中性粒細(xì)胞在肺動(dòng)脈高壓發(fā)病中作用的研究進(jìn)展*

冶 怡， 烏仁塔娜， 吳金春， 格日力△

（1青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，高原醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原醫(yī)學(xué)應(yīng)用基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海-猶他高原醫(yī)學(xué)聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；2青海省人民醫(yī)院，青海 西寧 810001）

肺動(dòng)脈高壓（pulmonary hypertension，PH）是指由多種異源性疾?。ú∫颍┖筒煌l(fā)病機(jī)制所致的肺血管結(jié)構(gòu)或功能改變，引起肺血管阻力和肺動(dòng)脈壓力升高的臨床和病理生理綜合征，繼而發(fā)展為右心衰竭甚至死亡。2018年第六屆世界肺動(dòng)脈高壓大會(huì)（World Symposium on Pulmonary Hypertension，WSPH）將PH 血流動(dòng)力學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)更新為：海平面、靜息狀態(tài)下，經(jīng)右心導(dǎo)管檢查測定的平均肺動(dòng)脈壓（mean pulmonary artery pressure，mPAP）＞20 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）［1］。近期流行病學(xué)研究表明，PH 不是罕見疾病，全球PH患病率約1%，其中65歲以上人群的患病率高達(dá)10%［2］。WSPH 將PH 分為（1）動(dòng)脈型 PH（pulmonary arterial hypertension，PAH）；（2）左心疾病所致PH；（3）肺部疾病和（或）低氧所致PH；（4）慢性血栓栓塞性PH（chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH）和（或）其他肺動(dòng)脈栓塞性疾病所致PH；（5）原因不明和（或）多因素所致PH。各類PH 存在相似的病理學(xué)特征，例如肺血管持續(xù)性收縮，血管壁重塑及原位血栓形成；組織學(xué)研究表明重塑的肺動(dòng)脈周圍伴有血管周圍炎癥及蛋白酶水平升高。其中，炎癥反應(yīng)在PH 的病理生理中發(fā)揮著極為重要的作用［3］，而中性粒細(xì)胞是參與其中的重要組分［4］。

中性粒細(xì)胞是人體含量最多的天然免疫細(xì)胞，是固有免疫防御的第一道防線。在炎癥或損傷發(fā)生時(shí)，中性粒細(xì)胞從血液中被募集，從血管內(nèi)游出并趨化到病灶，吞噬殺傷病原微生物或變異細(xì)胞。

Tuder 等［5］于 1994 年首次報(bào)道 PH 患者病變肺血管周圍出現(xiàn)大量免疫細(xì)胞浸潤及補(bǔ)體、免疫球蛋白的沉積；之后在各種類型的PH 患者和PH 動(dòng)物模型中證實(shí)中性粒細(xì)胞水平的顯著增加［6］，且增加的中性粒細(xì)胞可影響反映疾病進(jìn)展的臨床標(biāo)志物水平，例如肺血管阻力增加及6 min 步行距離減少［7-8］。中性粒細(xì)胞在PH 病程中歸巢到肺組織后，不僅參與肺血管炎癥［9］，還能夠通過脫顆粒釋放細(xì)胞因子及蛋白酶而介導(dǎo)肺血管重塑［10］。上述研究結(jié)果提示中性粒細(xì)胞與PH 的病理生理學(xué)之間的潛在聯(lián)系。本文就中性粒細(xì)胞在PH 發(fā)生與發(fā)展的作用及其分子機(jī)制的研究進(jìn)展作一綜述，嘗試為PH 發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)及治療提供參考資料。

1 中性粒細(xì)胞在PH中的募集

PH 血管周圍炎癥介導(dǎo)內(nèi)皮、平滑肌及炎癥細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，同時(shí)蛋白酶降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）［11］。細(xì)胞因子的大量分泌和ECM 降解釋放的肽類能夠引起循環(huán)免疫細(xì)胞的激活和募集［12］，其中，中性粒細(xì)胞是首先招募到炎癥部位并參與血管重塑的重要成分。炎癥狀態(tài)下，中性粒細(xì)胞被白細(xì)胞介素8（interleukin-8，IL-8/CXCL8）等趨化因子激活，使其在流動(dòng)條件下牢固黏附于內(nèi)皮細(xì)胞，隨后在內(nèi)皮管腔表面移行，并從血管滲出，依賴趨化因子的濃度梯度最先到達(dá)炎癥部位。大量研究觀察到PH 患者與PH 動(dòng)物模型外周血及肺組織中中性粒細(xì)胞增加［13］，且不同類型PH 中，中性粒細(xì)胞水平升高程度不同，其中以 3 型 PH 最為顯著［14］。Tian等［15］在PAH 患者肺部的叢狀病變中觀察到巨噬細(xì)胞，而活化的巨噬細(xì)胞能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集。Soon 等［8］表明在 PAH 患者血漿 IL-8 水平升高的情況下，基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）失活促進(jìn)中性粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)。Florentin等［10］證實(shí)PH 中性粒細(xì)胞在骨髓動(dòng)員、血液循環(huán)和肺組織募集三個(gè)階段均有顯著增加，進(jìn)一步揭示了PH患者肺臟浸潤的中性粒細(xì)胞來源于骨髓，其機(jī)制為IL-6上調(diào)中性粒細(xì)胞上CX3CR1的表達(dá)，從而促進(jìn)中性粒細(xì)胞從骨髓遷至肺臟。此外，研究強(qiáng)調(diào)募集于肺組織的中性粒細(xì)胞促進(jìn)小鼠的肺動(dòng)脈壓升高及肺動(dòng)脈重塑。

2 中性粒細(xì)胞在PH中的分泌

2.1 IL-1β 在 PH 中的作用 IL-1β 是一種重要的細(xì)胞因子，是炎癥反應(yīng)的重要介質(zhì)。在PH 患者中檢測到血清 IL-1β 水平升高，且升高的 IL-1β 水平影響疾病預(yù)后［11］。Cero 等［16］的研究表明，在慢性低氧誘導(dǎo)的PH 小鼠肺血管中浸潤的中性粒細(xì)胞能夠分泌IL-1β，且在小鼠中敲除 IL-1β 受體，或使用 IL-1β 受體抑制劑［17］可減輕野百合堿誘導(dǎo)的PH 動(dòng)物模型中肺動(dòng)脈壓的持續(xù)升高和右心室收縮壓的顯著降低。在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）中，前列環(huán)素調(diào)節(jié)血管舒張并具有抗增殖作用。這種血管舒張作用是通過第二信使環(huán)磷酸腺苷（cyclicadenosine monophosphate，cAMP）介導(dǎo)的。IL-1β通過下調(diào)腺苷酸環(huán)化酶來減弱PASMCs中ATP 向 cAMP 的轉(zhuǎn)化［18］。此外，IL-1β 可以通過 IL-1R1/MyD88通路調(diào)節(jié)PASMCs的生長［19］。因此，作為一種潛在的作用機(jī)制，中性粒細(xì)胞分泌的IL-1β可能直接調(diào)節(jié)肺動(dòng)脈的血管收縮和重塑。在PH 的情況下，中和IL-1β、抑制IL-1β 信號(hào)傳導(dǎo)或抑制調(diào)控IL-1β分泌的上游途徑可能有效地減輕疾病進(jìn)展。

2.2 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）在PH 中的作用 中性粒細(xì)胞是血管周圍炎癥發(fā)生后被招募的細(xì)胞之一，也是多種蛋白水解酶的潛在細(xì)胞來源，釋放具有酶活性的NE、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組織蛋白酶G（cathepsin G）、基質(zhì)金屬蛋白酶 1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）、MMP-8、MMP-9及MMP-12等參與不同的炎癥過程［20］。NE 是中性粒細(xì)胞活化后釋放的一種重要的絲氨酸蛋白水解酶，是中性粒細(xì)胞儲(chǔ)存并釋放的眾多蛋白水解酶中水解功能最強(qiáng)、最重要的一種。有證據(jù)表明從PAH 患者中分離出的中性粒細(xì)胞中NE 釋放增加［9］。同時(shí)，也觀察到 PAH 患者和 PH 動(dòng)物模型中內(nèi)源性NE的上調(diào)［21-22］。體外研究表明人類肺泡巨噬細(xì)胞通過攝取凋亡的中性粒細(xì)胞將NE 內(nèi)化，并將其轉(zhuǎn)運(yùn)至組織并隨后釋放活性形式［23］。在實(shí)驗(yàn)性PH 大鼠模型中，增加的NE 活性進(jìn)一步加劇肺血管病變［24］。此外，中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）由NE 和其他抗菌蛋白酶修飾的解聚染色質(zhì)組成，強(qiáng)調(diào)PAH 中的高NETs水平可能是活性NE的重要來源［25］。

NE 是參與PH 發(fā)病的重要介質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)性PH大鼠模型中，NE 活性增加與血管病變有關(guān)［24］，且抑制NE 活性不僅可以減緩野百合堿誘導(dǎo)的PH 模型的進(jìn)展，還能夠改善PH 血流動(dòng)力學(xué)變化，逆轉(zhuǎn)疾病過程［26］。Kim等［21］使用過表達(dá)S100A4蛋白的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步明確了NE 誘導(dǎo)新生血管內(nèi)膜形成，且輸注重組Elafin（內(nèi)源性NE 抑制劑）減少了PH 模型中新生血管內(nèi)膜損傷的數(shù)量及嚴(yán)重程度。Nickel 等［27］觀察到在Sugen5416聯(lián)合低氧誘導(dǎo)的PH大鼠模型的肺組織中，NE 活性增加，且應(yīng)用Elafin 抑制其活性能夠改善內(nèi)皮功能、減少肺小動(dòng)脈重塑并降低肺動(dòng)脈壓力，抑制NE活性可作為治療PH的新靶點(diǎn)。

NE 的釋放不僅能夠降解彈性蛋白，還可以通過降解幾乎所有ECM 成分（包括膠原蛋白、纖連蛋白和層粘連蛋白）刺激肺血管重塑，從而誘導(dǎo)PH 的發(fā)生與發(fā)展［28］。降解的ECM 釋放生物活性肽和生長因子，例如表皮生長因子和成纖維細(xì)胞生長因子［29］，促進(jìn) PASMCs 和成纖維細(xì)胞的增殖與遷移［30］，以加重PH 肺血管重塑。增強(qiáng)的NE 活性導(dǎo)致MMPs 激活，通過增強(qiáng)ECM 降解和誘導(dǎo)生腱蛋白C（tenascin C）生成，促進(jìn)tenascin C 與纖連蛋白的內(nèi)皮下沉積，介導(dǎo)PASMCs 遷移及新生血管內(nèi)膜的形成。同時(shí)，抑制NE會(huì)導(dǎo)致tenascin C 減少，誘導(dǎo)PASMCs凋亡并改善肺小動(dòng)脈不良重塑［26］。

除了促進(jìn)PASMCs 增殖與遷移外，NE 還通過細(xì)胞因子的蛋白水解修飾參與PH 的發(fā)病機(jī)制。例如，NE 通過水解人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞中無活性的IL-1β前體，增加中性粒細(xì)胞胞外囊泡中活性IL-1β 的分泌［31］，同時(shí)活性IL-1β 可促進(jìn)中性粒細(xì)胞活化［32］。因此，中性粒細(xì)胞、NE 與IL-1β 之間形成正反饋環(huán)路，介導(dǎo)PH 發(fā)生。此外，NE 還能夠水解SDF-1，參與調(diào)節(jié)骨髓中性粒細(xì)胞的釋放［33］。研究表明，在PAH 患者血漿IL-8水平升高的情況下，SDF-1失活促進(jìn)中性粒細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)［34］。

因此，PH 患者與動(dòng)物模型中NE 的增加及其肺血管壁中層彈性纖維的破壞明確了蛋白水解酶，特別是NE 的關(guān)鍵致病作用，NE 通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的活性及降解ECM 而釋放促進(jìn)PASMCs 重塑的生長因子來參與PH 發(fā)病機(jī)制。此外，NE 的釋放可能會(huì)改變局部炎癥環(huán)境，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞活性，并進(jìn)一步推動(dòng)PH異常免疫炎癥。

2.3 與PH 病變有關(guān)的其他蛋白酶的作用 PH 病變中MMPs 的失調(diào)與多種病理生理過程有關(guān)［35］。例如，特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者肺組織中MMP-2 的生成及活性增加，同時(shí) MMP-3 減少［36］。PAH 患者的肺小動(dòng)脈叢狀病變［37］及野百合堿誘導(dǎo)的PH 大鼠的肺組織［38］中MMP-9表達(dá)上調(diào)。George 等［39］通過構(gòu)建野百合堿誘導(dǎo)的MMP-9轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)一步證實(shí)，MMP-9的過度表達(dá)加劇了野百合堿誘導(dǎo)的小鼠肺組織炎癥細(xì)胞浸潤、肺小動(dòng)脈重塑及肺動(dòng)脈壓升高。此外，MMP-2 和膜型MMP-1 大量表達(dá)于具有叢狀病變的PAH 患者的肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（pulmonary artery endothelial cells，PAECs）中，同時(shí) MMP-3 和 MMP-7 的表達(dá)在增殖的肌成纖維細(xì)胞中顯著升高［40］。MMPs 參與PH 疾病進(jìn)展的機(jī)制主要為：MMPs 通過促進(jìn)PAECs 遷移，PASMCs 遷移和增殖，外膜成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，ECM 生成及炎癥細(xì)胞募集，介導(dǎo)難以逆轉(zhuǎn)的肺血管重塑。

活化的中性粒細(xì)胞能夠脫顆粒并釋放儲(chǔ)存于嗜天青顆粒中的MPO，其主要功能是利用過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸鹽，并形成具有氧化能力的自由基，構(gòu)成MPO-過氧化氫-鹵素系統(tǒng)，進(jìn)而殺傷病原微生物。Rose 等［9］在 PAH 及 CTEPH 患者中檢測到血漿MPO 水平升高，且影響PH 的嚴(yán)重程度及臨床結(jié)局。新近研究表明，PAH 患者的血漿和肺組織中MPO 水平升高，且MPO 促進(jìn)肺動(dòng)脈壓力升高及肺小血管肌化；此外，抑制Sugen5416聯(lián)合低氧誘導(dǎo)的PH大鼠體內(nèi)MPO 水平，進(jìn)一步揭示了MPO 通過激活RhoA/Rho 激酶途徑促進(jìn)肺血管收縮，誘導(dǎo)肺血管重塑，說明MPO在PH發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用［41］。

總之，PH 中升高的大量細(xì)胞因子可增強(qiáng)中性粒細(xì)胞的數(shù)量與功能，同時(shí)中性粒細(xì)胞脫顆?？山閷?dǎo)PH 血管炎癥持續(xù)存在。PH 患者的血管周圍炎癥表型以循環(huán)及組織中細(xì)胞因子水平升高為特征，且與中性粒細(xì)胞的持續(xù)活化一致。

3 NETs在PH中的作用

中性粒細(xì)胞可以通過3 種主要不同機(jī)制對刺激作出反應(yīng)：吞噬作用、釋放含有蛋白酶和活性氧的顆粒及NETosis（即中性粒細(xì)胞生成NETs 的過程）。NETs 是有別于細(xì)胞凋亡與壞死的死亡形式［42］，活化的中性粒細(xì)胞能夠向細(xì)胞外釋放由解聚的染色質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)顆粒蛋白組成的NETs，如瓜氨酸化的組蛋白H3、MPO、NE、cathepsin G 等。NETs的形成和存在是一種慢性、低度的炎癥反應(yīng)。然而，近年來研究顯示，NETs 在多種非感染性急、慢性疾病中也具有重要的致病作用［43］。與PH 發(fā)病機(jī)制有關(guān)的因素，如氧化應(yīng)激、IL-8［44］、NE、MPO、高遷移率族盒蛋白 1［45］（high mobility group box protein 1，HMGB1）、腫瘤壞死因子α、核糖核蛋白復(fù)合物等可在體內(nèi)、外誘導(dǎo)NETosis［46］。例如，PH 患者與 PH 動(dòng)物模型的血清及肺組織中HMGB1 升高，且HMGB1 含量影響mPAP水平［19，47］，隨后，通過構(gòu)建 Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）基因敲除的 PH 模型小鼠明確HMGB1 通過激活TLR4 參與肺血管重塑及右心室肥厚的發(fā)生發(fā)展［45］，提示 NETosis 與 PH 的病理生理學(xué)之間的潛在聯(lián)系。

目前已在 PAECs 凋亡［48］及血栓形成［49］有關(guān)的PH 血管病變中檢測到NETosis。并且，Aldabbous等［50］首次在 IPAH 與 CTEPH 患者的血漿、閉塞的叢狀病變及原位血栓中觀察到大量活化的中性粒細(xì)胞及NETs；并且，通過血管生成模型，體內(nèi)、外基質(zhì)膠血管生成實(shí)驗(yàn)證實(shí)NETs 促進(jìn)內(nèi)皮血管生成，并伴有PAECs通透性增加，PAECs與PASMCs的增殖及遷移能力增強(qiáng)，并且進(jìn)一步表明NETs 誘導(dǎo)的肺血管重塑依賴于MPO/TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活。

由此可見，NETs 可能通過不同的途徑促進(jìn)肺血管重塑，其介導(dǎo)的肺血管穩(wěn)態(tài)失衡或?qū)Σ煌愋偷腜H疾病具有潛在的影響。

4 中性粒細(xì)胞在PH中的的預(yù)后價(jià)值

中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值（neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR）是反映體內(nèi)免疫平衡失調(diào)和全身炎癥反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物。近年來研究表明其與心血管系統(tǒng)疾病，自身免疫性疾病、惡性腫瘤及新型冠狀病毒肺炎［51］中 NLR 水平升高。在 CTEPH［52］與IPAH 中，NLR 影響肺血管阻力增加及臨床預(yù)后［53］。NLR 在伴有 PH 的紫紺型先天性心臟?。?4］及結(jié)節(jié)?。?5］中顯著升高并影響肺動(dòng)脈收縮壓及術(shù)后不良結(jié)局。因此，NLR 可作為預(yù)測PH 患者預(yù)后的有效生物標(biāo)志物。

5 靶向中性粒細(xì)胞對PH的作用

目前針對中性粒細(xì)胞治療PH 的研究發(fā)展迅速，涉及多個(gè)方面，并在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型中都證實(shí)了療效，有望成為未來PH治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

IL-1β是肺血管中性粒細(xì)胞介導(dǎo)PASMCs增殖的關(guān)鍵信號(hào)通路，通過基因［16］或藥物抑制IL-1β［17］可延緩PH的發(fā)生發(fā)展。

中性粒細(xì)胞脫顆粒后釋放的NE 在多種動(dòng)物模型中主要參與肺血管重塑，應(yīng)用小分子制劑抑制NE［26］或使用內(nèi)源性 NE 抑制劑 Elafin［56］可使肺動(dòng)脈壓力及肺血管結(jié)構(gòu)正?；?。然而，除了阻斷NE 作用外，研究證實(shí)Elafin可增強(qiáng)骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)傳導(dǎo)并抑制NF-κb 活性，從而在PH 中提供了更加強(qiáng)效的抗炎作用。目前，評價(jià)Elafin 抗PH 治療的安全性與有效性的臨床試驗(yàn)（NCT03522935）已如期開展，旨在探索PH人群的更優(yōu)藥物療法。

HMGB1/NETs/TLR4 信號(hào)通路參與肺血管重塑，加重血管壁增厚，增加肺血管阻力，導(dǎo)致PH 的發(fā)生發(fā)展。P5779 通過特異性抑制HMGB1 與TLR4 之間的相互作用，可逆轉(zhuǎn)Sugen5416 聯(lián)合低氧誘導(dǎo)的PH大鼠升高的肺動(dòng)脈壓，并改善右心室收縮壓、右心室功能障礙及肺血管重塑［47］。此外，利用DNase I 降解NETs后，NETs誘導(dǎo)的促血管生成反應(yīng)及肺血管重塑減弱。因此，靶向HMGB1/NETs/TLR4 通路可作為PH防治的新思路。

綜上所述，以肺血管周圍中性粒細(xì)胞的浸潤為特征的炎癥反應(yīng)是PH 的關(guān)鍵致病因素。中性粒細(xì)胞在PH 病程中募集到肺血管及周圍組織，不僅參與肺血管炎癥，還能夠通過脫顆粒釋放細(xì)胞因子、蛋白酶，甚至以NETosis 的程序性死亡介導(dǎo)肺血管重塑。靶向中性粒細(xì)胞治療在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型中都證實(shí)了較好的療效并取得了重要突破，有望成為未來PH治療的新靶點(diǎn)。