貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏品質(zhì)的影響

趙煥蘭，曹嘉燦，劉奎，范葉珍，苗敏

（合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601）

櫻桃番茄又稱圣女果、小番茄，果實營養(yǎng)豐富，酸甜適口，是一種廣受歡迎的果蔬；因其具有多汁、皮薄、組織柔軟等特性采后易受到機(jī)械損傷，而損傷后的果實極易遭受微生物侵染，使其在貯藏期間容易發(fā)生腐爛變質(zhì)[1-3]。同時貯藏期間易出現(xiàn)失水現(xiàn)象，造成表皮皺縮，使得口感和品相欠佳，降低其食用價值和商品價值[4-5]，因此尋找安全有效的保鮮方式延長櫻桃番茄的貯藏期具有重要意義。目前對包括櫻桃番茄在內(nèi)的果蔬保鮮措施已有廣泛的研究，主要措施包括化學(xué)方法（化學(xué)防腐劑）[2，6]、物理方法（低溫冷藏，熱處理，輻射）[7-9]、生物方法（植物抑菌物，拮抗微生物）[10-13]。

隨著人們對綠色環(huán)保和食品安全的不斷追求，安全無害的生物保鮮技術(shù)成為研究熱點(diǎn)。在生物保鮮技術(shù)中，拮抗微生物因分布廣泛、獲取容易、培養(yǎng)經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)一直廣受關(guān)注。然而實際應(yīng)用過程中直接將拮抗微生物作為保鮮劑具有一定的局限性，若受到污染或是接觸不良環(huán)境都會使保鮮效果大打折扣，發(fā)酵液即拮抗微生物（生防菌）在適宜培養(yǎng)基內(nèi)生長后濾除菌體的培養(yǎng)液，其含有大量的活性代謝產(chǎn)物，因此將發(fā)酵液作為保鮮劑是更佳的保鮮措施[14-15]。生防菌發(fā)酵液在眾多領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用，尤其是在果蔬采后保鮮方面。而細(xì)菌是目前研究最普遍，應(yīng)用最廣的一類拮抗微生物，常見的有假單胞菌和芽孢桿菌，其中新型生防菌貝萊斯芽孢桿菌在近幾年引起了人們廣泛地研究，文獻(xiàn)[16]發(fā)現(xiàn)一株貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵液對櫻桃番茄的自然腐敗有抑制作用，并且能延緩質(zhì)量損失，但對于保鮮指標(biāo)測量相對較少。

本研究前期分離鑒定得到一株貝萊斯芽孢桿菌，命名為A4。在此基礎(chǔ)上以A4發(fā)酵液為研究對象，探究其對櫻桃番茄貯藏品質(zhì)的影響。選取腐爛率及失重率，物性（硬度、脆性、緊實度），可溶性固形物、可滴定酸、類黃酮、番茄紅素及酚類物質(zhì)含量為評價指標(biāo)，以更全面地評判番茄品質(zhì)變化及A4發(fā)酵液的保鮮效果，最后初步探究發(fā)酵液作用的保鮮機(jī)理。本研究為貝萊斯芽孢桿菌的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，為櫻桃番茄采后貯藏保鮮提供新技術(shù)思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）A4：合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院生物實驗室前期分離鑒定并保存。櫻桃番茄：市售，果實新鮮無傷，大小均勻一致。

胰蛋白胨、酵母提取物：BioFroxx公司；NaCl、NaOH、硫代巴比妥酸、三氯乙酸、硼酸、沒食子酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）試劑盒、過氧化物酶（peroxidase，POD）試劑盒：南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ZWY-1102雙層大容量恒溫?fù)u床：中國合肥啟誠生物科技有限公司；mls-3750高壓蒸汽滅菌鍋：日本三洋公司；ST8R低溫高速大離心機(jī)：賽默飛世爾科技公司；PK-S22恒溫水浴鍋：中國上海精宏實驗設(shè)備有限公司；Multiskan GO全波長酶標(biāo)儀：北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司；TA.XTplus物性測試儀：英國Stable公司。

1.3 方法

1.3.1 A4除臭發(fā)酵液的制備

參考文獻(xiàn)[17]的方法配制除臭發(fā)酵培養(yǎng)基（10 g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/LNaCl、葡萄糖20g/L，ddH2O定容至1 L，121℃滅菌20 min）。菌種活化后培養(yǎng)至濃度在600nm下的吸光度為0.6（OD600nm=0.6），轉(zhuǎn)接于除臭發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為0.5%，37℃、180 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)48 h，真空泵抽濾去除菌體，所得發(fā)酵液保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 櫻桃番茄保鮮試驗處理

參考文獻(xiàn)[18]對櫻桃番茄進(jìn)行處理：將櫻桃番茄分為兩組，每組4kg，一組浸泡于10%的A4發(fā)酵液中（FJY），另一組浸泡于10%的LB培養(yǎng)基（10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，ddH2O 定容至 1 L，121℃滅菌20 min）中作為對照（CK）。10 min后取出自然晾干，裝入保鮮盒，25℃，80%～90%相對濕度條件下貯藏。1.3.3 腐爛率及失重率的測定

參考文獻(xiàn)[19]方法，每2 d測量每組櫻桃番茄總質(zhì)量，同時觀察并記錄番茄腐爛個數(shù)，試驗重復(fù)2次。腐爛率和失重率計算公式如下。

1.3.4 硬度、脆性、緊實度的測定

處理方法同1.3.2，間隔2 d各組隨機(jī)選取5個櫻桃番茄樣品，果實赤道處選取2個位置作為測量點(diǎn)，使用質(zhì)構(gòu)儀測量櫻桃番茄的硬度、脆性和緊實度，試驗重復(fù)3次。

1.3.5 可溶性固形物及可滴定酸的測定

1.3.4 中測質(zhì)構(gòu)后的櫻桃番茄樣品用于可溶性固形物及可滴定酸的測定，使用數(shù)顯糖度儀測量其汁液的可溶性固形物含量。取適當(dāng)果肉組織，用液氮冷凍后研磨至細(xì)粉狀，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻(xiàn)[20]的酸堿滴定法測定并計算可滴定酸含量，使用0.01 mol/L NaOH溶液進(jìn)行滴定。

1.3.6 類黃酮、番茄紅素及總酚的測定

參考文獻(xiàn)[21]的方法測定類黃酮的含量，在波長510 nm處測定吸光度，并用蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算類黃酮含量。

參考文獻(xiàn)[22]的方法測定番茄紅素的含量，稱取0.40 g組織粉末，加入4 mL提取液（正己烷∶丙酮∶乙醇的體積比為 2∶1∶1），充分溶解后于冰浴靜置 10 min，取上清液檢測，以正己烷為空白，在波長472 nm處測定吸光度，并計算番茄紅素含量。

參考文獻(xiàn)[21]的方法的測定總酚的含量，在波長735 nm處測定吸光度值，并用沒食子酸做標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚含量。

1.3.7 抗性酶活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）濃度的測定

總SOD活力測定：根據(jù)總超氧化物歧化酶試劑盒說明書配制溶液，參考操作表添加相關(guān)試劑，混勻后，室溫放置10 min，使用酶標(biāo)儀于波長550 nm處測定吸光度。

POD活力測定：根據(jù)過氧化物酶（POD）試劑盒說明書進(jìn)行操作，準(zhǔn)確稱取果肉組織0.10 g，加入900 μL濃度為0.05 mol/L pH7磷酸鹽緩沖液，冰水浴條件下制備成10%的組織勻漿液，3 500 r/min離心10 min后，取上清液進(jìn)行POD活力的測定。參考操作表添加相關(guān)試劑，混勻后，3 500 r/min離心10 min，使用酶標(biāo)儀于420 nm處測定吸光度。

參考文獻(xiàn)[23]的方法測定苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）的活力，制備粗酶提取液及硼酸緩沖液，取50 μL的粗酶液，加入150 μL pH8.8的硼酸緩沖液，在波長290 nm處測定起始吸光度及在37℃恒溫箱中放置1 h后的吸光度。

參考文獻(xiàn)[24]測定MDA濃度，采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測定丙二醛（MDA）的濃度。分別檢測在450、532、600 nm 3處波長的吸光度，即可計算出MDA的濃度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS statistics 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，差異顯著性采用鄧肯氏多重比較法，Origin9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果分析

2.1 腐爛率及失重率

A4發(fā)酵液櫻桃番茄貯藏期間腐爛率和失重率的影響如圖1所示。

圖1 A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間腐爛率和失重率的影響Fig.1 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on decay rate and weight loss rate of cherry tomato during storage

由圖1A可知，相同貯藏時間內(nèi)發(fā)酵液處理組的腐爛果實數(shù)量顯著少于對照組，第12天數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，對照組的腐爛率已高達(dá)27.97%，而發(fā)酵液處理組的腐爛率僅為6.38%，顯著低于對照組。由圖1B可知，貯藏30 d后對照組果實已接近全部腐爛變質(zhì)，而處理組仍有相當(dāng)數(shù)量果實處于形態(tài)色澤較好的健康狀態(tài)。表明貝萊斯芽孢桿菌A4的發(fā)酵液具有顯著抑制櫻桃番茄腐爛的作用。

由圖1C可知，櫻桃番茄的失重率隨貯藏時間的延長而逐漸增加，在整個貯藏期間對照組的失重率均顯著高于處理組。這一趨勢表明A4發(fā)酵液能有效降低水分的蒸發(fā)，較好地保持果實質(zhì)量。

2.2 硬度、脆性及緊實度

A4發(fā)酵液對番茄貯藏期間各物性指標(biāo)的影響如圖2所示。

圖2 A4發(fā)酵液對番茄貯藏期間各物性指標(biāo)的影響Fig.2 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on physical properties of cherry tomato during storage

由圖2A、圖2B可知，櫻桃番茄貯藏期間果實硬度和脆性均隨貯藏時間的延長而逐漸降低，貯藏初期（0～2 d），對照組與處理組的硬度及脆性并無明顯差異，但隨著貯藏時間延長，櫻桃番茄果實的硬度及脆性經(jīng)A4發(fā)酵液處理后降低緩慢，得到較好的保持；同時A4發(fā)酵液對果實緊實度的維持效果顯著，隨貯藏時間延長，發(fā)酵液處理組果實的緊實度都顯著高于對照組果實（圖2C）。以上結(jié)果表明，A4發(fā)酵液可以抑制櫻桃番茄物性指標(biāo)的降低，維持較好的感官屬性。

2.3 可溶性固形物及可滴定酸

發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間可溶性固形物和可滴定酸含量的影響如圖3所示。

圖3 A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間可溶性固形物、可滴定酸含量的影響Fig.3 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on the content of soluble solids and titratable acids in cherry tomato during storage

由圖3A可知，櫻桃番茄貯藏期間果實可溶性固形物含量隨貯藏時間的延長而逐漸降低，而經(jīng)A4發(fā)酵液處理的櫻桃番茄果實的可溶性固形物含量降低緩慢，尤其在貯藏期的8 d～12 d，果實的可溶性固形物含量得到較好的保持；果實中可滴定酸含量顯示出同樣的變化趨勢，在貯藏初期發(fā)酵液對可滴定酸的保持作用有限，但隨著貯藏時間延長，發(fā)酵液具有延緩可滴定酸損失的效果（圖3B）。上述結(jié)果表明A4發(fā)酵液能抑制櫻桃番茄可溶性固形物和可滴定酸的含量降低。

2.4 類黃酮、番茄紅素及總酚

由于短期貯藏條件下櫻桃番茄中類黃酮、番茄紅素、總酚的含量變化不大，進(jìn)而延長貯藏時間，測定第6天和第12天上述3項指標(biāo)的變化。A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間類黃酮、番茄紅素及總酚含量的影響如圖4所示。

圖4 A4發(fā)酵液對櫻桃番茄貯藏期間類黃酮、番茄紅素及總酚含量的影響Fig.4 Effects of Bacillus velezensis A4 fermentation supernatant on the content of flavonoids,lycopene,and total phenols in cherry tomato during storage

由圖4可知，貯藏期間發(fā)酵液處理組中櫻桃番茄的類黃酮、番茄紅素和總酚含量均顯著高于對照組，其中發(fā)酵液對總酚含量的保持最為突出。以上結(jié)果表明A4發(fā)酵液能較好地保持櫻桃番茄中類黃酮、番茄紅素、總酚的含量。

2.5 抗性酶活力及丙二醛MDA濃度

抗性酶活力及MDA濃度變化如圖5所示。

由圖5可知，發(fā)酵液處理櫻桃番茄第6天和第12天，果實3種抗性酶活力隨時間的延長而逐漸增加。與對照相比，處理組中總SOD活力雖有增加，但差異較小。而POD活力及PAL活力顯著增加，與對照相比，發(fā)酵液處理櫻桃番茄第12天，POD活力增加了20%，PAL活力增加了32%。櫻桃番茄儲藏期間，果實的MDA濃度隨貯藏時間的延長而逐漸增加，經(jīng)A4發(fā)酵液處理后，MDA濃度增加緩慢。以上結(jié)果表明，A4發(fā)酵液可以增加櫻桃番茄3個抗性酶的活力同時延緩MDA濃度的增加。

3 討論與結(jié)論

本研究為全面評價櫻桃番茄品質(zhì)的變化，選取了3個方面的指標(biāo)，一方面為綜合性評價指標(biāo)（腐爛率和失重率），在采后的運(yùn)輸貯藏等過程中，因呼吸作用、蒸騰作用以及病原微生物侵染等因素的影響，使得櫻桃番茄極易出現(xiàn)失水腐爛等現(xiàn)象，所以失重率和腐爛率能綜合地反映櫻桃番茄品質(zhì)的變化。第二方面是包括硬度、脆性和緊實度在內(nèi)的物性指標(biāo)，物性指標(biāo)是衡量果實本身特性和貯藏過程中果實品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)，如果實抗壓力愈強(qiáng)，果實的硬度就愈大也越耐貯藏。第三方面是風(fēng)味與營養(yǎng)指標(biāo)，包括可溶性固形物、可滴定酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)以及類黃酮、番茄紅素及酚類物質(zhì)的含量，其中可溶性固形物通常包括可溶性糖及果膠營養(yǎng)成分，同時也會一定程度上影響番茄口感，因此可以反應(yīng)番茄的營養(yǎng)和風(fēng)味變化；而可滴定酸是番茄酸味的主要來源，是番茄重要的風(fēng)味指標(biāo)；類黃酮、番茄紅素及酚類物質(zhì)均是重要的抗氧化物質(zhì)，是番茄貯藏后重要的營養(yǎng)指標(biāo)。

結(jié)果表明貝萊斯芽孢桿菌A4發(fā)酵液能顯著降低櫻桃番茄在貯藏期間的腐爛率和失重率、延緩硬度、脆性、緊實度3個物性指標(biāo)的降低、同時較好地維持了可滴定酸、可溶性固形物、類黃酮、番茄紅素、酚類物質(zhì)的含量，保持了番茄的風(fēng)味與營養(yǎng)品質(zhì)。進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn)，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）3種抗性酶的活性在整個貯藏期內(nèi)均高于對照組，而處理組丙二醛（MDA）的濃度上升緩慢，對照組迅速升高。這說明預(yù)先用發(fā)酵液處理的果實在逆境脅迫條件下，防御系統(tǒng)會提高，參與果實防御相關(guān)的酶（SOD、POD、PAL）共同作用，降低 MDA的積累，減少對果實的傷害，從而提高果實抗病性，更好地保持櫻桃番茄的貯藏品質(zhì)。

本研究為發(fā)酵液作為生防制劑的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為果蔬保鮮提供了新的技術(shù)思路?；诒狙芯吭诤罄m(xù)的試驗中可以進(jìn)一步分析鑒定貝萊斯芽孢桿菌A4發(fā)酵液中發(fā)揮主要抑菌作用的有效成分，探究其抑菌機(jī)理并基于此嘗試濃縮、添加適當(dāng)化合物等方法改善發(fā)酵液成分，提高保鮮效果，為生產(chǎn)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。