合成硒代谷胱甘肽釀酒酵母菌株的篩選與發(fā)酵優(yōu)化

何家偉，蔡俊

（發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，工業(yè)微生物湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北工業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430068）

硒是動(dòng)植物必須的營(yíng)養(yǎng)元素[1]。含硒化合物是癌癥治療中的抗氧化劑和化學(xué)預(yù)防劑[2-5]。

在富硒釀酒酵母菌體內(nèi)存在多種有機(jī)硒，其中包括一種具有補(bǔ)硒、抗癌潛力的硒肽物質(zhì)—硒代谷胱甘肽[6]。硒代谷胱甘肽（selenogutathione，GSeH）由 L-谷氨酸、L-硒代半胱氨酸（L-selenocysteine，Sec）和甘氨酸經(jīng)肽鍵脫水縮合而成，是一種在生物體中含量很低的非蛋白類硒基化合物，通常分布于各種富硒植物和富硒菌體中[7-8]。GSeH的高抗氧化能力取決于其合成前體Sec。Sec被證明是各種重要抗氧化硒酶中的關(guān)鍵氨基酸[9-15]，這些硒酶通過(guò)活性位點(diǎn)處的Sec殘基有效減少了過(guò)氧化物[16]。在氧化應(yīng)激條件下，自由基物種對(duì)蛋白質(zhì)和其他大分子的氧化可被抗氧化劑化合物調(diào)節(jié)[17]。谷胱甘肽修復(fù)溶菌酶中的色氨酸自由基的速率常數(shù)為（1.05±0.05）×105L/（mol·s），而硒代谷胱甘肽修復(fù)色氨酸和酪氨酸自由基的速度較谷胱甘肽快約3個(gè)數(shù)量級(jí)[18]?？梢娢入赘孰脑诳寡趸芰ι线h(yuǎn)遠(yuǎn)高于谷胱甘肽。GSeH的高抗氧化能力及補(bǔ)硒功能在制藥行業(yè)有著巨大的潛力。

酵母富硒發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基硫硒比對(duì)菌體的富硒和生長(zhǎng)有很大影響，合適的硫硒比在硒代谷胱甘肽的發(fā)酵生產(chǎn)中尤為關(guān)鍵[19]。硒與硫在菌體吸收過(guò)程中處于競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但硒源和硫源充足的情況下，菌體優(yōu)先吸收硫元素。因此，適當(dāng)降低生長(zhǎng)環(huán)境中硫元素的含量，菌體在滿足生長(zhǎng)的前提下會(huì)吸收更多的硒，并將其轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。過(guò)高的硫含量會(huì)使試驗(yàn)菌株更多地合成谷胱甘肽而非硒代谷胱甘肽，低硫培養(yǎng)的方法能夠極大程度上增加硒代谷胱甘肽產(chǎn)量。現(xiàn)國(guó)內(nèi)已有較多篩選富硒釀酒酵母菌種的研究[20-23]，但對(duì)合成特定硒代產(chǎn)物的釀酒酵母篩選研究較少。本文以19株釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過(guò)耐硒馴化、硫酸二乙酯（diethyl sulphate，DES）誘變、乙硫氨酸抗性篩選以及添硒低硫培養(yǎng)優(yōu)化，成功得到一株富硒能力優(yōu)良的菌株，可利用生物轉(zhuǎn)化途徑將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化得到GSeH，并對(duì)其發(fā)酵進(jìn)行優(yōu)化，以期為開發(fā)富硒產(chǎn)品提供一種安全的抗氧化有機(jī)硒源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌株

19株釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae分別為CGY、CGY2、CCCG、CCY、CLS、CHY、CEPY、CBY、CGWY、CKY、GAQ4、CMY、JYYR、CRY、GAQ1、XHV-25、GAQ2、JYYJS、BDYD：湖北工業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 試劑和培養(yǎng)基

培養(yǎng)基：酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基、YEPD固體培養(yǎng)基、無(wú)氨基酵母氮培養(yǎng)基和無(wú)硫酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基（yeast nitrogen base，YNB）培養(yǎng)基。

亞硒酸鈉、硫酸二乙酯、硝酸、高氯酸、甲酸、3，3-二氨基聯(lián)苯胺、乙硫氨酸、庚烷磺酸鈉、乙腈、三氟乙酸（tallow fatty acid，TFA）、氮乙酰半胱氨酸：美國(guó) Sigma-Aldrich公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR1140電子分析天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；ZSD-1270全自動(dòng)生化培養(yǎng)箱、ZHWY-2012C恒溫振蕩器：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；YXQ-LS-75211立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；3K15低溫高速離心機(jī)：美國(guó)Sigma公司；JY92-11超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；BSC系列生物安全柜：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；MX-S可調(diào)式混勻儀：北京大龍儀器有限公司，Waters QDa MS質(zhì)譜儀、Waters 2545高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種活化

將19株釀酒酵母菌分別接入100 mL YEPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、180 r/min恒溫?fù)u床中活化24 h。

1.3.2 Na2SeO3抗性篩選

將Na2SeO3溶液過(guò)濾除菌，加入到滅菌后尚且呈液體狀態(tài)的YEPD固體培養(yǎng)基中搖勻以保證混合均勻。Na2SeO3濃度按200、400、600 mg/L等梯度遞增至3 000 mg/L。選出在高硒濃度下能夠生長(zhǎng)且菌落較大的菌株，進(jìn)行馴化培養(yǎng)。

1.3.3 富硒釀酒酵母的馴化培養(yǎng)

將篩選出的酵母菌株接種于裝有50mL含50 mg/L Na2SeO3的YEPD培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min下培養(yǎng)。每24 h吸取5 mL菌液轉(zhuǎn)接于含50 mg/L Na2SeO3的新鮮YEPD培養(yǎng)基中，連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)90次。

1.3.4 DES誘變

取馴化培養(yǎng)后的釀酒酵母加入YEPD培養(yǎng)基，30℃、180 r/min下培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期的釀酒酵母發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，用蒸餾水洗3次，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）制成菌懸液。加入1%DES，于30℃、180 r/min培養(yǎng)60 min，之后加入硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，離心去上清液，蒸餾水清洗3次，用于下一步抗性平板涂布。

1.3.5 乙硫氨酸抗性篩選

將濾膜除菌后的乙硫氨酸加入到滅菌后尚且呈液體狀態(tài)的YNB固體培養(yǎng)基中混勻，乙硫氨酸濃度按2、4、6、8、10 mg/L。將 DES 誘變后的菌株加入 5 mL YEPD培養(yǎng)基，培養(yǎng)16 h后離心收集菌體，蒸餾水清洗3次后，稀釋涂布于乙硫氨酸抗性平板。同時(shí)對(duì)未誘變處理的酵母培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋涂布于該平板上，取在乙硫氨酸最高抗性平板上長(zhǎng)出的菌落，在無(wú)硫YNB培養(yǎng)基上進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.3.6 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)探究發(fā)酵溫度、亞硒酸鈉添加時(shí)間、初始pH值、搖床轉(zhuǎn)速、接種量、裝液量對(duì)釀酒酵母菌株CMY-15-1發(fā)酵硒代谷胱甘肽產(chǎn)量的影響。每組試驗(yàn)做3次平行。

1.3.7 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化試驗(yàn)

采用單因素法優(yōu)選CMY-15-1菌株產(chǎn)硒代谷胱甘肽的培養(yǎng)基條件，探究最優(yōu)碳源、最優(yōu)氮源、最優(yōu)無(wú)機(jī)鹽和最優(yōu)亞硒酸鈉添加量等條件。每組試驗(yàn)做3次平行。

1.3.8 應(yīng)用于生物過(guò)程優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.3.8.1 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選取葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鉀、氯化銨、氯化鎂、氯化鈣、亞硒酸鈉8個(gè)成分，用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)表，篩選出對(duì)CMY-15-1菌株產(chǎn)硒代谷胱甘肽影響比較顯著的因素。發(fā)酵條件為優(yōu)化后的試驗(yàn)條件。

1.3.8.2 最陡爬坡試驗(yàn)

以PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)篩選出的顯著性因素為基礎(chǔ)，對(duì)其最佳值區(qū)域進(jìn)行確定，為后續(xù)的中心復(fù)合設(shè)計(jì)提供試驗(yàn)依據(jù)。依據(jù)顯著性因素的正負(fù)效應(yīng)，設(shè)計(jì)合理的步長(zhǎng)，增加試驗(yàn)的密集度，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)表。發(fā)酵條件為優(yōu)化后的試驗(yàn)條件。

1.3.8.3 中心復(fù)合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果，采用三因素五水平的CCD優(yōu)化試驗(yàn)來(lái)確定CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽的最佳培養(yǎng)基組成。

1.3.9 釀酒酵母生物量的測(cè)定

發(fā)酵液于8 000 r/min離心10 min，蒸餾水清洗3次后收集菌體，80℃烘干至恒重，釀酒酵母生物量=釀酒酵母菌體質(zhì)量/發(fā)酵液體積。

1.3.10 有機(jī)硒測(cè)定

烘干硒酵母樣品有機(jī)硒含量按照GB 5009.93—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測(cè)定》中熒光分光光度法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.11 高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定谷胱甘肽和GSeH含量

取發(fā)酵后的菌體進(jìn)行破壁處理，取破壁前后菌體用血球板計(jì)數(shù)法測(cè)定破壁率。破壁后離心取上清液并過(guò)0.22 μm濾膜。取谷胱甘肽標(biāo)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線（以谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)），測(cè)定谷胱甘肽含量。利用電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）質(zhì)譜通過(guò)SIR模式標(biāo)定特征分子量355表征硒代谷胱甘肽出峰時(shí)間。CMY-15-1內(nèi)不含有N-乙酰-半胱氨酸，其具有硒代谷胱甘肽類似的結(jié)構(gòu)且出峰時(shí)間與被檢測(cè)物不重疊，可用其作為內(nèi)標(biāo)物，以峰面積作為參照指標(biāo)，用于定量樣品內(nèi)硒代谷胱甘肽含量。

高效液相色譜條件：inertsil ODS-VPC18柱（4.6mm×250 mm，5 μm），柱溫為 25 ℃，進(jìn)樣量 20 μL。流動(dòng)相為乙腈-TFA-水溶液，流量0.6 mL/min；梯度洗脫程序?yàn)?0～3 min 乙腈-TFA-水溶液（體積比 1.0∶0.1∶98.9），3 min～10 min 乙腈-TFA-水溶液（40.0∶0.1∶59.9），10 min～15min 乙腈-TFA-水溶液（體積比 1.0∶0.1∶98.9）。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離源正離子模式ESI+，選擇監(jiān)測(cè)模式Scan，噴霧電壓5.5 kV，霧化氣流量15 L/h，離子源溫度500℃，錐孔電壓15 V，碰撞氣體為氮?dú)猓瑪?shù)據(jù)采集掃描時(shí)間20 ms。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin 8.0軟件、Design Expert 10進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐硒酵母菌株篩選及馴化

硒標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，耐硒酵母馴化與未馴化菌株的生物量和有機(jī)硒含量比較見表1。

圖1 四價(jià)硒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of tetravalent selenium

表1 耐硒酵母馴化與未馴化菌株的生物量和有機(jī)硒含量比較Table 1 Comparison of biomass and organic selenium content of Se-tolerant yeast with and without Se-tolerant strains

由表1可知，對(duì)19株釀酒酵母菌株進(jìn)行耐硒篩選，得到4株釀酒酵母菌株能在濃度3 000 mg/L Na2SeO3的YEPD固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，分別是CMY、JYYR、BDYD和XHV-25。在經(jīng)過(guò)耐硒馴化培養(yǎng)后，馴化菌株CMY-1、JYYR-1、BDYD-1和 XHV-25-1 和原菌株于200 mg/L Na2SeO3YEPD培養(yǎng)基發(fā)酵24 h，其合成有機(jī)硒能力和生物量均有所提高。其中CMY-1產(chǎn)有機(jī)硒能力最強(qiáng)，較未馴化CMY有機(jī)硒含量提高165.6%，比XHV-25高出4.75倍。具有高耐硒能力的菌株，其積累硒的能力和將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒能力都較強(qiáng)[24]。

2.2 DES誘變結(jié)果

DES誘變后與出發(fā)菌株的生物量和有機(jī)硒產(chǎn)量比較結(jié)果見表2。

表2 DES誘變后與出發(fā)菌株的生物量和有機(jī)硒產(chǎn)量比較Table 2 Comparison of biomass and organic selenium yield between DES mutagenesis and original strain

2.3 乙硫氨酸抗性篩選結(jié)果

谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，CMY-15-1破壁上清液高效液相色譜圖見圖3，CMY-15-1破壁上清液質(zhì)譜圖見圖4。乙硫氨酸抗性篩選后與出發(fā)菌株的GSH和GSeH含量比較結(jié)果見表3。

圖2 谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of glutathione

圖3 CMY-15-1破壁上清液高效液相色譜圖Fig.3 High performance liquid chromatography diagram of CMY-15-1 wall broken supernatant

圖4 CMY-15-1破壁上清液質(zhì)譜圖Fig.4 Mass Spectrometry diagram of CMY-15-1 wall broken supernatant

表3 乙硫氨酸抗性篩選后與出發(fā)菌株的GSH和GSeH含量比較Table 3 Comparison of GSH and GSeH contents after screening for ethionine resistance with those of the original strain

由表3可知，相較未篩選前，谷胱甘肽含量提高60.4%。谷胱甘肽在釀酒酵母內(nèi)由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylsysteine synthetase，γ-GCS）GSH1 和谷胱甘肽合成酶（glutashione synthetase，GS）GSH2 催化合成，GSH1是該反應(yīng)的調(diào)節(jié)酶，受終產(chǎn)物谷胱甘肽反饋抑制。乙硫氨酸是谷胱甘肽合成途徑中的前體類似物[25]，其能與GSH1酶相結(jié)合，卻又不能參與蛋白質(zhì)合成，其在胞內(nèi)濃度不會(huì)下降，因此GSH1酶無(wú)法恢復(fù)正常酶活，使菌體無(wú)法合成谷胱甘肽。通過(guò)誘變后乙硫氨酸抗性篩選得到的釀酒酵母菌株，能在很大程度上解除谷胱甘肽對(duì)GSH1的反饋抑制，從而提高谷胱甘肽的產(chǎn)量。硒是硫的類似物，硒和硫在釀酒酵母體內(nèi)的代謝途徑是相似的[26]，該抗性篩選同樣也能增加胞內(nèi)GSeH的積累。

2.4 發(fā)酵條件的單因素優(yōu)化

發(fā)酵條件單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖5～圖10。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)CMY-1-15菌株GSeH產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖6 亞硒酸鈉添加時(shí)間對(duì)CMY-1-15菌株GSeH產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of sodium selenite addition time on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖7 pH值對(duì)CMY-1-15菌株GSeH產(chǎn)量的影響Fig.7 Effect of pH on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖8 轉(zhuǎn)速對(duì)CMY-1-15菌株GSeH產(chǎn)量的影響Fig.8 Effect of rotational speed on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖9 接種量對(duì)CMY-1-15菌株GSeH產(chǎn)量的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

圖10 裝液量對(duì)CMY-1-15菌株GSeH產(chǎn)量的影響Fig.10 Effect of liquid loading amount on the yield of CMY-1-15 strain GSeH

由圖5可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為32℃時(shí)，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為8.76 μg/L。故選擇32℃為最佳發(fā)酵溫度。由圖6可知，不同發(fā)酵時(shí)段添加亞硒酸鈉，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量也不同，當(dāng)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)5 h時(shí)添加亞硒酸鈉，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為9.73 μg/L，故選擇發(fā)酵5 h添加亞硒酸鈉為最佳添加亞硒酸鈉時(shí)間。由圖7可知，當(dāng)初始pH6.0時(shí)，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為9.95 μg/L，此后，隨著初始pH值的升高，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量反而會(huì)降低，故最佳初始pH值為6.0。由圖8可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min時(shí)，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為10.50 μg/L，故最佳搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。由圖9可知，當(dāng)接種量為7%時(shí)，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到最大值為11.13 μg/L，故選擇最佳接種量為7%。由圖10可知，當(dāng)裝液量為75 mL時(shí)，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量達(dá)到最大值，為11.38 μg/L，故選擇最佳裝液量為75 mL。

2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

發(fā)酵條件培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果見圖11～圖18，復(fù)合氮源對(duì)硒代谷胱甘肽產(chǎn)量的影響結(jié)果見表4。

圖11 碳源種類對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.11 Effects of carbon source types on GSeH yield

圖12 最優(yōu)碳源添加量對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.12 Effect of optimal carbon source addition on GSeH yield

圖13 有機(jī)氮源種類對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.13 Effect of organic nitrogen source types on GSeH yield

圖14 無(wú)機(jī)氮源種類對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.14 Effect of inorganic nitrogen source types on GSeH yield

由圖14可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基無(wú)機(jī)氮源為氯化銨時(shí)，胞內(nèi)硒代谷胱甘肽產(chǎn)量最高為7.38 μg/L，故選擇氯化銨為最佳無(wú)機(jī)碳源。

圖15 蛋白胨添加量對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.15 Effect of peptone dosage on GSeH yield

圖16 Na2SeO3添加量對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.16 Effect of Na2SeO3addition on GSeH yield

圖17 無(wú)機(jī)鹽種類對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.17 Effects of inorganic salts on GSeH yield

圖18 酵母粉添加量對(duì)GSeH產(chǎn)量的影響Fig.18 Effect of yeast powder addition on GSeH yield

表4 復(fù)合氮源對(duì)硒代谷胱甘肽產(chǎn)量的影響Table 4 Influence of compound nitrogen source on selenoglutathione yield

由圖11可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源為葡萄糖時(shí)，胞內(nèi)硒代谷胱甘肽產(chǎn)量最高為11.25 μg/L，故選擇葡萄糖為最佳碳源。

由圖12可知，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到35 g/L時(shí)，硒代谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到最大值為14.38 μg/L，故選擇葡萄糖最佳添加量為35 g/L。

由圖13可知，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基有機(jī)氮源為蛋白胨時(shí)，胞內(nèi)硒代谷胱甘肽產(chǎn)量最高為11.29 μg/L，故選擇蛋白胨為最佳有機(jī)碳源。

由圖15可知，當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿繛?0 g/L時(shí)，硒代谷胱甘肽產(chǎn)量最大，為19.55 μg/L。隨著蛋白胨添加量的逐漸增加，硒代谷胱甘肽產(chǎn)量隨之降低，硫元素和硒元素在釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)是一種代謝競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，當(dāng)環(huán)境中大量存在硫元素時(shí)，釀酒酵母會(huì)更傾向于吸收利于細(xì)胞生長(zhǎng)的含硫物質(zhì)，不利于有機(jī)硒類物質(zhì)的合成。硫作為各種蛋白質(zhì)和酶類物質(zhì)的關(guān)鍵元素，缺少硫元素卻會(huì)使菌株難以大量生長(zhǎng)。故發(fā)酵培養(yǎng)基需要選擇合適的硫硒比，在不影響菌株生長(zhǎng)的情況下，盡可能的合成更多的硒代谷胱甘肽。

有機(jī)氮源往往都含有不少硫元素，此時(shí)可以選擇無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源作為復(fù)合氮源。由表4可知，利用蛋白胨和氯化銨作為復(fù)合氮源，蛋白胨10 g/L，氯化銨7 g/L時(shí)，此時(shí)硒代谷胱甘肽產(chǎn)量最高為27.33 μg/L。

由圖16可知，當(dāng)亞硒酸鈉添加量達(dá)到150 mg/L時(shí)，硒代谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到最大值為28.73 μg/L。相關(guān)文獻(xiàn)表明[27]，亞硒酸鈉對(duì)菌株有一定毒性，添加過(guò)多的無(wú)機(jī)硒會(huì)導(dǎo)致菌株生長(zhǎng)量下降，并在同時(shí)菌體會(huì)產(chǎn)生一種應(yīng)激機(jī)制，將有機(jī)硒代謝為對(duì)菌體無(wú)害的單質(zhì)硒。故硒代谷胱甘肽產(chǎn)量趨勢(shì)為先上升后下降。

由圖17可知，磷酸氫二鉀、氯化鎂、氯化鈣都能較好的促進(jìn)CMY-15-1菌株產(chǎn)硒代谷胱甘肽，硒代谷胱甘肽產(chǎn)量分別為 26.34 μg/L、26.93 μg/L、26.56 μg/L。故選擇磷酸氫二鉀、氯化鎂、氯化鈣作為無(wú)機(jī)鹽進(jìn)行后續(xù)Plackett-Burman設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

由圖18可知，隨著酵母粉添加量的提高，硒代谷胱甘肽的產(chǎn)量也逐漸提高，當(dāng)酵母粉添加量達(dá)到8 g/L時(shí)，硒代谷胱甘肽產(chǎn)量達(dá)到最大值為31.43 μg/L。因?yàn)榻湍阜壑幸餐瑯雍休^多的硫元素，與硒元素產(chǎn)生代謝競(jìng)爭(zhēng)，但同時(shí)酵母粉中又含有大量微量元素，這對(duì)菌株的生長(zhǎng)起到至關(guān)重要的作用，故硒代谷胱甘肽產(chǎn)量趨勢(shì)為先上升后下降。

2.6 應(yīng)用于生物過(guò)程優(yōu)化的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.6.1 PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)

本試驗(yàn)以上述碳源、氮源和金屬離子優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，對(duì)影響釀酒酵母CMY-15-1菌株產(chǎn)硒代谷胱甘肽的因素進(jìn)行考察，這些因素分別是葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、磷酸氫二鉀、氯化銨、氯化鎂、氯化鈣、亞硒酸鈉。使用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察8個(gè)組分的重要性，每個(gè)因素取高低兩個(gè)水平，每組試驗(yàn)做3次平行，PB試驗(yàn)用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)如表5。

表5 PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 5 Factors and levels of PB design test

通過(guò)對(duì)上述試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行分析，可以基本確定PB試驗(yàn)所需的培養(yǎng)基組分，然后通過(guò)PB試驗(yàn)篩選得到培養(yǎng)基對(duì)釀酒酵母菌株CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽有顯著性影響的組分，以便對(duì)培養(yǎng)基的組分進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。按照軟件設(shè)計(jì)PB試驗(yàn)，試驗(yàn)12次，每組3個(gè)平行，按照表5中的組分配制培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定硒代谷胱甘肽含量，試驗(yàn)結(jié)果見表6～表8。

表6 PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Results of PB design test

表7 PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)的回歸分析Table 7 Regression analysis of the PB design test

表8 PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方差分析Table 8 Analysis of variance for the PB design test

由表7和表8可知，該試驗(yàn)設(shè)計(jì)的回歸模型的P值（prob＞F）＜0.05，表明該模型顯著。蛋白胨、亞硒酸鈉和氯化銨的P值在95%的置信區(qū)間內(nèi)是小于0.05的，說(shuō)明蛋白胨、亞硒酸鈉和氯化銨這3種培養(yǎng)基組成成分是影響釀酒酵母CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽的主要因子，確定此3個(gè)因素為響應(yīng)面試驗(yàn)的3個(gè)試驗(yàn)變量。其中蛋白胨為負(fù)效應(yīng)，亞硒酸鈉、氯化銨為正效應(yīng)。該模型顯著，其決定系數(shù)R2=0.986 6，說(shuō)明此模型中98.66%的變量可通過(guò)此模型來(lái)解釋。

2.6.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到影響釀酒酵母CMY-15-1菌株產(chǎn)硒代谷胱甘肽的顯著因素，其中蛋白胨為負(fù)效應(yīng)，亞硒酸鈉、氯化銨為正效應(yīng)，按照各因素正負(fù)效應(yīng)來(lái)設(shè)定最陡爬坡試驗(yàn)。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表9。

表9 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 9 Test design of steepest climb

由表9可知，當(dāng)?shù)鞍纂?、亞硒酸鈉、氯化銨添加量為7 g/L、180 mg/L、8.2 g/L時(shí)，釀酒酵母菌株CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽含量最高，達(dá)到31.32 μg/L，將其作為中心復(fù)合試驗(yàn)的中心點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化組分添加量。

2.6.3 中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)

通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)得到中心點(diǎn)為蛋白胨添加量7 g/L，亞硒酸鈉添加量180 mg/L，氯化銨8.2 g/L，以此為中心點(diǎn)以硒代谷胱甘肽產(chǎn)量為響應(yīng)值進(jìn)行三因素五水平的中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，各因素水平如表10所示。

表10 CCD設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素與水平Table 10 Factors and levels of CCD design test

以試驗(yàn)結(jié)果表中的硒代谷胱甘肽作為相應(yīng)量，利用軟件Design-Expert構(gòu)建二次式模型，模型方程為R1=30.72-4.28A+2.30B+1.22C-1.24AB-0.84AC+0.34BC-3.86A2-2.63B2-1.83C2，其中R2=0.9955。由二價(jià)多項(xiàng)式分析表可知方程中 A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2各項(xiàng)的 P 值均小于0.05。這說(shuō)明以上各項(xiàng)對(duì)CMY-15-1菌株產(chǎn)硒代谷胱甘肽有顯著性影響。失擬項(xiàng)檢驗(yàn)值為0.107 1＞0.05，這說(shuō)明模型能與數(shù)據(jù)準(zhǔn)確擬合。

表11 CCD設(shè)計(jì)試驗(yàn)與結(jié)果Table 11 CCD design test and results

表12 二價(jià)多項(xiàng)式回歸分析Table 12 Regression analysis of divalent polynomial

經(jīng)回歸方程的方差分析結(jié)果驗(yàn)證表明，模型的P值＜0.05，方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性，說(shuō)明該模型與試驗(yàn)值擬合較好，適用于CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽的理論預(yù)測(cè)。蛋白胨和亞硒酸鈉、蛋白胨和氯化銨之間存在顯著交互作用，通過(guò)軟件對(duì)回歸方程中AB、AC交互項(xiàng)繪制響應(yīng)面分析圖，見圖19～圖20。

圖19 蛋白胨和Na2SeO3的交互作用對(duì)CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽的影響Fig.19 Effect of the interaction of peptone and Na2SeO3on the production of selenoglutathione by CMY-15-1

圖20 蛋白胨和NH4Cl的交互作用對(duì)CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽的影響Fig.20 Effect of the interaction of peptone and NH4Cl on the production of selenoglutathione by CMY-15-1

由模型和軟件分析可知蛋白胨5.46 g/L，亞硒酸鈉205.9 mg/L，氯化銨9.56 g/L為最佳添加量。在此預(yù)測(cè)最優(yōu)培養(yǎng)基組分下硒代谷胱甘肽產(chǎn)量為33.46 μg/L。

2.6.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

用CCD設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到的最佳培養(yǎng)基組成：蛋白胨5.46 g/L、亞硒酸鈉205.9 mg/L、氯化銨9.56 g/L、葡萄糖35 g/L，酵母粉8 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，氯化鎂0.5 g/L，氯化鈣0.5 g/L做3次重復(fù)試驗(yàn)，平均硒代谷胱甘肽產(chǎn)量 33.71 μg/L。實(shí)測(cè)值與回歸方程預(yù)測(cè)值（33.46 μg/L）吻合良好。

3 結(jié)論

本研究利用實(shí)驗(yàn)室19株釀酒酵母作為起始菌株，通過(guò)耐硒馴化、DES誘變和乙硫氨酸抗性篩選，獲得了一株富硒能力強(qiáng)的菌株CMY-15-1，其有機(jī)硒含量達(dá)到2 663.3 μg/g。單因素試驗(yàn)確定CMY-15-1最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度32℃、亞硒酸鈉添加時(shí)間為發(fā)酵后5 h、初始 pH6.0、搖床轉(zhuǎn)速 200 r/min、接種量 7%、裝液量75 mL。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，通過(guò)單因素試驗(yàn)篩選出最佳碳源、有機(jī)氮源和無(wú)機(jī)氮源、無(wú)機(jī)鹽等成分，并優(yōu)化了亞硒酸鈉添加量。通過(guò)PB設(shè)計(jì)試驗(yàn)有效篩選出對(duì)釀酒酵母CMY-15-1產(chǎn)硒代谷胱甘肽有顯著性影響的成分，通過(guò)最陡爬坡試驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中這些組分的添加量，最后由中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成為蛋白胨5.46 g/L、亞硒酸鈉205.9 mg/L、氯化銨9.56 g/L、葡萄糖35 g/L、酵母粉8 g/L、磷酸氫二鉀0.5 g/L、氯化鎂0.5 g/L、氯化鈣0.5 g/L，測(cè)得硒代谷胱甘肽含量為 33.71 μg/L，預(yù)測(cè)值為 33.46 μg/L，結(jié)果相差不大，說(shuō)明采用上述一系列優(yōu)化方法得到的試驗(yàn)結(jié)果是合理可靠的，優(yōu)化后的硒代谷胱甘肽產(chǎn)量是優(yōu)化前的3.94倍左右。

在本試驗(yàn)中，過(guò)高的硫含量會(huì)使試驗(yàn)菌株更多的合成谷胱甘肽而非硒代谷胱甘肽，復(fù)合氮源低硫培養(yǎng)的方法能夠極大程度上增加硒代谷胱甘肽產(chǎn)量。這為富硒釀酒酵母菌種發(fā)酵生產(chǎn)硒代谷胱甘肽提供了一定的理論依據(jù)。