miR-338-3p靶向MACC1調(diào)節(jié)MEK/ERK信號(hào)通路抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖和EMT

宗振峰 唐國(guó)杰 國(guó)玉

非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是一種難治性惡性肺癌，在全球范圍內(nèi)被列為癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1-2]。NSCLC的特征在于多階段進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和高死亡率[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，NSCLC晚期患者的五年生存率低于15%[4]。因此，迫切需要研究NSCLC 發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制。MicroRNA(miRNA)是長(zhǎng)度約為 18～25個(gè)核苷酸的小型內(nèi)源性非編碼 RNA，其通過(guò)與靶標(biāo) mRNA 的 3′-非翻譯區(qū) (3′-UTR) 結(jié)合，對(duì)人類基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮重要作用[5]。MiR-338-3p 是位于染色體17q25上的miRNA，已有研究表明其在NSCLC組織和細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-338-3p可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲[6]。通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p與MACC1 3′-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，但miR-338-3p能否通過(guò)調(diào)控MACC1來(lái)影響NSCLC細(xì)胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)尚不清楚。因此，本研究主要探究miR-338-3p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和EMT的影響，并探討相關(guān)作用機(jī)制。

資料與方法

一、 組織和細(xì)胞系

收集2019年6月-2021年6月在本院胸外科接受手術(shù)治療的NSCLC患者的癌組織以及癌旁組織共52對(duì)，進(jìn)行速凍，液氮保存。本研究中涉及人類受試者的所有程序均符合赫爾辛基宣言(2013年修訂)。所有患者均簽署了知情同意書，本研究獲得了本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(2019-00403)。

人正常支氣管上皮細(xì)胞系HBEpiC及人NSCLC細(xì)胞系(包括A549、H1975、H1299和H292)均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫(kù)。

二、主要試劑與儀器

miR-338-3p模擬物(miR-338-3p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、MACC1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-MACC1)及其陰性對(duì)照(pcDNA)均購(gòu)自百奧邁科生物技術(shù)有限公司；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購(gòu)自上海意杰生物科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購(gòu)自日本Takara公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、E-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-ERK1/2、ERK1/2、β-actin兔多克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司；N-cadherin、Snail、Slug、p-MEK、MEK兔多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

三、 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將HBEpiC、A549、H1975、H1299、H292細(xì)胞置于補(bǔ)充有10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分為：空白組(正常培養(yǎng)的A549細(xì)胞)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-338-3p mimics組(轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimics)、pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA)、MACC1組(轉(zhuǎn)染pcDNA-MACC1)、miR-338-3p mimics+pcDNA組(共轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimics和pcDNA)、miR-338-3p mimics+MACC1組(共轉(zhuǎn)染miR-338-3p mimics和pcDNA-MACC1)，于37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

四、 qRT-PCR檢測(cè)NSCLC組織及細(xì)胞中miR-338-3p、MACC1 mRNA表達(dá)水平

使用TRIzol試劑從組織和細(xì)胞中提取總RNA，利用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒對(duì)RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，通過(guò)SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)2-ΔΔCt法來(lái)評(píng)估m(xù)iR-338-3p、MACC1 mRNA的表達(dá)。引物為：U6正向：5′-GCACCTTAGGCTGAACA-3′，反向：5′ -AGCTTATGCCGAGCTCTTGT-3′；miR-338-3p正向：5′-TGAGGGCAAGATGACAAAGA-3′，反向：5′-GCCCTTGCACTTGATGGTAT-3′；GAPDH正向：5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，反向：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′；MACC1正向：5′ -GATGAACTTGATGTGCATCA GTTACTTAG-3，反向：5′-GTCGTGTAGTAGGATCTGGTCAGAGTTATG-3′。

五、 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將各組細(xì)胞以2×104個(gè)/孔的密度接種在96孔板中，分別在0、24、48h時(shí)向每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，37℃孵育2h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值。

六、 western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞中的總蛋白。將等量的蛋白質(zhì)經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，將膜與一抗MACC1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2、β-actin在4℃下孵育過(guò)夜，然后與二抗在室溫下孵育1h。加入ECL顯影，ImageJ 軟件用于分析蛋白條帶灰度值。

七、 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

構(gòu)建MACC1的野生型(WT-MACC1)與突變型3′UTR區(qū)質(zhì)粒(MUT-MACC1)。利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑將WT-MACC1和MUT-MACC1分別與miR-NC或miR-338-3p mimics共轉(zhuǎn)染于A549細(xì)胞，48h后，檢測(cè)熒光素酶活性。

八、 統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

一、 miR-338-3p在NSCLC組織及NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)

miR-338-3p在NSCLC組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織(P<0.05)(見(jiàn)表1)；與HBEpiC細(xì)胞比較，A549、H1975、H1299、H292細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)顯著降低，且A549細(xì)胞中miR-338-3p表達(dá)最低，因此，選用A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(見(jiàn)表2)。

表1 miR-338-3p在NSCLC組織中的表達(dá)

表2 miR-338-3p在NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)

二、 各組細(xì)胞中miR-338-3p、MACC1 mRNA及蛋白表達(dá)比較

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組miR-338-3p表達(dá)升高，MACC1 mRNA及蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組miR-338-3p表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)，MACC1 mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組miR-338-3p表達(dá)無(wú)顯著變化(P>0.05)，MACC1 mRNA及蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(見(jiàn)圖1、表3)。

圖1 western blot檢測(cè)MACC1蛋白表達(dá)

三、 各組A549細(xì)胞增殖能力比較

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組OD450值(24、48h)降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組OD450值(24、48)升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組OD450值(24、48h)升高(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

四、 各組A549細(xì)胞EMT比較

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組E-cadherin蛋白表達(dá)升高，Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(見(jiàn)圖2、表5)。

圖2 western blot檢測(cè)E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達(dá)

五、各組細(xì)胞對(duì)MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組、miR-NC組比較，miR-338-3p mimics組p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)；與空白組、pcDNA組比較，MACC1組p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與miR-338-3p mimics組、miR-338-3p mimics+pcDNA組比較，miR-338-3p mimics+MACC1組p-MEK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表6)。

圖3 western blot檢測(cè)p-MEK、MEK、p-ERK1/2、ERK1/2蛋白表達(dá)

表6 各組細(xì)胞MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)表達(dá)情況

六、 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-338-3p與MACC1的結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖4。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，與miR-NC和WT-MACC1共轉(zhuǎn)染組比較，miR-338-3p mimifile:///C:/Users/Administrator/Desktop/%E6%95%B0%E6%8D%AE%E5%8A%A0%E5%B7%A5/LCFK202211/LCFK202211.ebook/images/bbb6d9770084729dc4e7c9e162003b92.jpgcs和WT-MACC1共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性降低(P<0.05)；與miR-NC和MUT-MACC1共轉(zhuǎn)染組比較，miR-338-3p mimics和MUT-MACC1共轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性無(wú)顯著性變化(P<0.05)(見(jiàn)表7)。

表7 A549細(xì)胞中熒光素酶活性比較

圖4 Targetscan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-338-3p與MACC1的結(jié)合位點(diǎn)

討 論

NSCLC是最常見(jiàn)的肺癌，盡管NSCLC的診斷和治療水平不斷提升，但死亡率仍然很高[7]。因此，探究NSCLC發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制并確定其診斷和治療的基因靶標(biāo)至關(guān)重要。眾所周知，miRNA參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、凋亡等[8]。越來(lái)越多的研究表明，失調(diào)的miRNA 通過(guò)調(diào)節(jié)癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲或EMT，在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[9]。白如雪等[10]報(bào)道m(xù)iR-338-3p在胃癌組織中低表達(dá)，其低表達(dá)與胃癌TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)；謝景臣等[11]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-338-3p能夠抑制A549細(xì)胞的增殖和侵襲；孫玉成等[12]表明抑制miR-338-3p表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲。本研究結(jié)果顯示，miR-338-3p在NSCLC組織和A549、H1975、H1299、H292細(xì)胞中低表達(dá)，且miR-338-3p在A549細(xì)胞中表達(dá)量最低，選擇miR-338-3p表達(dá)量最低的細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)miR-338-3p才更具有研究意義，因此，選用A549細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。EMT是腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移侵襲的有效方式之一，其主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，同時(shí)伴隨著上皮表型標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)的減少，以及間質(zhì)表型標(biāo)志蛋白Vimentin、N-cadherin、β-catenin等表達(dá)的增加[13]。EMT還受多種信號(hào)因子的調(diào)控，如Snail、Slug是E-cadherin的轉(zhuǎn)錄抑制因子，在EMT的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-338-3p可明顯上調(diào)A549細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Vimentin、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug蛋白表達(dá)水平，提示過(guò)表達(dá)miR-338-3p可抑制A549細(xì)胞EMT。本研究還發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)miR-338-3p可抑制A549細(xì)胞增殖，以上結(jié)果表明miR-338-3p可作為抑癌基因抑制NSCLC的增殖和EMT。

絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(mitogen extracellular signal regulated kinase，MEK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)通路的激活與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)[15]。據(jù)報(bào)道，miR-209通過(guò)下調(diào)MEK/ERK信號(hào)通路抑制膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖[16]；曲美替尼通過(guò)抑制MEK/ERK信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞的增殖[17]；LncRNA HOTTIP通過(guò)激活MEK/ERK通路促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖、侵襲和EMT[18]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-338-3p可顯著抑制MEK/ERK通路關(guān)鍵蛋白MEK、ERK1/2的磷酸化水平，提示過(guò)表達(dá)miR-338-3p對(duì)NSCLC細(xì)胞增殖和EMT的抑制作用可能與MEK/ERK通路有關(guān)。

miRNA可以通過(guò)直接靶向mRNA來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[19]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，證實(shí)MACC1為miR-338-3p的靶基因。MACC1是癌癥發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，已有研究表明MACC1在NSCLC細(xì)胞中高表達(dá)，過(guò)表達(dá)MACC1可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、遷移與侵襲[20]；敲降結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的MACC1可上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)Vimentin表達(dá)，進(jìn)而抑制EMT過(guò)程[21]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)MACC1可顯著促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖、EMT以及p-MEK、p-ERK1/2的表達(dá)，而上調(diào)miR-338-3p表達(dá)可顯著抑制MACC1蛋白表達(dá)，推測(cè)過(guò)表達(dá)miR-338-3p可能靶向MACC1調(diào)節(jié)MEK/ERK信號(hào)通路抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和EMT。為了驗(yàn)證該推測(cè)，本研究設(shè)置了回復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)A549細(xì)胞中MACC1的表達(dá)，顯著降低了miR-338-3p mimics對(duì)A549細(xì)胞增殖、EMT及p-MEK、p-ERK1/2表達(dá)的抑制作用，以上結(jié)果表明過(guò)表達(dá)miR-338-3p通過(guò)靶向抑制MACC1表達(dá)，阻斷MEK/ERK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和EMT。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-338-3p通過(guò)靶向抑制MACC1表達(dá)，阻斷MEK/ERK信號(hào)通路的激活，進(jìn)而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和EMT。miR-338-3p可能作為NSCLC治療的潛在分子標(biāo)志物，為NSCLC的治療提供理論參考依據(jù)。