線粒體相關內質網膜在腦卒中后認知障礙中作用的研究進展*

陳淑穎， 白艷杰， 陳麗敏， 丁志敏， 王 巖， 張雍闖， 李曉曉

（1河南中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，河南 鄭州 450046；2河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院康復中心，河南 鄭州 450099）

腦卒中后認知障礙（post-stroke cognitive impairment，PSCI）常出現記憶、學習等多個認知域的損傷，大約有1/3 的腦卒中患者會出現不同程度的認知障礙，對康復進程和生活質量均造成較大影響［1-2］。腦卒中后的繼發(fā)性改變十分復雜，研究表明，腦卒中缺血缺氧造成的炎癥反應、鈣紊亂、線粒體功能障礙等病理過程的激活是啟動細胞凋亡、自噬等死亡機制，加重腦神經元損傷，導致不同程度認知障礙的重要因素［3］。其中，線粒體外膜在細胞凋亡中有關鍵作用：活化的Bax、Bcl-2 拮抗因子等促凋亡蛋白能聚集在線粒體外膜上改變其通透性，并促進線粒體細胞色素C（cytochrome C，CytC）等凋亡誘導物的釋放［4］。此外，研究表明，線粒體相關內質網膜（mitochondriaassociated endoplasmic reticulum membrane，MAM）在維持細胞穩(wěn)態(tài)中具有重要作用，線粒體外膜和內質網之間通過Ca2+、需肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）、磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸簇分選蛋白2（phosphofurin acidic cluster sorting protein 2，PACS2）等參與細胞凋亡信號傳導，進而影響細胞的命運［5］。下調 MAM 相關蛋白 PACS2 可使海馬神經元和星形膠質細胞變性而出現認知障礙，并且在癡呆患者腦組織中觀察到MAM介質表達減少［6］。同時出于腦組織的高能量需求，神經元常因為線粒體功能障礙而加重損傷，由于MAM 支持線粒體質量控制，因而MAM 還可能通過控制線粒體質量影響神經功能［7］。因此，調控MAM 或許是避免腦卒中后病理過程加劇，保護神經元免受損傷的有效途徑?，F主要針對MAM在PSCI中的具體作用展開綜述，以期為臨床靶向治療提供參考資料。

1 線粒體與內質網相互作用構成MAM

MAM亦稱線粒體-內質網結構偶聯，是線粒體和內質網的直接接觸位點，是線粒體外膜與內質網在物理結構和生物化學上相互通信的一個結構域。在物理結構方面，MAM 通過連接物決定其接觸位點的橫向范圍和間隙距離，其中蛋白的種類可以限制線粒體與內質網的接觸范圍，因此在不同組織中，接觸區(qū)的范圍是變化的［8］。MAM 可以招募多種蛋白參與維持其基本結構，包括線粒體融合蛋白、肌醇1，4，5-三磷酸受體（inositol 1，4，5-triphosphate receptors，IP3Rs）、電壓依賴性陰離子通道（voltage-dependent anion channels，VDAC）、葡萄糖調節(jié)蛋白75（glucose-regulated protein 75，Grp75）、線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，Fis1）、B 細胞受體相關蛋白31（B-cell receptor-associated protein 31，BAP31）、蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白51（protein tyrosine phosphatase-interacting protein 51，PTPIP51）和囊泡相關膜蛋白相關蛋白B（vesicle-associated membrane proteinassociated protein B，VAPB）等［9］。MAM 通過招募不同的膜蛋白及調控不同的信號傳導來維持線粒體及內質網等細胞器的正常功能，從而影響細胞的命運。

在生物功能方面，線粒體與內質網之間的串擾主要與各種細胞信號傳導有關，包括脂質生物合成和轉運、鈣信號轉導、線粒體動力學等，通過接觸點的信號變化影響MAM 的功能［10］。線粒體與內質網之間的連接物是MAM 發(fā)揮各種生物功能的基本支架，這些膜蛋白決定了線粒體和內質網的動態(tài)結構及功能。如MAM 招募線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）、發(fā)動蛋白相關蛋白1（dynamin-related protein 1，Drp1）等調節(jié)因子，通過內質網膜收縮線粒體分裂位點等物理操作調節(jié)線粒體分裂/融合以維持正常的線粒體形態(tài)結構［11］。哺乳動物細胞在MAM還具有復雜的蛋白復合物，在控制細胞穩(wěn)態(tài)平衡中具有重要作用。其中Mfn2-Mfn1/2、IP3Rs-Grp75-VDAC、VAPB-PTPIP51 及 Fis1-BAP31 等蛋白復合物相互作用，促進或抑制MAM 的連接，介導MAM 間的通信，它們對MAM 結構的復雜調節(jié)作用在各種神經系統(tǒng)疾病中有重要影響［5］。

2 MAM參與PSCI病理進程的發(fā)生發(fā)展

2.1 調控脂質代謝 在真核細胞中，磷脂主要在線粒體內膜和內質網中合成，維持膜正常的脂質代謝合成與轉運對維持細胞正常的活性至關重要，而MAM就是促進脂質正常轉運的一個關鍵平臺［12-13］。大腦是脂質含量最豐富的器官之一，研究表明隨著年齡的增長，磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿在大腦中的水平隨著年齡的增長而緩慢下降，對癡呆患者大腦進行檢查時顯示病變區(qū)域脂質提取物中的磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺和磷脂酰膽堿含量較高或僅有輕度減少［14］。李昊［15］在檢驗患者血清時，觀察到PSCI患者血清總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇水平均較高，證實高脂是PSCI的獨立危險因素，這進一步證實了脂質代謝異常極有可能是PSCI的發(fā)病機制之一。在給年幼和老年大鼠連續(xù)喂食高脂肪/高膽固醇飲食后，不僅顯示出海馬tau蛋白磷酸化異常，其空間工作記憶也均出現較差的表現［16］。而臨床應用抗脂質代謝異常藥物能夠減輕認知障礙，如黃腐酚及其兩種氫化衍生物α，β-二氫黃腐酚和四氫黃腐酚治療就可改善高脂誘導的空間學習和記憶缺陷［17］。MAM富含幾種脂質轉移蛋白和生物合成酶，包括膽固醇?；D移酶/甾醇O-?；D移酶1、二?；视蚈-酰基轉移酶2等，若MAM功能障礙，很容易導致脂質代謝異常；在癡呆患者腦組織中就曾檢測到脂質異常并伴有MAM 錨定蛋白膽固醇?；D移酶/甾醇O-?；D移酶1 含量及活性的上調［18-19］。由此可見，脂質代謝異常能夠誘發(fā)PSCI，而MAM 介導的脂質合成和轉運在維持細胞正常生命活動中發(fā)揮重要作用，因此MAM功能異常有可能是PSCI的發(fā)病機制之一。

2.2 調控鈣平衡 細胞器之間常通過Ca2+信號交流，而鈣平衡對于維持細胞正常的能量代謝及生命活動至關重要［20］。MAM 中存在高鈣域，其通過IP3Rs-Grp75-VDAC 復合物和 sigma-1 受體（sigma-1 receptor，Sig-1R）等調控著鈣釋放和鈣轉運，線粒體將它們解碼為特定的信號以調節(jié)細胞新陳代謝和凋亡等基本功能［21］。Chalmers等［22］發(fā)現，在腦部缺血損傷6 h 后小鼠腦組織中鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶T286 殘基的磷酸化增加，相反抑制鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶的自主活性則可以防止海馬缺血性損傷，對海馬具有神經保護作用。此外，一項隨機對照實驗顯示PSCI 模型大鼠Ca2+濃度升高，電針可以通過下調Ca2+濃度，使腦梗死體積減少及空間學習和記憶能力增強［23］。這也進一步證實了上述觀點，鈣超載誘發(fā)的腦神經元損傷可能是導致PSCI 的重要因素。Sig-1R 是MAM 的重要組成蛋白，并在線粒體應激條件下與IP3Rs 結合，從而促進Ca2+轉移并調節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)［5］。Li 等［24］通過免疫熒光實驗檢測顯示，使用Sig-1R激活劑SA4503可顯著增加海馬神經元的軸突長度，對神經功能障礙產生重大影響，并且SA4503的生長促進作用伴隨著對電壓門控鈣離子通道的抑制，這有力地證明了MAM 組成蛋白通過調控鈣轉運參與海馬神經元的軸突生長。同時有研究表明，在癡呆患者體內Sig-1R 通路被破壞，恢復Sig-1R 穩(wěn)態(tài)則可以發(fā)揮神經保護作用，減輕認知障礙［25］，這與上述激活Sig-1R 能增加海馬神經元軸突長度影響神經元功能的結果一致。此外，鈣紊亂還對細胞凋亡具有重要影響。缺血性卒中的發(fā)作會導致神經元產生過高的線粒體活性氧以及Ca2+超載引起興奮性氨基酸毒性，進而誘導線粒體通透性轉換孔開放，最終將驅動線粒體凋亡誘導蛋白CytC排入細胞質并觸發(fā)細胞凋亡［26］。MAM 錨定蛋白VDAC在影響細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。在腦缺血期間VDAC 可促進線粒體釋放CytC到細胞質基質而誘導細胞凋亡，同時VDAC又是調節(jié)Ca2+運輸到線粒體的關鍵組件，其與IP3Rs和Grp75 共定位在MAM 上，增強線粒體對鈣的吸收［27-28］。因此，VDAC除了會直接誘導細胞凋亡外，還有可能通過鈣轉運間接誘導神經元凋亡而加重神經缺損。以上證據提示，MAM 功能蛋白異?？赡軙绊懞ｑR神經元軸突生長并通過影響鈣轉運誘導凋亡，加重海馬神經元損傷，而適當的調控則有可能促進缺血后神經元的恢復并減輕認知障礙。

2.3 調控線粒體動力學 線粒體動力學包括融合和分裂兩個過程，這對維持線粒體穩(wěn)態(tài)平衡和細胞存活具有重要作用。因此，線粒體動力學失衡常伴隨活性氧異常升高、鈣超載和能量缺陷等線粒體功能受損現象。線粒體融合與分裂失衡是導致卒中后鈣超載、氧化應激和細胞凋亡等病理過程進而引起神經元損傷及認知障礙的重要因素［29］。研究表明，在缺血性體內及體外模型中均存在Mfn2 的減少，這造成線粒體融合異常并進一步導致細胞凋亡，而誘導Mfn2 上調則可以恢復線粒體功能、發(fā)揮抗凋亡作用以減少海馬神經元的損傷［30］。海馬神經元除了線粒體融合障礙之外，線粒體分裂也存在異常，在癡呆和輕度認知障礙患者的外周血淋巴細胞中均顯示Drp1 蛋白顯著降低而 Fis1 蛋白表達增加［31］。Jiang等［32］通過敲除小鼠海馬和大腦皮層神經元中的Mfn2從反面驗證了線粒體功能形態(tài)變化及其繼發(fā)氧化應激反應、炎癥反應造成海馬神經元損傷并參與認知障礙的發(fā)生發(fā)展。這提示線粒體融合-分裂失衡與其繼發(fā)病理改變共同作用，共同影響著PSCI 的病理進程，調控線粒體動力學有可能是治療PSCI 的一個新靶點。此外，Mfn2 大量富集于MAM 上，它不但促進線粒體外膜的融合，還參與維持MAM 的基本結構及功能，MAM 的蛋白復合物Fis1-BAP31 也參與構建用于凋亡信號傳導的支架［7，33］。歐陽夢琪等［34］發(fā)現，腦卒中模型大鼠海馬CA1區(qū)MAM結構疏松，且Mfn2蛋白減少，而辣椒素通過抑制MAM 結構疏松、上調Mfn2 使大鼠學習記憶能力明顯改善。由此可知，MAM 也是調節(jié)線粒體動力學的重要結構，且MAM調控的線粒體動力學影響PSCI 的轉歸及預后，這為治療PSCI提供了一個可能的新靶點。

2.4 調控內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 當內質網受到缺血缺氧等外界刺激時，內質網內蛋白穩(wěn)態(tài)失衡，即發(fā)生ERS，此時內質網會通過未折疊蛋白反應調整內部程序，以恢復穩(wěn)態(tài)；若不能恢復，則調整到凋亡信號［35］。MAM 已被證明通過蛋白激酶R 樣內質網激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）和 IRE1α 等折疊酶參與未折疊蛋白反應啟動程序以維持細胞正常功能［36］。除此之外，MAM 還可以通過 ERS 促進炎癥小體的激活，ERS 與炎癥反應及細胞凋亡之間相互影響。一項體外細胞培養(yǎng)實驗表明，過表達IRE1α 可增強ERS 和神經元凋亡［37］。此外，一項動物實驗表明內源性磷酸化IRE1α 蛋白表達增加可以導致核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體活化及明顯的神經行為缺陷，在給予IRE1α抑制劑后的進一步研究證實ERS 可能通過加劇炎癥反應參與 PSCI 的發(fā)生［38］。有趣的是，NLRP3 炎癥小體的激活反過來也會誘導和加重ERS，它們之間存在著復雜的相互作用［39］。由此可見，ERS與炎癥反應共同作用加劇神經元損傷，有效調控ERS 對預防和治療PSCI 具有重要作用。最新研究表明，PERK 和IRE1α 等酶富集在 MAM 中，PERK 除了參與未折疊蛋白反應外，對維持MAM 結構和功能的完整性也至關重要［40］。MAM介導的ERS還可以影響腦卒中后神經元凋亡。Fei 等［41］的研究表明，激活 PERK 可加重ERS和凋亡活性，而抑制PERK信號通路則能減少細胞凋亡，并減輕缺血再灌注損傷并減輕認知障礙。基于這一點，Li等［42］發(fā)現，敲除ERS 調節(jié)相關因子發(fā)狀分裂相關增強子，促進了ERS 誘導的細胞凋亡，而應用PERK 抑制劑則顯著減弱了ERS 誘導的中風后神經元凋亡及認知障礙惡化。這進一步證實，ERS除了與炎癥反應共同作用外，還直接誘導神經元凋亡，從而造成PSCI。因此，有理由相信MAM 相關蛋白介導的ERS 和其繼發(fā)炎癥反應及細胞凋亡在腦卒中后神經元損傷造成的認知障礙中具有重要影響。

2.5 調控線粒體自噬 線粒體自噬能夠清除損傷或老化的線粒體，維持細胞穩(wěn)態(tài)，對細胞命運具有重要影響。其中線粒體自噬在PSCI 中的作用具有雙重性，適度自噬能清除堆積的異常物質而起到神經保護作用，過度自噬則會導致不受控制的降解而誘導更多的神經元死亡［43］。一項動物實驗表明，腦缺血再灌注損傷大鼠存在自噬標志物LC3-II 和含FUN14 域 蛋 白 1（FUN14 domain containing 1，FUNDC1）表達升高［44］。并且抑制自噬或可減輕PSCI［45］。但是 Wang 等［46］的研究表明，電針灸減輕缺血再灌注后神經元損傷的機制在于促進PTEN 誘導激酶1（PTEN-induced kinase 1，Pink1）/parkin 介導的線粒體自噬。這也再次印證了線粒體自噬作用的兩面性及其在PSCI 發(fā)生發(fā)展中的重要作用。此外，介導線粒體自噬的Pink1 及FUNDC1 蛋白均參與維持MAM 的完整性，MAM 是自噬體的起源部位，同時VAPB-PTPIP51 復合物也參與調節(jié)自噬［47］。VAPBPTPIP51 是MAM 重要的蛋白復合物，參與維持MAM的基本結構及功能。VAPB-PTPIP51 對線粒體自噬起負性調節(jié)作用，而阻斷IP3Rs 介導的Ca2+運輸則能影響這種作用［48］。癡呆患者顳葉神經元自噬激活而VAPB 和 PTPIP51 卻降低，并且 VAPB 和 PTPIP51 的喪失會進一步破壞突觸活性影響神經突觸功能［49］，這也再次印證了上述觀點。MAM 在其中發(fā)揮重要作用：一方面MAM 的功能蛋白直接介導線粒體自噬影響神經功能；另一方面MAM 的信號傳導功能如鈣轉運異常可能也會影響自噬。雖然目前線粒體自噬作為靶點可以治療PSCI，但對其研究仍然淺顯，如何適度調控線粒體自噬將其積極效應最大化或許是未來研究的熱點。因此，是否可以通過MAM 調節(jié)線粒體自噬影響PSCI的進程尚需深一步探究。

MAM在PSCI中作用的總結如圖1所示。

3 小結與展望

綜上所述，現有證據表明MAM 不同程度地參與了PSCI的病理進程，其各項生理功能與PSCI病理機制存在諸多交織。一方面MAM 本身異常會導致鈣轉運和脂質代謝等細胞信號傳導失靈；另一方面它還會引起線粒體和內質網功能障礙，進而影響細胞生存，加重機體病理損傷及不良事件的發(fā)生。MAM結構及功能正常才能維持細胞正常運轉，若MAM 異常，不但會直接誘導細胞凋亡，還會進一步加重氧化應激和炎癥反應等繼發(fā)改變，導致更多神經元死亡，加重認知障礙。

Figure 1. Potential targets of mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane（MAM）in post-stroke cognitive impairment（PSCI）. When PSCI occurs，it is often accompanied by pathological changes such as lipid metabolism disorder，calcium imbalance，mitochondrial dynamic imbalance，endoplasmic reticulum stress，and mitophagy. MAM also participates in the pathological process of PSCI through related physiological functions.Therefore，targeting and regulating related pathological mechanisms through MAM may alleviate the occurrence and development of PSCI. ER：endoplasmic reticulum；Mfn2：mitofusin 2；Mfn1：mitofusin 1；FIS1：fission 1 homologue；BAP31：B-cell receptor-associated protein 31；PTPIP51：protein tyrosine phosphatase-interacting protein 51；VAPB：vesicle-associated membrane protein-associated protein B；VDAC：voltage-dependent anion channels；GRP75：glucose-regulated protein 75；IP3Rs：inositol 1，4，5-triphosphate receptors.圖1 MAM在PSCI中的潛在作用靶點

雖然目前通過MAM 改善PSCI 相關的實驗研究較少，但毋庸置疑的是MAM在PSCI各種病理生理改變中具有重要作用。通過調控MAM 之間的串擾及各種功能蛋白或許能夠影響腦卒中的病理改變，并進一步減輕PSCI 的發(fā)生發(fā)展。然而究竟是腦卒中引起MAM 功能障礙使繼發(fā)病理改變加重導致認知障礙還是PSCI進一步引起MAM異常，又或是二者彼此影響，尚需深一步研究。鑒于MAM 結構復雜及功能蛋白多樣，未來還需深入研究在相應的病理過程中MAM的變化機制并進一步明確MAM在PSCI病理過程中的可作用靶點，以期特異性識別MAM，精準調控影響細胞命運的信號傳導，為今后PSCI 的靶向藥物開發(fā)提供新的參考資料。