min離心10 min后分離血清，收集上清液分裝后，置于-80 ℃冰箱保存，待標(biāo)本全部收集完一次性檢測。

1.4iTRAQ標(biāo)記及高效液相色譜法分級 將2組受試者血清等量混合，離心后取上清液，去除高豐度蛋白，使用BCA法對蛋白進行定量。從2組樣品中各取30 μL蛋白質(zhì)溶液電泳檢測高豐度蛋白去除情況。Strata X C18(phenomenex)對酶解后的蛋白樣品進行脫鹽處理，根據(jù)iTRAQ試劑盒操作說明標(biāo)記肽段(每5例混合為1個樣品，每組3個樣品，共計6個樣品，分別進行肽段標(biāo)記)，采用高pH反相液相色譜分離標(biāo)記肽段，色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18 1.7 μm, 2.1×50 mm。

1.5質(zhì)譜分析 Q-ExativeHF質(zhì)譜儀加熱毛細管采用數(shù)據(jù)依賴模式自動在MS和MS/MS間切換采集。全掃描MS使用Orbitrap進行一級掃描，隨后使用高能碰撞解離(Higher energy C-trap dissociation, HCD)對符合串級(MS/MS)碎裂條件的強度前10名母離子進行碎裂并用orbitrap進行掃描。將質(zhì)譜數(shù)據(jù)輸入到Proteome Discoverer(PD) 軟件，對質(zhì)譜譜圖進行篩選。PD提取后的譜圖用masco (version 2.3.2 , Matrix Science)t進行搜索，搜索結(jié)束后，PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進行定量分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件建立數(shù)據(jù)庫，差異蛋白質(zhì)點檢測采用單因素方差分析，依據(jù)蛋白質(zhì)豐度水平，差異蛋白篩選條件為匹配獨有肽段個數(shù)≥1，差異倍數(shù)>1.2或<0.83，且P-value值<0.05。

2 結(jié) 果

2.1質(zhì)譜鑒定結(jié)果 將2組樣品間的蛋白質(zhì)表達差異倍數(shù)>1.20 或<0.83且P-value<0.05作為差異表達蛋白的篩選標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出87種差異表達蛋白，其中10種蛋白表達上調(diào)，77種蛋白表達下調(diào)，部分差異表達蛋白見表1。

表1 PCOS痰濕證患者與健康對照者血清中部分差異表達蛋白

2.2差異表達蛋白KEGG通路注釋聚類分析 通過對差異表達蛋白顯著富集的代謝通路進行分析，共涉及8條KEGG信號/代謝通路。其中補體與凝血級聯(lián)反應(yīng)富集到22個差異蛋白，金黃色葡萄球菌感染富集到7個差異蛋白，百日咳信號/代謝通路富集到6個差異蛋白，膽固醇代謝富集到5個差異蛋白，細胞外基質(zhì)受體相互作用和系統(tǒng)性紅斑狼瘡分別富集到4個差異蛋白，維生素消化吸收和戊糖磷酸途徑分別富集到2個差異蛋白，見表2。

表2 PCOS痰濕證患者與健康對照者差異表達蛋白參與的信號通路

2.3差異表達蛋白GO注釋富集分析 GO功能注釋與顯著性富集分析結(jié)果顯示，篩選出的差異蛋白參與的主要生物學(xué)過程包括蛋白質(zhì)活化級聯(lián)、急性炎癥反應(yīng)、蛋白的加工調(diào)控、體液免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)等；參與的主要分子功能包括抑制活性、調(diào)節(jié)活性及結(jié)合相關(guān)；這些差異蛋白位置分布涉及細胞外區(qū)、囊泡、血液微粒、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔，且富集程度較高。見圖1。

3 討 論

PCOS中醫(yī)病機以腎虛為本，痰瘀阻滯為標(biāo)。痰濕既是人體臟腑功能失調(diào)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，又能影響臟腑、經(jīng)絡(luò)、氣血，成為導(dǎo)致疾病發(fā)生發(fā)展的致病因素。從微觀分子層面利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)尋找發(fā)病相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)，可為PCOS中醫(yī)辨證論治提供新的思路與方法。本研究利用iTRAQ技術(shù)聯(lián)合LC-MS/MS，對PCOS痰濕證和健康對照者的血清蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)了87種差異表達蛋白，通過KEGG通路注釋聚類分析提取到8條KEGG 信號/代謝通路，顯著性差異蛋白主要集中在補體與凝血級聯(lián)反應(yīng)、金黃色葡萄球菌感染、百日咳、膽固醇代謝、細胞外基質(zhì)受體相互作用、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、維生素消化吸收和戊糖磷酸途徑，提示PCOS痰濕證的病理機制可能通過上述信號通路發(fā)生作用。

作為炎性因子的補體C3是脂肪細胞產(chǎn)生和分泌補體途徑中的關(guān)鍵因子，C3的裂解片段C3a對血清中的游離脂肪酸有清除作用，可調(diào)節(jié)血脂代謝平衡。脂肪組織越多分泌的補體C3越多[7]，脂代謝紊亂時，內(nèi)源性C3水平升高可能與IR和肥胖有關(guān)[8]。補體 C3亦被認為是炎癥反應(yīng)、糖脂代謝的樞紐。有研究顯示，與健康對照組比較，PCOS患者血清C3水平明顯升高且腰圍和三酰甘油(TG)與C3水平呈正相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，PCOS患者補體C3表達量降低，并顯著富集于補體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、金黃色葡萄球菌感染、百日咳、系統(tǒng)性紅斑狼瘡4條信號通路上，說明補體C3通過炎癥作用和免疫級聯(lián)反應(yīng)在PCOS痰濕證發(fā)病過程中發(fā)揮作用。

載脂蛋白B(apolipoprotein B，apoB)是一種多態(tài)性蛋白，由不同的氨基酸合成，分為apoB45和apoB100兩大亞類，其中apoB45主要存在于乳糜微粒中，apoB100是低密度脂蛋白顆粒的主要載脂蛋白,也是低密度脂蛋白受體的配體，是膽固醇合成和脂類運載的主要物質(zhì)，可反映脂質(zhì)異常和致動脈粥樣硬化脂蛋白的顆粒數(shù)[10]。國內(nèi)一項研究表明，PCOS患者apoB/載脂蛋白A(apolipoprotein A，apoA)比值與IR的嚴(yán)重程度成正相關(guān)，隨著apoB/apoA1比值的升高，機體發(fā)生IR的風(fēng)險及嚴(yán)重程度逐漸增高[11]，表明apoB、apoB/apoA1可作為PCOS患者評估IR發(fā)生的程度和風(fēng)險的可靠指標(biāo)，可作為PCOS糖脂代謝異常的評價指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示apoB表達量下調(diào)，并顯著富集于膽固醇代謝、維生素消化吸收2條信號通路上，表明PCOS痰濕證患者在血脂代謝中可能發(fā)生紊亂或障礙。由此推測，apoB可能是PCOS痰濕證的特異性蛋白標(biāo)志物，但其作用機制仍需進一步研究闡明。

維生素D結(jié)合蛋白是參與維生素D轉(zhuǎn)運的主要蛋白，調(diào)節(jié)維生素D的代謝和分布，與游離維生素D的代謝產(chǎn)物25(OH)D呈負相關(guān)，與總25(OH)D呈正相關(guān)[12]。維生素D影響著女性生殖系統(tǒng)疾病，PCOS患者維生素D缺乏更為常見[13],國外研究表明，維生素D結(jié)合蛋白基因多態(tài)性與PCOS患者體內(nèi)維生素D及睪酮水平相關(guān)并可用來作為預(yù)測PCOS合并IR的指標(biāo)[14-15]，提示維生素D結(jié)合蛋白通過調(diào)節(jié)PCOS患者25(OH)D水平，對性腺功能起到調(diào)節(jié)作用。本研究中維生素D結(jié)合蛋白下調(diào)，提示維生素D結(jié)合蛋白在PCOS痰濕證的發(fā)病中可能發(fā)揮著維持維生素D轉(zhuǎn)運功能的作用，其表達下調(diào)使得PCOS不斷進展。同時研究表明維生素D結(jié)合蛋白除了在維生素D代謝中起關(guān)鍵作用，還參與機體免疫調(diào)節(jié)功能，提示維生素D結(jié)合蛋白在炎癥調(diào)控方面發(fā)揮作用[16]。

綜上所述，采用iTRA技術(shù)及 LC-MS/MS的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)，尋找到補體C3、aopB、維生素D結(jié)合蛋白等12種與PCOS痰濕證相關(guān)的差異表達蛋白質(zhì)，這些蛋白涉及PCOS痰濕證發(fā)病相關(guān)的補體系統(tǒng)、炎癥作用、免疫級聯(lián)反應(yīng)、糖脂代謝等系統(tǒng)，可能是PCOS痰濕證特異性血清標(biāo)志物。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。