腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌多樣性研究

康 舒，厲思雅，楊蓓思，楊曉妍，崔恒林，侯 靖

(江蘇大學 食品與生物工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

我國新疆、西藏、內(nèi)蒙古和青海等地天然鹽(堿)湖以及東部沿海地區(qū)鹽場中嗜鹽古菌的多樣性得到了系統(tǒng)而深入的研究[4-8]。雖然有研究表明食用鹽中含有豐富的嗜鹽古菌[9-11]，但是只有少量的研究報道涉及食用鹽中嗜鹽古菌的多樣性[12-13]。

我國是食用鹽生產(chǎn)大國，原料來源多樣，包括海水、地下鹽礦和內(nèi)陸鹽湖。在鹽的生產(chǎn)過程中，原料中的大部分嗜鹽古菌被捕獲在鹽晶體中并且能夠長期存活。本研究以我國不同產(chǎn)地、不同來源的腌制鹽為研究對象，采用高鹽培養(yǎng)基進行分離純化，基于16S rRNA基因序列判斷菌株分類學地位，并對不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗選取五種不同產(chǎn)地的腌制鹽，樣品基本信息如表1所示。

表1 腌制鹽樣品基本信息

DNA引物：北京諾賽基因組研究中心有限公司；PCR擴增試劑盒：生工生物工程(上海)股份有限公司；DNA marker：寶生物工程(大連)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

FA2004N電子天平：上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C型精密酸度計：上海理達儀器廠；高壓滅菌器：日本Hirayama公司；超凈臺：蘇州市金凈凈化設備科技有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；PCR儀：德國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌株分離培養(yǎng)

菌株分離采用NHM(neutral haloarchaeal medium)培養(yǎng)基[14]。NHM培養(yǎng)基配方如下：酵母提取物(Oxoid)0.05 g/L，魚蛋白胨0.25 g/L，丙酮酸鈉1.0 g/L，KCl 5.4 g/L，CaCl20.29 g/L，NH4Cl 0.27 g/L，MgSO4·7H2O 26.8 g/L，MgCl2·6H2O 23.0 g/L，NaCl 184.0 g/L，K2HPO40.3 g/L，pH 7.0～7.2。培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌器121 ℃滅菌15 min，固體培養(yǎng)基添加20 g/L瓊脂。

無菌條件下稱取適量樣品，溶解于一定體積的150 g/L NaCl溶液中，使NaCl溶液質(zhì)量濃度為300 g/L。吸取0.5 mL樣品于4.5 mL無菌NaCl溶液中，混勻，此為10-1稀釋梯度。重復上述過程2次，得到10-3稀釋梯度樣品。分別吸取每個稀釋梯度樣品0.2 mL，均勻涂布于NHM平板，用保鮮膜包好平板，于37 ℃倒置培養(yǎng)一個月。做三組平行實驗。待平板上菌落生長后，選擇菌落數(shù)在25～250的平板進行計數(shù)。用無菌牙簽挑取單菌落，進行2～3次平板劃線分離，獲得單菌落純培養(yǎng)物。

（3）研究結(jié)果驗證了融資約束的擴大振幅的作用，因此企業(yè)的融資約束程度需要控制在合理范圍內(nèi)，不能盲目地緩解企業(yè)融資約束。同時，實證結(jié)果顯示代理成本的作用機制較為突出，企業(yè)應該完善內(nèi)部治理機制，降低雙重委托代理問題對海外直接投資經(jīng)濟后果的負向影響 （謝偉峰和陳省宏，2016）［15］。只有在公司治理和內(nèi)部控制初見成效后解決融資約束問題，才是企業(yè)持續(xù)健康發(fā)展之根本。由于債權(quán)融資本質(zhì)上也是借貸關(guān)系，對于降低企業(yè)杠桿率沒有幫助，在企業(yè)杠桿率高企的當下，我國需要大力發(fā)展股權(quán)融資這一直接融資渠道，發(fā)揮股權(quán)融資在公司治理機制中的作用。

1.3.2 16S rRNA基因的PCR擴增及測序

采用菌落PCR的方法擴增嗜鹽古菌16S rRNA基因。具體方法如下：取少量菌體于50 μL無菌雙蒸水中，沸水浴10 min裂解細胞，裂解液作為PCR模板。嗜鹽古菌16S rRNA基因PCR擴增的特異性引物為20F(5′-ATTCCGGTTGATCCTGCCGG-3′)和1452R(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCAG-3′)。采用PCR擴增試劑盒配制PCR反應體系。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，反應30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。陽性PCR產(chǎn)物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行雙向測序。

1.3.3 16S rRNA基因序列比對

測得16S rRNA基因序列采用Seqman軟件處理后，與Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net)數(shù)據(jù)庫[15]中16S rRNA基因進行一致性對比，以確定菌株分類學地位。

1.3.4 物種多樣性分析

通常認定與已發(fā)表菌株16S rDNA相似性小于98.65 %為疑似新種[16]，相似性小于95 %為疑似新屬[17]。根據(jù)基于16S rRNA基因序列確定的菌株分類地位，計算Shannon多樣性指數(shù)(H′)、Margalef豐富度指數(shù)(DMg)、Shannon均勻度指數(shù)(E)和Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)(d)[18]，分析不同腌制鹽樣品中嗜鹽古菌多樣性差異。

1.3.5 群落組成差異分析

采用OmicShare Tools的動態(tài)PCoA工具分析不同腌制鹽樣品的群落結(jié)構(gòu)差異，計算Bray-Curtis距離，獲得距離關(guān)系熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌總數(shù)

五種不同產(chǎn)地的腌制鹽樣品經(jīng)稀釋涂布培養(yǎng)，均獲得了較多菌落，表明本實驗設計的分離培養(yǎng)方法對腌制鹽中嗜鹽古菌的分離是有效的。不同腌制鹽樣品中嗜鹽古菌總數(shù)如表2所示。中鹽樣品的嗜鹽古菌總數(shù)最多，達1.88×106CFU/g，其次是小伙子、茶卡樣品，嗜鹽古菌總數(shù)分別為1.70×104和2.85×103CFU/g。嗜鹽古菌總數(shù)最少的是雪天和海灣樣品，分別為4.11×102和2.21×102CFU/g。雪天和海灣樣品均為加碘(KIO3)鹽，因此推測KIO3可能對菌落形成有一定影響。

表2 不同腌制鹽中嗜鹽古菌總數(shù)

2.2 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌鑒定

經(jīng)多次劃線分離獲得單菌落純培養(yǎng)物，通過16S rDNA測序鑒定其分類學地位。相對豐度大于10%的定義為優(yōu)勢類群。表3和表4總結(jié)了不同腌制鹽樣品可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落構(gòu)成及疑似新類群。海灣樣品共分離出48株嗜鹽古菌，分屬于4個屬的10個分類單元，另有4株疑似新種，其中Haloarculamarismortui、Natronomonasmoolapensis、Halobacteriumrubrum為優(yōu)勢類群，占比分別為37.5%、16.7%、12.5%。中鹽樣品共分離出48株嗜鹽古菌，分屬于5個屬的7個分類單元，另有12株疑似新種和12株疑似新屬，其中Natronomonasmoolapensis為優(yōu)勢類群，占比為22.9%。小伙子樣品共分離出93株嗜鹽古菌，分屬于12個屬的23個分類單元，另有14株疑似新種和5株疑似新屬，其中Halolaminasediminis、Halobacteriumrubrum為優(yōu)勢類群，占比分別為21.5%和20.4%。雪天樣品共分離出38株嗜鹽古菌，分屬于2個屬的3個分類單元，另有1株疑似新種，其中Halobacteriumrubrum、Halobacteriumnoricense為優(yōu)勢類群，占比分別為60.5%和31.6%。茶卡樣品共分離出115株嗜鹽古菌，分屬于6個屬的12個分類單元，另有14株疑似新種和2株疑似新屬，其中Halobacteriumnoricense、Halobacteriumrubrum為優(yōu)勢類群，占比分別為34.8%和20.0%。小伙子樣品分離得到的類群最多，雪天樣品分離得到的類群最少。Halobacteriumrubrum在4種腌制鹽樣品中均為優(yōu)勢類群。雪天和茶卡樣品的優(yōu)勢類群一樣，可能是因為兩種鹽同為湖鹽。5種腌制鹽樣品中均分離得到嗜鹽古菌新類群，尤其是中鹽、小伙子和茶卡樣品，暗示著我國腌制鹽樣品中存在大量的嗜鹽古菌新物種。

表3 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落構(gòu)成

表4 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌疑似新類群

續(xù)表4:

2.3 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌多樣性分析

腌制鹽樣品中嗜鹽古菌屬水平相對豐度如圖1所示。海灣樣品優(yōu)勢屬為Haloarcula、Natronomonas和Halobacterium，中鹽樣品優(yōu)勢屬為Natronomonas和Halorientalis，小伙子樣品優(yōu)勢屬為Halobacterium和Halolamina，雪天樣品優(yōu)勢屬為Halobacterium，茶卡樣品優(yōu)勢屬為Halobacterium和Halolamina。比利時學者對26種食用鹽中嗜鹽古菌多樣性進行研究，得出Haloarcula、Halobacterium和Halorubrum是食用鹽中的優(yōu)勢類群。本研究中，Haloarcula為海灣樣品中的優(yōu)勢屬，Halobacterium在4種樣品中均為優(yōu)勢屬。Halorubrum在本研究的5種腌制鹽樣品中均不是優(yōu)勢類群。這些結(jié)果表明，不同的食用鹽中嗜鹽古菌群落組成不盡相同。Haloarcula和Halobacterium屬的嗜鹽古菌在腌制食品中也廣泛存在[19]。隨著腸道菌群研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)Halobacterium和Halorubrum屬的嗜鹽古菌存在于人體腸道內(nèi)，可能是通過食用鹽或腌制食品攝入，但是嗜鹽古菌對人類健康的影響尚未明確。

基于16S rRNA基因序列分析獲得菌株分類地位，對不同腌制鹽樣品物種多樣性水平進行計算，結(jié)果如表5所示。小伙子樣品和中鹽樣品的Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最高，雪天樣品的Shannon多樣性指數(shù)和Margalef豐富度指數(shù)最低，表明小伙子樣品和中鹽樣品具有較高的物種多樣性，雪天樣品物種分布較單一。雪天樣品的Berger-Parker優(yōu)勢度指數(shù)最高，表明其優(yōu)勢物種的優(yōu)勢地位最明顯，這與優(yōu)勢類群分析結(jié)果一致。雪天樣品兩個優(yōu)勢類群總占比高達92.1%，遠高于其他4個樣品的優(yōu)勢類群總占比。多樣性分析結(jié)果表明，由于原料來源及加工方式等不同，不同腌制鹽形成了各自獨特的嗜鹽古菌群落結(jié)構(gòu)。

圖1 腌制鹽樣品中嗜鹽古菌屬水平相對豐度

表5 不同腌制鹽樣品中可培養(yǎng)嗜鹽古菌多樣性指數(shù)

2.4 不同腌制鹽中可培養(yǎng)嗜鹽古菌群落組成差異分析

計算腌制鹽樣品Bray-Curtis距離，關(guān)系熱圖如圖2所示。雪天和茶卡樣品群落組成結(jié)構(gòu)最相似，推測因為雪天鹽和茶卡鹽同為湖鹽。茶卡和小伙子樣品群落組成較相似，其他樣品群落組成結(jié)構(gòu)存在較大差異。雪天和中鹽樣品群落組成差異最大。

圖2 腌制鹽樣品Bray-Curtis距離關(guān)系熱圖

3 結(jié)論

我國是食用鹽生產(chǎn)大國，對腌制鹽中嗜鹽古菌多樣性的研究能夠豐富和完善嗜鹽古菌物種資源，具有潛在的應用價值。研究表明，不同腌制鹽中均蘊藏著豐富的嗜鹽古菌資源，尤其是較高比例的新類群，但是群落組成結(jié)構(gòu)不盡相同。小伙子樣品和中鹽樣品具有較高的物種多樣性，雪天樣品物種分布較單一。群落組成差異分析表明兩種湖鹽群落組成結(jié)構(gòu)最相似。在后期研究中，將結(jié)合高通量測序和培養(yǎng)條件優(yōu)化，進一步系統(tǒng)深入地探究我國腌制鹽中嗜鹽古菌的多樣性。