基于糖蜜原料的γ-聚谷氨酸發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

李祥松，王慧超，趙廷彬，張琳，孫銀華，李振海，徐雪天，喬長(zhǎng)晟，，，4*，鄭保國(guó)

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津慧智百川生物工程有限公司，天津 300457；3.天津北洋百川生物技術(shù)有限公司，天津 300457；4.天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300457，5.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，寧夏 銀川 750002）

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA） 是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過(guò)γ-羧基和α-氨基之間的酰胺鍵連接的水溶性高分子材料[1-2]。由于其對(duì)環(huán)境無(wú)污染，具有優(yōu)良的生物降解性、成膜性、纖維性、保水性等特殊的理化性能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、化妝品、食品等行業(yè)[3-7]。Ivánovics等[8]在炭疽芽孢桿菌中第一次發(fā)現(xiàn)γ-PGA，是其芽孢桿菌莢膜的主要成分；之后Bovarnick[9]從枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了γ-PGA。微生物發(fā)酵制備γ-PGA主要使用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）等芽孢桿菌屬。

目前微生物發(fā)酵存在產(chǎn)量不高，菌株性能不穩(wěn)定，生產(chǎn)成本高，難以工業(yè)化生產(chǎn)等問(wèn)題，篩選高產(chǎn)菌株、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件是提高γ-PGA產(chǎn)量的幾個(gè)主要手段。目前，γ-PGA生產(chǎn)菌株多為谷氨酸依賴型，常用碳源有葡萄糖、蔗糖、淀粉、甘油等。張雷等[10]利用響應(yīng)面法優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用葡萄糖作為碳源發(fā)酵γ-PGA產(chǎn)量最高，達(dá)到28.1 g/L；盛潔等[11]以蔗糖為碳源利用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的γ-PGA產(chǎn)量為41.2 g/L。糖蜜中以蔗糖為主[12]，因此糖蜜可以作為碳源被應(yīng)用到微生物發(fā)酵中，姚麗萍等[13]研究了糖蜜為碳源發(fā)酵L-絲氨酸，最終L-絲氨酸產(chǎn)量為32.76 g/L，相較于蔗糖發(fā)酵產(chǎn)量提高了29.44%；徐海東等[14]使用糖蜜發(fā)酵乙醇，發(fā)酵結(jié)束乙醇濃度達(dá)到100.99 g/L?？追怖萚15]使用菠蘿皮渣與甘蔗糖蜜復(fù)合發(fā)酵釀制果醋，醋香味明顯；劉紅陽(yáng)[16]利用枯草芽孢桿菌yt102以糖蜜為碳源發(fā)酵農(nóng)用γ-PGA，產(chǎn)量可達(dá)32.7 g/L。

本研究為了提高γ-PGA產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，以甘蔗糖蜜為碳源，對(duì)培養(yǎng)基組分進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，采用單因素試驗(yàn)篩除培養(yǎng)基中對(duì)γ-PGA產(chǎn)量起抑制或無(wú)影響的組分，確定顯著因子中心點(diǎn)，Box-Behnke設(shè)計(jì)[17]構(gòu)建相應(yīng)方程并預(yù)測(cè)得到最優(yōu)培養(yǎng)基配方，為γ-PGA的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）CGMCC NO.23967：天津北洋百川生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨（生化試劑）、酵母浸膏（生化試劑）、瓊脂粉（分析純）、葡萄糖（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、（NH4）2SO4、K2SO4、CaSO4·2H2O、FeSO4·7H2O、甘 油（均為分析純）：維科特天津化工產(chǎn)品貿(mào)易有限公司；酵母膏（Ⅰ型～Ⅶ型）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蛋白胨（Ⅰ型～Ⅵ型）：安琪酵母股份有限公司；味精（99%）：梅花生物科技集團(tuán)股份有限公司；甘蔗糖蜜：市售；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752紫外分光光度計(jì)：天津市光學(xué)儀器廠；SBA-40E生物傳感儀：山東省科學(xué)院生物研究所；LC-20AT高效液相色譜分析儀：日本島津有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制

LB固體培養(yǎng)基：NaCl 10 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，瓊脂2%。調(diào)節(jié)初始pH7.2～pH7.3，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L、酵母膏7 g/L、K2HPO4·3H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，初始 pH（7.2±0.1），121 ℃滅菌 20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：味精濃度70 g/L、糖蜜可溶性固形物 9%、酵母膏 10 g/L、蛋白胨 5 g/L、（NH4）2SO47 g/L、K2SO415 g/L、CaSO4·2H2O 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.1 g/L、甘油 60 mL/L，初始 pH（7.2±0.1），121℃滅菌20 min。

1.3.2 菌種培養(yǎng)方法

種子活化：在無(wú)菌操作臺(tái)用接種環(huán)從甘油管中蘸取2環(huán)～3環(huán)菌液，劃線于裝有LB固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。然后將培養(yǎng)皿中的菌種挑起，并均勻涂抹于斜面培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)12 h。

種子培養(yǎng)：接種前將滅菌后的葡萄糖溶液轉(zhuǎn)入裝有種子培養(yǎng)基的三角瓶中，然后使用接種環(huán)將活化好的菌種斜面接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL無(wú)擋板三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為220 r/min的37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)14 h～16 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液以10%接種量接入含有5 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為220 r/min的37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)72 h。

1.3.3 γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

準(zhǔn)確稱取γ-PGA標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，于80 mL純凈水中溶解后定容至100 mL，配制成濃度為1 g/L的母液，取適量母液逐級(jí)稀釋，配制 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)液。以0.22 μm水相濾膜過(guò)濾上述5個(gè)梯度濃度的γ-聚谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)液并裝入2.5 mL的液相小瓶中，將樣品放入高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀，利用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，建立峰面積和標(biāo)準(zhǔn)品濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

HPLC的檢測(cè)條件：紫外檢測(cè)器、波長(zhǎng)210 nm、凝膠滲透色譜柱、流動(dòng)相0.05 mol/L無(wú)水Na2SO4溶液、流速 0.5 mL/min、停止時(shí)間 35 min、進(jìn)樣量 20 μL、檢測(cè)器溫度35℃、柱溫30℃。

1.3.4 樣品γ-PGA濃度測(cè)定

取發(fā)酵液15000r/min離心15min，取1mL上清液到100 mL容量瓶用流動(dòng)相定容至100 mL，以0.22 μm水相濾膜過(guò)濾上述稀釋后的樣品并裝入2.5 mL的液相小瓶中，放入HPLC儀，利用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

1.3.5 可溶性固形物含量測(cè)定

將樣品滴到手持糖度計(jì)檢測(cè)棱鏡上，合上蓋板，避免氣泡產(chǎn)生，使溶液遍布棱鏡表面；將手持糖度計(jì)的進(jìn)光板對(duì)準(zhǔn)光源或明亮處，眼睛通過(guò)目鏡觀察視場(chǎng)，藍(lán)黃分界線的刻度值即為樣品溶液的可溶性固形物含量。

1.3.6 工藝優(yōu)化試驗(yàn)說(shuō)明

1.3.6.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

探索培養(yǎng)基中甘油濃度（0、20、40、60、80 mL/L）、糖蜜可溶性固形物濃度（5%、7%、9%、11%、13%）、不同酵母膏種類、酵母膏濃度（1、4、7、10、13、16 g/L）、不同蛋白胨種類、（NH4）2SO4濃度（0、2、4、6、8、10 g/L）、K2SO4濃度（0、3、6、9、12、15 g/L）、CaSO4·2H2O 濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、MgSO4·7H2O 濃 度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L）、FeSO4·7H2O 濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 g/L）、味精濃度（0、20、40、60、80、100 g/L） 對(duì)地衣芽孢桿菌 （Bacillus licheniformis）CGMCC NO.23967產(chǎn)γ-聚谷氨酸的影響。

1.3.6.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)研究主要影響因子對(duì)地衣芽孢桿菌CGMCC NO.23967產(chǎn)γ-PGA的影響，通過(guò)單因素試驗(yàn)確定糖蜜可溶性固形物濃度、酵母膏濃度、FeSO4·7H2O濃度作為因變量，γ-PGA產(chǎn)量為響應(yīng)值。試驗(yàn)因素與水平編碼如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Design-expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理，采用Origin 2018作圖，Excel進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基成分單因素試驗(yàn)

碳氮源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖1所示。

圖1 碳氮源對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of the carbon and nitrogen source on the yield of γ-PGA

由圖1A可知，當(dāng)甘油濃度為0～40 mL/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量差異不明顯，當(dāng)甘油濃度在高于40 mL/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量明顯下降，由此可見，當(dāng)甘油濃度低時(shí)，對(duì)該菌株的γ-PGA產(chǎn)量影響不大，當(dāng)甘油濃度較高時(shí)抑制該菌株產(chǎn)γ-PGA，因此后續(xù)試驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中不再添加甘油。甘油在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中成本占比相對(duì)較高，因此當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中去除甘油后，發(fā)酵成本顯著降低。由圖1B可知，γ-PGA產(chǎn)量在糖蜜可溶性固形物濃度為5%～9%時(shí)，隨著糖蜜可溶性固形物濃度增加而增加，在糖蜜可溶性固形物濃度為9%時(shí)達(dá)到最大，最大產(chǎn)量為（36.02±0.76）g/L，當(dāng)糖蜜可溶性固形物濃度為9%～13%時(shí)，隨著糖蜜可溶性固形物濃度的增加，γ-PGA產(chǎn)量下降。因此，選擇糖蜜可溶性固形物添加量9%為最佳添加量。由圖1C可知，使用Ⅲ型酵母膏γ-PGA的產(chǎn)量明顯高與其他種類的酵母膏，產(chǎn)量最高?？梢钥闯霾煌吞?hào)的酵母膏對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響顯著，可能不同種類型號(hào)所含成分有差異，因此，選擇Ⅲ型酵母膏作為最佳酵母膏，后續(xù)試驗(yàn)使用Ⅲ型酵母膏。由圖1D可以看出，當(dāng)酵母膏濃度為4 g/L時(shí)γ-PGA產(chǎn)量最高，低于4 g/L時(shí)隨著酵母膏濃度的增加，γ-PGA產(chǎn)量增加，當(dāng)酵母膏濃度高于4 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量隨酵母膏濃度的增加而減少，因此選擇4 g/L為酵母膏最佳濃度。由圖1E可知，在不添加蛋白胨的情況下，酵母膏與糖蜜所提供的有機(jī)氮源已經(jīng)可以滿足菌體自身生長(zhǎng)需求，不需要額外再添加有機(jī)氮源，因此，后續(xù)試驗(yàn)不再添加蛋白胨，進(jìn)一步降低了成本。

金屬元素與味精對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響如圖2所示。

圖2 金屬元素與味精對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of metallic element and monosodium glutamate on the yield of γ-PGA

由圖2A可知，隨著K2SO4濃度的提高，γ-PGA產(chǎn)量降低，鉀離子在微生物體內(nèi)直接參與物質(zhì)運(yùn)輸，但在本試驗(yàn)中鉀離子的添加出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，推測(cè)糖蜜中可能含有足夠的鉀離子（4.45%）滿足菌體生長(zhǎng)需求。因此，將K2SO4從培養(yǎng)基中除去，后續(xù)試驗(yàn)不再添加，發(fā)酵培養(yǎng)基成本進(jìn)一步降低。由圖2B可知，（NH4）2SO4的添加并不會(huì)對(duì)γ-PGA的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，相反，當(dāng)（NH4）2SO4濃度高于8 g/L時(shí)，對(duì)γ-PGA有明顯抑制作用，因此，后續(xù)試驗(yàn)不再添加（NH4）2SO4。由圖2C、2D可知，CaSO4·2H2O與MgSO4·7H2O濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量均無(wú)顯著影響。由圖2E可知，F(xiàn)eSO4·7H2O的濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響較大，當(dāng)FeSO4·7H2O濃度在0～0.7 g/L時(shí)，隨著FeSO4·7H2O濃度增加，γ-PGA產(chǎn)量明顯增加，并在FeSO4·7H2O濃度為0.7 g/L時(shí)達(dá)到最高；當(dāng)FeSO4·7H2O濃度高于0.7 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量變化不明顯。因此，選擇0.7 g/L為FeSO4·7H2O的最佳添加濃度。γ-PGA生產(chǎn)菌株按是否需要大量外源添加谷氨酸單體分為谷氨酸依賴型與非谷氨酸依賴型[18]。味精作為γ-PGA的前體物質(zhì)，味精的濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量比較明顯，由圖2F可知，當(dāng)味精濃度在0～80 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量顯著增加，當(dāng)味精濃度高于80 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量不再增加。因此選擇80 g/L為味精最佳添加濃度。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果

選取糖蜜可溶性固形物濃度（A）、酵母膏濃度（B）、FeSO4·7H2O 濃度（C）為試驗(yàn)因素，γ-PGA 產(chǎn)量（Y）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行方法分析，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of response surface results

使用Design Expert軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到以γ-PGA產(chǎn)量為因變量，A、B、C為自變量的二次多項(xiàng)式回歸方程：γ-PGA產(chǎn)量Y=66.46-1.19A+1.08B+2.67C+0.33AB-1.22AC+0.43BC-5.22A2-5.39B2-3.47C2。線性模型自變量系數(shù)的正系數(shù)表示促進(jìn)作用，負(fù)系數(shù)表示抑制作用[19]，B、C系數(shù)為正表示在研究范圍內(nèi)有利于提高γ-PGA的產(chǎn)量，A則相反。當(dāng)回歸系數(shù)和各獨(dú)立因素之間的交互作用P值低于0.05時(shí)，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上認(rèn)為是差異顯著的[20]，由表3可知，本試驗(yàn)的P＜0.000 1，說(shuō)明回歸方程的顯著性為差異極顯著。失擬項(xiàng)P值為0.077＞0.05，說(shuō)明失擬項(xiàng)不顯著。從表中可以看出，C、A2、B2和 C2對(duì) γ-PGA 產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），A、B 與 AC 差異顯著（P＜0.05），交互項(xiàng) AB、BC差異不顯著（P＞0.05）。另外，該模型決定系數(shù)為R2=0.983 9，R2Adj=0.963 1，均大于0.95，說(shuō)明擬合程度較好，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用于地衣芽孢桿菌CGMCC NO.23967菌株發(fā)酵γ-PGA的理論預(yù)測(cè)。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)的曲面圖可以清晰地展示出兩種變量之間的交互作用，以及各變量對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響[21]，本研究利用響應(yīng)面法揭示了糖蜜可溶性固形物濃度、酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響，控制其中一個(gè)因素不變，另外兩個(gè)因素交互作用而呈現(xiàn)出來(lái)的三維曲面圖與等高線圖如圖3～圖5所示。

圖3 糖蜜可溶性固形物濃度與酵母膏濃度交互作用對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of interaction between soluble solid concentration of molasses and yeast extract concentration on the yield of γ-PGA

圖4 糖蜜可溶性固形物濃度與FeSO4·7H2O濃度交互作用對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of interaction between soluble solids concentration of molasses and FeSO4·7H2O concentration on the yield of γ-PGA

圖5 酵母膏濃度與FeSO·47H2O濃度交互作用對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of interaction between yeast extract concentration and FeSO·47H2O concentration on the yield of γ-PGA

從三維曲面圖可以看出隨著各因素的用量增加，γ-PGA產(chǎn)量也隨之增加，到達(dá)最高點(diǎn)后，隨著各因素用量繼續(xù)增加，γ-PGA產(chǎn)量開始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。響應(yīng)面彎曲度越大說(shuō)明兩個(gè)因素的交互作用越明顯，與圖4相比圖3與圖5彎曲程度最高，三者的響應(yīng)面彎曲程度順序?yàn)樘敲劭扇苄怨绦挝餄舛扰cFeSO4·7H2O濃度的交互作用＞酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度的交互作用＞糖蜜可溶性固形物濃度與酵母膏濃度的交互作用。

響應(yīng)面的等高線圖可以反映出兩個(gè)因素交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響，如果等高線形狀為橢圓形，則兩個(gè)因素交互作用顯著；等高線越接近圓形，則兩個(gè)因素交互作用越不顯著[22]。圖3與圖5中等高線圖接近圓形，表明糖蜜可溶性固形物濃度與酵母膏濃度、酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度的交互作用對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響不顯著，圖4等高線圖近似橢圓形，表明糖蜜可溶性固形物濃度與FeSO4·7H2O濃度的交互作用對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響顯著。圖3酵母膏濃度與糖蜜可溶性固形物濃度交互作用的等高線在糖蜜可溶性固形物濃度一側(cè)排列更為緊密，說(shuō)明糖蜜可溶性固形物濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量的影響比酵母膏濃度更大；圖5酵母膏濃度與FeSO4·7H2O濃度交互作用的等高線排列緊密程度差距不明顯；而圖4糖蜜可溶性固形物濃度與FeSO4·7H2O濃度交互作用的等高線在糖蜜可溶性固形物濃度一側(cè)排列更緊密，說(shuō)明糖蜜可溶性固形物濃度相比于FeSO4·7H2O濃度對(duì)γ-PGA產(chǎn)量影響更大。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果驗(yàn)證

回歸方程表明當(dāng)糖蜜可溶性固形物濃度為8.68%、酵母膏濃度4.23 g/L、FeSO4·7H2O濃度為0.78 g/L，味精濃度為80 g/L時(shí)，γ-PGA產(chǎn)量預(yù)測(cè)值最高達(dá)67.17 g/L。為了驗(yàn)證響應(yīng)面分析的準(zhǔn)確性，通過(guò)模擬出的最佳培養(yǎng)基參數(shù)進(jìn)行6次重復(fù)發(fā)酵驗(yàn)證，得到γ-PGA產(chǎn)量平均值為（67.88±0.41）g/L。試驗(yàn)值與預(yù)測(cè)值相差0.71 g/L，有99%的概率接近實(shí)際值，說(shuō)明響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂煽浚瑸楹罄m(xù)發(fā)酵罐放大試驗(yàn)與工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

以甘蔗糖蜜為碳源發(fā)酵γ-PGA，用單因素試驗(yàn)篩選出初始培養(yǎng)基中，對(duì)γ-PGA產(chǎn)量有消極作用或無(wú)顯著影響的因素以提高產(chǎn)量及降低成本，應(yīng)用響應(yīng)面法確定了糖蜜可溶性固形物、酵母膏與FeSO4·7H2O濃度。結(jié)果顯示，最佳培養(yǎng)基為糖蜜可溶性固形物濃度8.68%、酵母膏濃度4.23 g/L、FeSO4·7H2O濃度0.78 g/L，味精濃度80 g/L，在此條件下γ-PGA產(chǎn)量為（67.88±0.41）g/L，相較于優(yōu)化前（31 g/L）優(yōu)化后γ-PGA產(chǎn)量提高了1.19倍。為后續(xù)放大試驗(yàn)與工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，為糖蜜發(fā)酵γ-PGA提供方案。