基于代謝組學(xué)的中醫(yī)藥防治腦卒中的研究進(jìn)展

馬春玉，于子喬，王新娜，牛 萍，劉立明，劉 璐，于俊超，趙德喜

(1. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春 130117；2. 長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

腦卒中是世界范圍的公共衛(wèi)生問題，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，腦卒中位列全球死亡原因的第2位，卒中致死人數(shù)占總死亡人數(shù)的11.9%[1]。作為人口大國，我國的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，腦卒中居人群死亡原因首位，占年總死亡人數(shù)的1/5(約160萬人/年)，其中缺血性腦卒中占腦卒中發(fā)病人數(shù)的70%～80%[2-3]。中醫(yī)在《內(nèi)經(jīng)》時(shí)代就對(duì)本病有了實(shí)際的觀察和理論層面的闡述，后世醫(yī)書中也不乏對(duì)這一疾病的記載，可見本病是伴隨著人類歷史發(fā)展進(jìn)程的，醫(yī)學(xué)家們對(duì)本病的診治也一直探索著。代謝組學(xué)(metabolomics)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來的一門新興科學(xué)，它通過定性和定量分析生物樣本中小分子代謝物組學(xué)的方法來觀察生物體受到刺激后內(nèi)源性代謝物變化和代謝通路及途徑，以尋找代謝物與生理病理變化之間的相對(duì)關(guān)系，并利用液質(zhì)聯(lián)用/氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，反映其在某一時(shí)刻樣本內(nèi)所有代謝物及代謝動(dòng)態(tài)規(guī)律[4-6]。代謝組學(xué)放大了基因和蛋白表達(dá)的微小變化，反映了機(jī)體系統(tǒng)的生理和病理狀態(tài)，近年來在中醫(yī)藥防治疾病方面取得了很大的進(jìn)展。現(xiàn)將近10年基于代謝組學(xué)的中醫(yī)藥防治腦卒中的研究作如下綜述。

1 中醫(yī)學(xué)對(duì)腦卒中的認(rèn)識(shí)及治療優(yōu)勢(shì)

腦卒中與中醫(yī)學(xué)中的“中風(fēng)”一名相對(duì)應(yīng)?！秲?nèi)經(jīng)》中有與本病表現(xiàn)相關(guān)的癥狀記載，如意識(shí)不清者稱為“薄厥”，偏側(cè)肢體活動(dòng)不利者稱為“偏枯”“偏風(fēng)”，“瘖”則表示言語謇澀者。漢代張仲景所著的《金匱要略》中首見“中風(fēng)”之名。由于各代醫(yī)家所處歷史階段不同，臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)各異，他們對(duì)于中風(fēng)病致病因素、病理性質(zhì)、病因、病機(jī)關(guān)鍵的闡述不盡相同。在唐宋以前，以張仲景提出的“內(nèi)虛邪中”論為例，本病主要以“外風(fēng)”立論。到宋末元初逐漸發(fā)展為以“內(nèi)風(fēng)”學(xué)說為主，并出現(xiàn)了以朱丹溪的“濕痰生熱”論等為代表的病因病機(jī)學(xué)說。陳言對(duì)于中風(fēng)病進(jìn)行了較為細(xì)致的臨床癥狀觀察，并總結(jié)了本病的發(fā)病特點(diǎn)——喉中痰鳴、病發(fā)前眩暈、病情進(jìn)展速度快等，使得后世醫(yī)家更加意識(shí)到了預(yù)防本病的重要性。張子和在《儒門事親·風(fēng)論》中述：“風(fēng)，有善行而數(shù)變，風(fēng)之為致病皆生倉卒之變，致人言語謇澀、行動(dòng)不利”。至明清及近代，則以“內(nèi)傷積損”“肝陽化風(fēng)”“氣虛血瘀”“肝陽化風(fēng)，氣血并迸，直沖犯腦”等病機(jī)學(xué)說為代表。

呂健等[7]對(duì)臨床常見的中藥注射劑的研究頗為深入，課題組對(duì)燈盞細(xì)辛注射液治療缺血性腦卒中進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示：西藥+燈盞細(xì)辛注射液的有效性、安全性均優(yōu)于單純西藥治療(P<0.000 01)。楊云芳等[8]采用隨機(jī)的方法將986例符合納入標(biāo)準(zhǔn)的缺血性卒中急性期患者進(jìn)行分組，每組493例，治療組在觀察組西醫(yī)治療的基礎(chǔ)上，給予中醫(yī)非藥物治療(穴位敷貼、中藥熏洗等)，結(jié)果顯示：治療組加用中醫(yī)非藥物治療的總有效率高于觀察組的西醫(yī)治療，體現(xiàn)出中醫(yī)非藥物療法在腦卒中急性期患者治療中的價(jià)值。以上結(jié)果均表明，中醫(yī)藥對(duì)在腦卒中的治療中具有優(yōu)勢(shì)。

2 代謝組學(xué)對(duì)腦卒中的認(rèn)識(shí)

代謝組(metabolome)是基因組的下游產(chǎn)物，也是最終產(chǎn)物，是一些參與生物體新陳代謝、維持生物體正常生長(zhǎng)和發(fā)育功能的小分子化合物的集合。代謝組學(xué)是通過考察細(xì)胞、組織等生物體系受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來研究生物體系的一門科學(xué)。一般包括非靶向代謝組學(xué)、靶向代謝組學(xué)和脂質(zhì)代謝組學(xué)。

2.1預(yù)防與診斷 在已確定的腦卒中危險(xiǎn)因素中，血脂異常和糖尿病等疾病均以代謝變化為特征；代謝產(chǎn)物體積較小，更容易穿過血腦屏障；代謝產(chǎn)物相比于蛋白質(zhì)，能更早地反映疾病的發(fā)生。因此，在評(píng)估腦卒中風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，直接定量代謝物水平可能是一種優(yōu)于傳統(tǒng)基于危險(xiǎn)因素分類的方法[9]。應(yīng)用代謝組學(xué)的方法研究腦卒中的代謝產(chǎn)物水平及靶點(diǎn)可以為預(yù)防與診斷本病提供參考。Adnan等[10]進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性隊(duì)列研究，通過對(duì)比健康對(duì)照組和腦卒中風(fēng)險(xiǎn)組之間的不同代謝產(chǎn)物，以分析發(fā)生腦卒中之前血液的病理生理學(xué)變化。研究使用非靶向代謝組學(xué)得到了能夠區(qū)分兩組的氨基酸。此外，靶向代謝組學(xué)方法證實(shí)，定量的L-色氨酸、3-甲氧基酪胺、甲硫氨酸、高半胱氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、肉堿、精氨酸、亞油酸和鞘氨醇這些產(chǎn)物在后來被診斷出腦卒中的患者血清中異常升高。這些化合物可以作為早期診斷腦卒中的新型生物標(biāo)志物。

Sun等[11]采用非靶向血清代謝組學(xué)的方法進(jìn)行了一項(xiàng)尋找腦卒中生物標(biāo)志物的前瞻性研究，對(duì)114例腦卒中患者和112例健康對(duì)照樣本的研究結(jié)果表明，與細(xì)胞內(nèi)十六烷二酸合成相關(guān)的通路參與了腦卒中的發(fā)生。Hu等[12]對(duì)招募的129名腦梗死和73名腦出血患者，以及98名健康對(duì)照者進(jìn)行了血液樣品的代謝組學(xué)分析。與健康對(duì)照組相比，腦梗死和腦出血患者分別顯示出明顯的代謝物變化，如在腦梗死組的Tyr、C5-OH/C0、Cit、Asn、Pro、Val、Arg/Orn、Leu和Val/Phe水平明顯升高。Yun等[13]應(yīng)用代謝組學(xué)研究大鼠局灶性腦缺血/再灌注(I/R)損傷早期的生化變化。研究結(jié)果表明，缺血大鼠腦脊液中的潛在生物標(biāo)志物有乙酸、3-羥基異戊酸、3-羥基丁酸、膽堿、L-丙氨酸、肌酸、肌酐、甘氨酸、丙酮酸、甘油、谷氨酸、d-果糖、L-乳酸和丙酮。這些發(fā)現(xiàn)有助于我們了解局灶性腦缺血/再灌注損傷早期大鼠腦脊液中的生化代謝物變化。張春兵等[14]為探討腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織和血清中的差異表達(dá)代謝物采用Zea Longa改良栓線法構(gòu)建大鼠腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，收集腦組織和血清，采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)方法檢測(cè)代謝物表達(dá)譜。研究共鑒定出105個(gè)血清代謝物以及95個(gè)腦組織代謝物，與假手術(shù)組相比，MCAO組大鼠血清中尿素、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘露糖、尿素、苯丙氨酸以及蛋氨酸代謝物水平顯著升高(P<0.05)，脯氨酸、丙氨酸、谷氨酸、肌醇、絲氨酸、丙三醇、亞油酸以及4-羥基脯氨酸水平顯著降低(P<0.05)，MCAO模型大鼠腦組織丙氨酸、乳酸、尿素、亮氨酸、脯氨酸、纈氨酸、2-羥基異丁酸、異亮氨酸水平顯著升高(P<0.05)。代謝通路分析結(jié)果表明，這些差異代謝物可參與部分氨基酸合成及亞油酸代謝通路、甲烷代謝通路、甘油酯類代謝通路及氨酰-tRNA生物合成等，腦缺血再灌注損傷時(shí)腦組織與血清中存在的差異表達(dá)代謝物，可能參與腦卒中發(fā)病機(jī)制。以上結(jié)論突出了代謝組學(xué)在發(fā)現(xiàn)新的中風(fēng)生物標(biāo)志物方面的潛力，證明了靶向、非靶向代謝組學(xué)分析可能是診斷腦卒中的有效工具，值得進(jìn)一步推廣研究。

代謝組學(xué)的方法也應(yīng)用于對(duì)卒中亞型診斷的研究中。Nelson等[15]采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS)檢測(cè)367例急性腦卒中患者發(fā)病9 h內(nèi)血漿中144種代謝產(chǎn)物，將181例心源性卒中與186例非心源性卒中患者進(jìn)行比較。研究發(fā)現(xiàn)了琥珀酸與心源性卒中及卒中復(fù)發(fā)有關(guān)，揭示了心源性卒中與能量代謝之間的潛在聯(lián)系。

2.2發(fā)病機(jī)制 腦卒中發(fā)病機(jī)制與能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性作用、活性氧失衡等代謝紊亂密切相關(guān)，而代謝組學(xué)可明確生物體不同代謝產(chǎn)物與相應(yīng)生理、病理狀態(tài)的關(guān)系。因此運(yùn)用代謝組學(xué)分析不同樣本代謝物的變化，對(duì)揭示腦卒中的發(fā)病機(jī)制有著至關(guān)重要的意義。黃玉等[16]采用基于超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC/Q-TOF MS)的代謝組學(xué)方法，分析了缺血性腦卒中的生物標(biāo)志物。實(shí)驗(yàn)收集30例缺血性腦卒中患者和17例健康志愿者的血漿樣品，采用主成分分析和正交偏最小二乘判別分析，研究了2組血漿中的代謝物差異，并進(jìn)行了代謝通路分析。結(jié)果表明，患者組血漿中的二氫神經(jīng)鞘氨醇、植物鞘氨醇等物質(zhì)含量升高，谷氨酰胺、焦谷氨酸和2-酮丁酸等物質(zhì)含量降低，即腦卒中不僅影響了鞘脂類和氨基酸的代謝，還對(duì)能量代謝產(chǎn)生了顯著的影響。Zhang等[17]使用UPLC/Q-TOF MS對(duì)腦出血患者進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，以探討腦出血的可能機(jī)制。共有30名腦出血患者和30名對(duì)照受試者參加了該研究。結(jié)果共確定了腦出血患者11種與對(duì)照組相比不同的代謝物，它們與脂肪酸氧化、鞘脂和磷脂代謝的破壞以及炎癥、氧化應(yīng)激和血管病變的增加有關(guān)。對(duì)這些代謝物的進(jìn)一步多元logistic回歸分析表明，左旋肉堿和磷脂酰膽堿具有作為腦出血生物標(biāo)志物的潛力。這為腦出血發(fā)病機(jī)制的研究提供了參考。

2.3腦保護(hù)機(jī)制 有研究表明，中藥提取物可針對(duì)腦缺血性損傷提供直接保護(hù)并充當(dāng)潛在的神經(jīng)保護(hù)劑[18]。代謝組學(xué)可綜合分析生物樣品中的內(nèi)源性小分子，通過多元統(tǒng)計(jì)分析機(jī)體受到刺激或者干擾后內(nèi)源性代謝物的整體變化，是中醫(yī)藥與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相結(jié)合的有力工具，對(duì)中醫(yī)藥治療疾病機(jī)制的研究具有很大的潛力。應(yīng)用代謝組學(xué)的方法研究中藥對(duì)腦卒中的保護(hù)機(jī)制可能是一個(gè)可靠的方法[19]。

Wang等[20]通過基于GC-MS的代謝組學(xué)研究了臨床上常用來治療缺血性腦卒中恢復(fù)期的神經(jīng)保護(hù)劑蒺藜果實(shí)總皂苷(GSTTF)對(duì)MCAO大鼠模型的保護(hù)作用。代謝組學(xué)分析顯示，GSTTF可以通過調(diào)節(jié)包括脂肪酸代謝、氨基酸代謝和碳水化合物代謝在內(nèi)的多種代謝途徑來逆轉(zhuǎn)MCAO引起的血清代謝偏差，起到神經(jīng)保護(hù)作用。

丹參-冰片復(fù)方已廣泛用于治療缺血性腦卒中。丹酚酸B(Sal B)是丹參中含量及生物活性最高的化合物。然而，Sal B-冰片復(fù)方的科學(xué)內(nèi)涵和配伍機(jī)制尚不清楚。Duan等[21]基于UPLC-Q/TOF-MS結(jié)合病理學(xué)的代謝組學(xué)方法，研究Sal B/冰片對(duì)抗MCAO大鼠的缺血性腦卒中。代謝組學(xué)結(jié)果分析表明，Sal B可以通過改善能量代謝、脂質(zhì)代謝、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激來改善MCAO誘導(dǎo)的腦缺血；冰片神經(jīng)保護(hù)作用的增強(qiáng)與Sal B濃度的提高有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)初步闡明了Sal B或Sal B/冰片治療缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，可推動(dòng)丹參-冰片復(fù)方的二次開發(fā)。

3 基于代謝組學(xué)對(duì)中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的研究

利用代謝組學(xué)的方法研究中醫(yī)藥，能夠揭示疾病發(fā)病機(jī)制、復(fù)方及中醫(yī)非藥物療法等治療疾病過程中生物體系內(nèi)所發(fā)生的代謝物及代謝通路的變化，即從中醫(yī)“整體觀念”的角度和中醫(yī)藥多組分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)出發(fā)研究生物體的功能水平，具有廣闊的應(yīng)用前景。

丹參川芎嗪注射液(DSCXQ)是一種常用于治療腦卒中及其相關(guān)后遺癥的中藥制劑。目前對(duì)于DSCXQ對(duì)缺血性腦卒中起到保護(hù)作用的機(jī)制缺乏系統(tǒng)研究。Zhou等[22]基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的代謝組學(xué)分析DSCXQ治療MCAO誘導(dǎo)的缺血性腦卒中的潛在機(jī)制。通過代謝組學(xué)分析，DSCXQ組和模型組之間鑒定出55種差異代謝物，涉及鞘脂代謝、甘油磷脂代謝、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、初級(jí)膽汁酸、泛酸、CoA、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑。這項(xiàng)研究有助于我們了解缺血性腦卒中的代謝變化以及與DSCXQ臨床應(yīng)用相關(guān)的潛在機(jī)制。

徐敉等[23]采用代謝組學(xué)檢測(cè)技術(shù)評(píng)價(jià)血府逐瘀湯對(duì)缺血性腦卒中大鼠的保護(hù)作用并探究其機(jī)制。采用線栓法建立缺血性腦卒中大鼠模型。灌藥2周后采用UPLCQTOF-MS/MS法檢測(cè)各組大鼠血清代謝譜的變化情況，用主成分分析和正交偏最小二乘法判別分析，對(duì)檢測(cè)結(jié)果作多元變量統(tǒng)計(jì)分析，篩選差異代謝物，并作代謝通路分析。結(jié)果顯示，血府逐瘀湯對(duì)缺血性腦卒中保護(hù)作用的代謝途徑主要有氨基酸代謝(丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和色氨酸代謝)、鞘磷脂代謝和丁酸代謝等，即血府逐瘀湯液對(duì)缺血性腦卒中大鼠的治療作用與氨基酸代謝和脂代謝有關(guān)。

補(bǔ)陽還五湯是一種臨床上常用于幫助腦卒中后神經(jīng)功能恢復(fù)的方劑。為了尋找補(bǔ)陽還五湯在中風(fēng)治療和預(yù)后中療效的潛在臨床指標(biāo)，夏鑫華等[24]利用代謝組學(xué)技術(shù)探討其干預(yù)缺血性腦卒中的作用機(jī)制。結(jié)果顯示，與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組的內(nèi)源性代謝物質(zhì)谷氨酰胺、異亮氨酸、次黃嘌呤、前列腺素2、谷氨酸、脯氨酸、焦谷氨酸、纈氨酸、膽固醇和吲哚丙酸在模型組、假手術(shù)組、補(bǔ)陽還五湯組中變化顯著，為缺血性腦卒中的潛在生物標(biāo)志物，即補(bǔ)陽還五湯對(duì)局灶性腦缺血模型的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)內(nèi)源性代謝物變化有關(guān)。

黃連解毒湯(HLJDD)是經(jīng)典的解熱毒方劑。該方中黃芩、梔子等具有多種神經(jīng)保護(hù)作用，已被廣泛用于治療腦卒中等神經(jīng)系統(tǒng)疾病。Zhang等[25]研究了HLJDD的主要成分小檗堿(A)、黃芩苷(B)和茉莉花苷(C)的各種組合對(duì)大鼠MCAO模型的治療效果。使用基于質(zhì)子核磁共振(1H NMR)的代謝組學(xué)，對(duì)A、B和C單獨(dú)及其組合的作用機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，ABC聯(lián)合治療提高了細(xì)胞抗氧化水平，這些抗氧化劑在缺血再灌注期間通過Nrf2信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)清除活性氧，使用其他處理則未觀察到這些保護(hù)作用。以上結(jié)果表明HLJDD中的成分組合比單味草藥表現(xiàn)出更強(qiáng)的效果，也說明代謝組學(xué)方法是一種探索中藥復(fù)方機(jī)制的有效工具。

腦脊液(CSF)中的氨基酸(AA)在腦缺血(CI)中起關(guān)鍵作用。步長(zhǎng)腦心通膠囊(BNC)廣泛用于治療心腦血管疾病。為從系統(tǒng)層面探討B(tài)NC逆轉(zhuǎn)CI的治療效果和藥理機(jī)制，Xu等[26]首次構(gòu)建了含有AA代謝物、關(guān)鍵調(diào)控酶和蛋白質(zhì)的CI氨基酸-蛋白質(zhì)相互作用失衡網(wǎng)絡(luò)。該研究基于MCAO大鼠模型，分析了MCAO后3,6,12和24 h腦脊液中氨基酸的動(dòng)態(tài)水平?；贑I的不平衡網(wǎng)絡(luò)，選擇并使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證了調(diào)節(jié)BNC介導(dǎo)AA生物標(biāo)志物生成的四種關(guān)鍵酶，最后發(fā)現(xiàn)芳香族L-氨基酸脫羧酶(AADC)是BNC起到神經(jīng)保護(hù)作用的靶點(diǎn)之一。本研究為探索腦缺血的機(jī)制研究提供了新的策略，并有助于發(fā)現(xiàn)BNC的潛在作用機(jī)制。

4 小結(jié)與展望

中醫(yī)藥在防治腦卒中方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，且隨著現(xiàn)代中醫(yī)的發(fā)展，干預(yù)方法逐漸豐富，基礎(chǔ)研究日漸深入。對(duì)于中藥干預(yù)原本因出血或缺血產(chǎn)生紊亂的代謝產(chǎn)物的研究，需要通過對(duì)代謝產(chǎn)物的定量分析，為其病因病機(jī)和中藥療效提供物質(zhì)解釋[6]。

目前，代謝組學(xué)已在中醫(yī)藥與腦卒中之間架起了一座堅(jiān)實(shí)的橋梁。然而，代謝組學(xué)在中醫(yī)藥方面的研究仍有很大的發(fā)展空間。首先，需要更新代謝組學(xué)技術(shù)，探索更為精準(zhǔn)的靶點(diǎn)，以對(duì)腦卒中的診斷及用藥有更精確的把握；其次，目前有關(guān)代謝組學(xué)在腦卒中治療中的應(yīng)用主要集中在實(shí)驗(yàn)性研究，相關(guān)的特異性生物學(xué)標(biāo)志物存在與臨床結(jié)合不夠深入、研究數(shù)量不足、機(jī)制闡述不夠全面等諸多問題，這些都是未來代謝組學(xué)技術(shù)的重點(diǎn)研究方向。想要在代謝組的基礎(chǔ)上對(duì)腦卒中甚至于整個(gè)腦病系統(tǒng)的研究有更好的發(fā)展，除了代謝組學(xué)本身的進(jìn)步外，還要求研究者運(yùn)用這一技術(shù)對(duì)腦卒中進(jìn)行全方位的研究，充分發(fā)揮代謝組學(xué)的優(yōu)勢(shì)，使中醫(yī)藥更好地服務(wù)于人類健康事業(yè)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。