宏基因組下一代測序技術(shù)在肺部感染中的臨床應(yīng)用

許慧芬 韓開宇

由細菌、病毒或真菌等病原體引起的肺部感染在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，是導(dǎo)致生命死亡的主要原因之一[1-2]。作為一種呼吸道感染性疾病，肺部感染可引起多種并發(fā)癥[3]，特別是在基礎(chǔ)疾病多、免疫功能差的患者中[4]，將極大的影響患者的預(yù)后[5]。由于患病環(huán)境、患病人群、疾病嚴(yán)重程度、檢測技術(shù)的不同，致病微生物也不盡相同[6]。同時多種多重耐藥菌以及新型病原體的大量出現(xiàn)，也給臨床醫(yī)生在抗菌治療時帶來了挑戰(zhàn)[7]。因此盡早識別微生物病原體、確保精準(zhǔn)抗生素治療是至關(guān)重要的[8]。然而目前明確病原體的傳統(tǒng)檢測方法，耗費時間長且檢出率低下[9]，在我國有近半數(shù)肺部感染患者的病因診斷尚不明確[6]，僅能在 30%～40% 的 CAP 患者中識別病原體[10-11]。新型的病原體診斷工具mNGS也因此備受青睞。mNGS 通過對提取的 DNA或RNA 進行直接測序，可以對樣本中存在的幾乎所有病原體進行無偏移檢測[12-13]。理論上mNGS不僅可以檢測臨床樣本中的任何微生物[14]，而且可以區(qū)分病原微生物和背景共生菌[15]。 mNGS以其快速且精準(zhǔn)的檢測優(yōu)勢，可幫助臨床迅速和準(zhǔn)確的控制感染[16-17]。

mNGS的原理和應(yīng)用

作為一種強大的病原體檢測工具，mNGS能在短時間內(nèi)(約16～24 h)一次性完成對上萬種病原體的檢測，在輔助判斷病原的同時，可獲取樣本中菌群的分布與占比信息。其檢測原理是將樣本中提取的核酸進行片段化和測序接頭連接后進行測序，獲得樣本中的核酸序列信息，再通過與微生物專用數(shù)據(jù)庫進行比對分析，獲得宏基因組中包含的微生物的檢出列表。其測序過程主要包括兩個部分：濕實驗和干實驗。濕實驗操作包括樣品預(yù)處理、核酸提取、文庫構(gòu)建和測序。干實驗生物信息學(xué)分析包括數(shù)據(jù)質(zhì)量控制、人類序列去除、微生物物種序列的比對以及耐藥性或毒力基因分析[18-19]。

mNGS現(xiàn)已應(yīng)用于超過9個人體功能系統(tǒng)感染性疾病的病原體檢測，特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和局灶組織感染中[18, 20-25]。mNGS可以從各個系統(tǒng)不同臨床樣本中直接鑒定病原體，其準(zhǔn)確性和靈敏度均優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)[26]，且基本不受先前抗生素暴露的影響[21]，特別是對于新型的、罕見的、難以培養(yǎng)的病原體(如分枝桿菌、厭氧菌、奴卡菌等)[27]。此外，在病情危重、免疫力低下和混合病原體感染的患者中[28-31]，mNGS也發(fā)揮著極大的優(yōu)勢。當(dāng)前mNGS 還可以為進化追蹤、預(yù)測抗生素耐藥性和證實毒力因子的存在提供基因信息，并可根據(jù)序列數(shù)推斷相關(guān)病原體的豐度[32-33]。總之，mNGS在感染性疾病的臨床應(yīng)用中顯示出巨大潛力。

mNGS在肺部感染病原體檢出中的應(yīng)用

一、細菌檢出

有研究發(fā)現(xiàn)在140例疑似肺部感染的患者中，mNGS診斷的敏感性遠高于常規(guī)培養(yǎng)，而特異性卻相反，mNGS檢出最多的革蘭氏陽性細菌是微小微單胞菌、肺炎鏈球菌、糞腸球菌。檢出最多的革蘭氏陰性菌是流感嗜血桿菌，銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌[34]；在329名重癥社區(qū)獲得性肺炎患者中，mNGS的細菌病原體檢出陽性率要高于常規(guī)檢測，mNGS檢出最多的細菌是肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌[35]；在72例呼吸機相關(guān)肺炎患者中，mNGS檢測陽性樣本的百分比也顯著高于常規(guī)檢測，特別是鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌[36]。同樣有研究顯示mNGS在檢測肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和普雷沃氏菌方面的陽性率顯著升高[28]。但另有研究發(fā)現(xiàn)，與mNGS相比，常規(guī)檢測能夠識別出大多數(shù)與細菌相關(guān)的肺炎[37]。這提示我們臨床醫(yī)生，mNGS的細菌病原體檢出陽性率和敏感性要優(yōu)于常規(guī)檢測，且mNGS不容易受到先前抗生素使用的影響[21, 38]。但是在肺部感染常見病原體的檢出中，mNGS是常規(guī)檢測的補充手段，并不能完全取代傳統(tǒng)培養(yǎng)。

二、真菌檢出

多項研究表明，mNGS在真菌病原體檢出方面發(fā)揮著巨大的優(yōu)勢。在疑似肺部真菌感染的106例患者中，mNGS在診斷肺部真菌感染方面的敏感性顯著高于常規(guī)檢測[39]。另一項研究中，常規(guī)培養(yǎng)僅在 1/21 樣本中鑒定出真菌性肺炎，而mNGS 卻在 19/21 樣本中鑒定出真菌性肺炎[40]。同樣在13例肺孢子蟲肺炎中，通過 mNGS 在所有患者中均檢測到肺孢子菌，而常規(guī)檢測僅在 5/13 樣本中檢測到肺孢子菌[41]。但是也有研究提出不同觀點，即mNGS在真菌檢出方面與常規(guī)檢測相比，無統(tǒng)計學(xué)差異[21,28]。更有研究顯示對于某些真菌病原體，常規(guī)檢測陽性率要高于mNGS，如白色念珠菌和熱帶念珠菌[36]。與之相似，有研究提出mNGS在隱球菌檢測方面敏感性低于血清抗原檢測[21]；造成這些差異結(jié)果的原因，可能與不同研究中患者病情嚴(yán)重程度、患病環(huán)境、采樣標(biāo)本不同相關(guān)?？傊?，對于常規(guī)實驗室檢測難以發(fā)現(xiàn)和明確的真菌感染，mNGS技術(shù)是臨床醫(yī)生的推薦選擇。

三、病毒檢出

目前mNGS是發(fā)現(xiàn)病毒的首選方法，特別是對于新出現(xiàn)的引起肺炎的病毒(如 SARS、MERS和H7N9)，mNGS有助于追蹤和控制爆發(fā)[42]。此外mNGS還具有識別常規(guī)檢測方法難以檢測到的額外病毒的潛力[43]。在一項171 名肺部感染患者的研究中，mNGS檢出病毒60例，最常檢測到的病毒是人皰疹病毒5型、人皰疹病毒 4 型、人細小病毒 B19等，而常規(guī)檢測方法幾乎對所有病毒都呈陰性[29]。另一項對72名肺部感染患者的研究中，mNGS檢出病毒30例，同樣常規(guī)檢測方法、病毒檢測均為陰性[36]。但是，也有研究表明對于常見呼吸道病毒的檢出，mNGS的敏感性低于PCR，如甲型流感病毒和鼻病毒[43]。造成這一結(jié)果的原因可能是在測序過程中，mNGS僅進行了DNA測序，故只檢測到DNA病毒，而PCR法可以檢測RNA病毒，如甲型流感病毒和乙型流感病毒[44]，故在一定程度上影響了病毒的檢出。大量研究已證實，mNGS的診斷效能，優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。如今，mNGS通過測序獲得的病原體信息不僅可以指導(dǎo)臨床抗病毒藥物的使用(包括藥物的啟動、升級、降級或停藥)，而且可以通過使用mNGS技術(shù)評估嚴(yán)重下呼吸道病毒感染患者的預(yù)后[45]。

四、罕見及新型病原體的檢出

mNGS因其無偏移的檢測優(yōu)勢，在不明原因肺炎的病因診斷中起著至關(guān)重要的作用，尤其是對于新型的、罕見的以及傳統(tǒng)檢測方法難以培養(yǎng)的病原體[21, 46-47]。在一項納入159名肺部感染患者的大規(guī)模多中心前瞻性研究中，mNGS在識別引起肺部感染，難以培養(yǎng)的、非典型微生物方面(如軍團菌、肺炎支原體、鸚鵡熱衣原體、非結(jié)核分枝桿菌)發(fā)揮了重要價值[48]。眾所周知，由于苛刻的生長要求、有限的檢測方法和非特異性臨床表現(xiàn)，診斷軍團菌肺炎具有挑戰(zhàn)性，而mNGS檢測提高了軍團菌的檢出率，極大地改善了因軍團菌所致重癥肺炎患者的預(yù)后[49]。mNGS技術(shù)不僅打開了認(rèn)識病原體的大門，而且為臨床醫(yī)生了解微生物的特點和指導(dǎo)用藥，也提供了巨大的幫助。例如，通過mNGS技術(shù)可以檢測到鸚鵡熱衣原體、奴卡菌等罕見病原體，通過總結(jié)患者的臨床特征、檢驗和檢查結(jié)果、影像學(xué)特征、治療和預(yù)后等，使臨床醫(yī)生更好地了解疾病，從而日后可早期識別疾病，減少不必要的抗生素使用，縮短病程[27, 50]。

mNGS在免疫功能低下患者群體中的應(yīng)用

有研究發(fā)現(xiàn)在免疫功能受損的社區(qū)獲得性肺炎患者BALF樣本中，常規(guī)檢測方法在 6/13樣品中鑒定出病原體，而mNGS 在12/13樣品中鑒定出病原體。且研究發(fā)現(xiàn)肺孢子菌和巨細胞病毒是這13名患者中最常見的病原體[51]；當(dāng)mNGS應(yīng)用于造血干細胞移植合并急性呼吸道疾病患者的BALF時，研究發(fā)現(xiàn)對于某些呼吸道微生物(如呼吸道合胞病毒、嗜麥芽窄食單胞菌、人皰疹病毒6型、巨細胞病毒等)，mNGS的診斷敏感性可達100%[52]；不僅如此，通過mNGS技術(shù)，臨床醫(yī)生對免疫功能受損患者的致病微生物譜有了新的認(rèn)識。例如，研究發(fā)現(xiàn)，在免疫功能受損患者群體中，肺孢子菌和巨細胞病毒的感染率更高，而肺炎支原體感染率顯著降低，同時存在著更多潛在致病病原體感染，更多混合病原體感染[53]。與前述研究相一致，對免疫功能低下和免疫功能正常的重癥社區(qū)獲得性肺炎患者進行BALF的mNGS檢測，研究發(fā)現(xiàn)在免疫功能低下的SCAP患者中，檢出了更多的肺孢子菌、白色念珠菌和人類皰疹病毒5型，同時發(fā)現(xiàn)了更多的混合病原體感染[54]。此外，利用mNGS還可以揭示中國大陸肺部感染ICU入院患者的抗生素耐藥菌譜[55]。一直以來，免疫功能受損肺炎患者的死亡率高于免疫功能正常肺炎患者[12]。上述研究均表明，mNGS在免疫功能低下患者的病原體檢出中具有優(yōu)勢，mNGS可以幫助臨床醫(yī)生認(rèn)識病原譜，指導(dǎo)疾病的治療，改善患者預(yù)后，降低死亡率。

肺部感染患者不同樣本的比較

在現(xiàn)有研究中，為明確肺部感染病原體，mNGS可采用的樣本有BALF、肺組織、胸水、痰液、咽拭子、外周血等，不同樣本類型病原體檢出的敏感性和特異性略有差異。針對BALF樣本，Chen等人通過對235名疑似肺部感染患者的BALF進行mNGS檢測，研究發(fā)現(xiàn)mNGS的敏感性和特異性分別為88.89%和14.86%。排除罕見病原體后，其敏感性降低至73.33%，特異性提高至41.71%[56]；針對肺組織樣本，Li等人在20例肺部感染患者的肺組織中進行mNGS檢測，研究發(fā)現(xiàn)mNGS的敏感性和特異性分別為100.0%和 76.5%[16, 28]；同樣Guo等人也進行了肺組織樣本的mNGS檢測，研究發(fā)現(xiàn)，與培養(yǎng)相比，mNGS的敏感性為83.3%，特異性為79.1%。值得一提的是，該研究首次建立了在肺組織樣本中基于Illumina平臺同時檢測病原體和癌癥的管道[57]；將BALF與肺組織樣本對比，研究發(fā)現(xiàn)在肺組織中mNGS的特異性高于BALF，但BALF的敏感性更高[58]；將BALF與痰液標(biāo)本對比，研究發(fā)現(xiàn)兩樣本對于病原體檢出的敏感性和特異性無顯著差異，且在檢測結(jié)果中具有顯著一致性[59]；將BALF與血液標(biāo)本對比，研究發(fā)現(xiàn)對于細菌和真菌檢測，BALF比血液更敏感，但兩者的特異性卻沒有顯著差異[60]。也有研究表明，mNGS在血液中檢測到的病毒總體上比 BALF多，但是在某些患者的BALF中，mNGS檢測到某種特定病毒的序列卻比血液多，如EB病毒、巨細胞病毒等[61-62]；將經(jīng)皮肺活檢(TBLB)、支氣管刷檢(BB)、BALF三種樣本對比，研究發(fā)現(xiàn)不同樣本類型之間敏感性差異無統(tǒng)計學(xué)意義，然而mNGS在TBLB 標(biāo)本中具有最高的特異性，其次是 BB，最后是 BALF，綜合敏感性和特異性，BB標(biāo)本優(yōu)于TBLB和BALF標(biāo)本[40]；將BALF、痰、血漿、鼻咽拭子等多樣本進行mNGS檢測比較，研究發(fā)現(xiàn)BALF和痰液是檢測病原體最有效的樣本類型，陽性率為75%，而外周血樣本只有35%的陽性結(jié)果[53]。

綜上，結(jié)合各項研究結(jié)果以及我們的臨床經(jīng)驗，mNGS在呼吸道不同樣本類型之間敏感性幾乎沒有差異。在實際臨床工作中，BALF在重癥肺炎患者床頭支氣管鏡下容易獲取，且代表了肺泡水平的成分，更適用于干咳或無咳嗽咳痰的肺部感染患者[63]。但是對于患者來講，他們很難接受侵入性操作，甚至?xí)虼水a(chǎn)生緊張焦慮的心情。同樣肺組織標(biāo)本的獲取也需要經(jīng)過有創(chuàng)操作，其更適用于外周肺部感染難以明確病原體的患者。相比之下痰液和咽拭子臨床容易獲取，而且病人容易接受，但是痰和咽拭子標(biāo)本極易受到污染，對于鑒定病原體是致病菌還是污染菌有一定難度。而對于血液標(biāo)本，我們需要認(rèn)識到血液中的病原體DNA可能反映了肺部感染，也可能是來自身體其他部位的感染[64]。這均提示我們臨床醫(yī)生，在面對肺部感染的患者時，要根據(jù)患者的臨床特點，感染病灶位置、以及病情嚴(yán)重程度等綜合考慮，個體化選取最佳的采樣標(biāo)本。

mNGS的局限性

目前，mNGS在肺部感染臨床實際應(yīng)用中，仍存在一些問題：首先，肺部本身不是無菌環(huán)境，在樣本采集過程中也不能保證絕對無菌，而mNGS 不僅可以檢測到感染病原體，還反映了正常的微生物菌、定植菌和樣本污染菌，這給mNGS 的病原體解釋帶來了挑戰(zhàn)。其次RNA測序難以進行，RNA檢測可以同時識別死亡和存活的病原體，并可以區(qū)分過去和當(dāng)前的感染，然而人源RNA的豐度和復(fù)雜度較DNA高，并且容易降解，這對樣品的運輸和儲存提出了更高的要求，也因此限制了RNA的檢出[65]。最后，mNGS測序成本較高，且尚未納入醫(yī)保范圍之內(nèi)，患者個人承擔(dān)費用較高，在一定程度上限制了mNGS的推廣使用。

結(jié) 語

綜上所述，mNGS在肺部感染病原體檢測中發(fā)揮著巨大的優(yōu)勢，其對細菌、真菌、病毒等病原體的檢出具有診斷價值，甚至可以檢出新型的、罕見的、難以培養(yǎng)的病原體，尤其適用于免疫功能低下的患者群體。針對肺部感染患者應(yīng)采集的不同臨床樣本，臨床醫(yī)生需結(jié)合患者的實際情況進行選擇。目前mNGS技術(shù)尚不能完全取代傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，但可作為強大的補充手段發(fā)揮優(yōu)勢。未來隨著技術(shù)的不斷完善，mNGS有望在臨床工作中發(fā)揮更大的價值。