C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外毒素致小鼠腸道損傷的轉(zhuǎn)錄組分析

張思雨，王玉炯*，曾 瑾*

(1.寧夏大學(xué)西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021)

產(chǎn)氣莢膜梭菌()是一種短桿狀、無(wú)鞭毛、不運(yùn)動(dòng)、有莢膜、可形成內(nèi)生孢子的專性厭氧的革蘭陽(yáng)性菌。該菌能產(chǎn)生至少18種外毒素和酶類；傳統(tǒng)上，依據(jù)其產(chǎn)生的主要致死性毒素與其抗毒素的中和試驗(yàn)可將產(chǎn)氣莢膜梭菌分為A、B、C、D和E 5個(gè)血清型，而在2017年美國(guó)安娜堡舉行的“第十屆梭狀芽胞桿菌分子生物學(xué)及其發(fā)病機(jī)制”國(guó)際會(huì)議上對(duì)該菌的分類擴(kuò)展到7個(gè)類型(A～G)。其中，毒力較強(qiáng)的主要是A型和C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，C型菌株定義為攜帶2個(gè)分型毒素基因(編碼α毒素)和(編碼β毒素)的產(chǎn)氣莢膜梭菌。

該菌引起的多種動(dòng)物的氣性壞疽、腸毒血癥、壞死性腸炎(intestine necrotic, IN)難以預(yù)防和治療，流行范圍廣，從而引起大量的關(guān)注。在產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的人類食源性疾病中，原因通常是病患食用了受到該菌污染的生肉及其制品，這些受污染的食品會(huì)由于不當(dāng)?shù)募庸ず捅４妫斐稍摼拇罅糠敝巢⒎置谕舛舅?，從而引起食源性感染疾病。?jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心(CDC)統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)氣莢膜梭菌病是美國(guó)第二大常見的食源性疾病，占總發(fā)病率的26%。我國(guó)居民飲食結(jié)構(gòu)多以熟食為主，由產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的食源性感染事件較少，但也有相關(guān)的感染食源性疾病暴發(fā)的事件報(bào)道。

產(chǎn)氣莢膜梭菌病在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中的危害性更令人關(guān)注。特別是近年來(lái)“禁抗令”的實(shí)施，伴隨抗生素類生長(zhǎng)促進(jìn)劑從動(dòng)物飼料中撤出，產(chǎn)氣莢膜梭菌所引發(fā)的壞死性腸炎的患病率明顯增加。該菌所產(chǎn)生的外毒素可影響牛、羊、豬以及禽類等幾乎所有的養(yǎng)殖動(dòng)物，患病動(dòng)物往往在短時(shí)間內(nèi)迅速發(fā)病，常常會(huì)出現(xiàn)休克乃至死亡；該病對(duì)幼年動(dòng)物的影響尤為嚴(yán)重，即使是經(jīng)大量抗生素治療后存活下來(lái)的幼畜，也常常會(huì)出現(xiàn)發(fā)育遲緩以及壞死性腸炎的亞臨床現(xiàn)象，而亞臨床感染可以削弱畜禽的生長(zhǎng)速度，降低飼料轉(zhuǎn)化率，減少體重增加，使其養(yǎng)殖生產(chǎn)性能受到嚴(yán)重的影響，并導(dǎo)致重大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)報(bào)道僅C型產(chǎn)氣莢膜梭菌每年給全球家禽業(yè)造成約60億美元的生產(chǎn)損失和控制成本。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是利用其分泌的大量蛋白質(zhì)毒素在人類和動(dòng)物中產(chǎn)生腸道感染、組織毒性以及神經(jīng)反應(yīng)等疾病狀態(tài)的。在一些條件下，人或動(dòng)物攝入產(chǎn)氣莢膜梭菌，或黏附在消化道內(nèi)壁上的該菌過度繁殖，迅速產(chǎn)生多種毒素和侵襲性酶，毒素作用于腸道中的多種靶細(xì)胞上的受體，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而產(chǎn)生多種效應(yīng)。在研究產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的發(fā)病機(jī)制時(shí)，宿主和細(xì)胞敏感性似乎是需要考慮的關(guān)鍵因素，因此，常常選擇產(chǎn)氣莢膜梭菌相關(guān)疾病的體外或動(dòng)物模型解決這個(gè)問題，而發(fā)病機(jī)制作為病理機(jī)制中的初期環(huán)節(jié)，可提供治療該病的重要靶點(diǎn)。而機(jī)體在響應(yīng)產(chǎn)氣莢膜梭菌感染時(shí)，也會(huì)啟動(dòng)免疫應(yīng)答、代謝調(diào)控等一系列復(fù)雜的生物學(xué)過程。在這其中，涉及大量調(diào)控反應(yīng)的相關(guān)蛋白的表達(dá)，以及關(guān)鍵信號(hào)通路的激活或抑制。目前，隨著現(xiàn)代技術(shù)的日益發(fā)展，越來(lái)越多的研究者采用高通量測(cè)序技術(shù)分析基因表達(dá)和信號(hào)通路富集情況，探究病原菌致病的分子機(jī)制，挖掘關(guān)鍵基因作為靶點(diǎn)。比如劉樂文對(duì)感染腸炎沙門菌雞的盲腸組織進(jìn)行mRNA與miRNA測(cè)序，分析后發(fā)現(xiàn)：表達(dá)上調(diào)的mRNA包含169個(gè)表達(dá)下調(diào)miRNA的靶基因，主要富集在免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、細(xì)菌防御反應(yīng)、Toll樣受體信號(hào)通路等與機(jī)體免疫相關(guān)的生物學(xué)過程。張旭等對(duì)感染鴨腸炎病毒的櫻桃谷鴨的十二指腸組織進(jìn)行測(cè)序，通過GO和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要富集在NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等。也有關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的轉(zhuǎn)錄組研究，比如姜天團(tuán)對(duì)灌服C型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)菌液的仔豬回腸組織進(jìn)行蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)能量代謝、免疫響應(yīng)、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、腸道炎癥等方面的變化可能介導(dǎo)仔豬對(duì)C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐受性或易感性。但是，產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病因子是其產(chǎn)生的多種外毒素和侵襲酶，該菌所分泌的毒素種類和數(shù)量受培養(yǎng)基成分、pH以及培養(yǎng)溫度等條件的影響而具有顯著的差異；同時(shí)還受到菌體VirS/VirR毒力調(diào)節(jié)系統(tǒng)以及Agr群體傳感系統(tǒng)的影響。因此，本研究規(guī)避了產(chǎn)氣莢膜梭菌的產(chǎn)毒條件所帶來(lái)的干擾，直接采用經(jīng)腦心浸液中培養(yǎng)的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清感染小鼠，通過RNA-seq技術(shù)對(duì)腸道組織轉(zhuǎn)錄組的變化進(jìn)行分析，篩選差異表達(dá)基因，通過GO功能注釋和KEGG通路富集篩選關(guān)鍵信號(hào)通路，以期為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌外毒素致機(jī)體損傷的致病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)6周齡BALB/c雌性小鼠，體質(zhì)量均為20 g左右，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常溫培養(yǎng)于12 h明暗交替的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，保證其自由飲水、攝食。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)3～5 d后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 菌株與試劑 產(chǎn)氣莢膜梭菌中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)株C59-2(C型)由本實(shí)驗(yàn)室保存，腦心浸液培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)OXOID公司，產(chǎn)氣莢膜梭菌B型菌株鑒定血清和C型菌株鑒定血清均來(lái)自于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，1K19單克隆抗體和2G7單克隆抗體均由本實(shí)驗(yàn)室制得。

1.2 方法

1.2.1 毒素蛋白表達(dá)檢測(cè) 將產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2菌株復(fù)壯后培養(yǎng)于腦心浸液培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至第4代，離心菌液收集培養(yǎng)上清，并通過0.22 μm細(xì)菌濾器過濾獲得上清，加入2×蛋白上樣緩沖液，于100 ℃金屬浴中煮5 min，制得蛋白免疫印跡樣品。樣品分別經(jīng)過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗(具體見圖1圖注)、洗滌、孵育二抗(山羊抗鼠IgG，Proteintech)、洗滌以及顯影過程，以分析毒素蛋白表達(dá)情況。

1.2.2 樣本采集 產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2培養(yǎng)上清經(jīng)0.22 μm濾器過濾后備用；以不同劑量(10、20、40、80 μL)的培養(yǎng)上清對(duì)BALB/c小鼠腹腔注射進(jìn)行攻毒，每組設(shè)置4只小鼠，24 h后觀察小鼠死亡情況。發(fā)現(xiàn)當(dāng)注射培養(yǎng)上清的劑量為20 μL時(shí)BALB/c小鼠全部死亡，即絕對(duì)致死量LD為20 μL，因而確定在后續(xù)試驗(yàn)中每只小鼠的最佳攻毒劑量為20 μL。對(duì)照組和處理組各隨機(jī)設(shè)置10只小鼠，處理組小鼠腹腔注射新鮮制備并稀釋的培養(yǎng)上清20 μL(原液)，對(duì)照組注射等體積腦心浸液培養(yǎng)基。在處理組小鼠出現(xiàn)瀕臨死亡狀態(tài)時(shí)解剖各組小鼠，快速收集小腸(空腸)病變部位于液氮速凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱待用。

1.2.3 總RNA提取 取兩組小鼠的腸道組織，使用RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，QIAGEN，德國(guó))，按照說(shuō)明書分別提取每個(gè)樣品的總RNA，并通過超微量分光光度計(jì)(Nanodrop 8000)檢測(cè)RNA的濃度及純度，通過Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測(cè)RNA完整性。

1.2.4 測(cè)序及原始數(shù)據(jù)質(zhì)控 每個(gè)樣品構(gòu)建一個(gè)文庫(kù)，庫(kù)檢合格后，通過Illumina測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。經(jīng)過原始數(shù)據(jù)過濾、測(cè)序錯(cuò)誤率檢查、GC含量分布檢查，獲得后續(xù)分析使用的clean reads。并且使用HISAT2軟件將質(zhì)控后的clean reads與參考基因組進(jìn)行精確的比對(duì)，以獲取reads在參考基因組上的定位信息。進(jìn)而采用Subread軟件中的Feature Counts工具，根據(jù)獲取的位置信息統(tǒng)計(jì)每個(gè)基因從起始到終止范圍內(nèi)覆蓋的reads數(shù)。過濾掉不合格數(shù)據(jù)后進(jìn)行定量分析，以及后續(xù)的差異分析和富集分析。

1.2.5 差異表達(dá)基因分析 完成基因表達(dá)定量后，通過DESeq2對(duì)其表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，篩選樣本在不同狀態(tài)下表達(dá)水平顯著差異的基因。并且引入adj對(duì)假設(shè)檢驗(yàn)的-value進(jìn)行校正，從而控制假陽(yáng)性的比例。篩選標(biāo)準(zhǔn)為| lb(FoldChange)| ≥1.5，adj<0.05。

1.2.6 富集分析 采用cluster Profiler軟件對(duì)差異基因集進(jìn)行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析等，篩選得到生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用的信號(hào)通路和相關(guān)分子途徑。

1.2.7 q-PCR驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果 在“1.2.5”篩選結(jié)果中隨機(jī)選取上調(diào)表達(dá)以及下調(diào)抑制基因各5個(gè)，使用Primer BLAST網(wǎng)站設(shè)計(jì)引物(表1)。將測(cè)序送樣后所剩余的RNA通過TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA，以-作為內(nèi)參基因，通過Quant Studio 5儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，采用2法分析數(shù)據(jù)，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清中的毒素蛋白表達(dá)檢測(cè)

通過“1.2.1”方法分析毒素蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果表明，產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2菌株經(jīng)腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)后上清中具有外毒素，包括Alpha毒素(較少)和Beta1毒素(圖1)，符合C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分型條件。

A. 孵育識(shí)別Alpha毒素的B型菌株鑒定血清；B. 孵育識(shí)別Alpha毒素的C型菌株鑒定血清；C. 孵育識(shí)別Beta1毒素的1K19單克隆抗體；D. 孵育識(shí)別Beta2毒素的2G7單克隆抗體；M. 蛋白相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. BL21(DE3)pET-32a誘導(dǎo)后全菌液；2.液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)上清；3.腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)上清A. Type B strain identification serum(recognizes Alpha toxin); B. Type C strain identification serum (recognizes Alpha toxin); C. 1K19(recognizes Beta1 toxin); D. 2G7(recognizes Beta2 toxin); M. Protein marker; 1. BL21(DE3)pET-32a Whole bacterial solution after induction; 2. Culture supernatant of fluid thioglycollate medium; 3. Culture supernatant of brain heart infusion medium圖1 檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌C59-2菌株通過腦心浸液培養(yǎng)基培養(yǎng)后毒素的蛋白表達(dá)情況Fig.1 Detection of protein expression of toxin in Clostridium perfringens C59-2 strain cultured in brain heart media

2.2 腹腔注射產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清后小鼠觀察結(jié)果

產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清對(duì)BALB/c小鼠的LD為20 μL(表2)。

表2 產(chǎn)氣莢膜梭菌C型菌(C59-2)培養(yǎng)上清BALB/c小鼠LD100的測(cè)定Table 2 Determination of LD100 of culture supernatant of Clostridium perfringens type C (C59-2) in BALB/c mice

接種C59-2培養(yǎng)上清后，觀察發(fā)現(xiàn)小鼠短至2～3 h內(nèi)即出現(xiàn)呼吸窘迫、精神萎靡、被毛雜亂、抱團(tuán)取暖、食欲消失等癥狀，并在24 h內(nèi)全部死亡(圖2)。剖檢結(jié)果可以看到病變主要在回腸和空腸部分；處理組死亡小鼠腸壁因充滿氣體擴(kuò)張而菲薄，腸壁黏膜出血呈現(xiàn)血腫狀態(tài)(圖3)。

圖2 攻毒后小鼠生活狀態(tài)(左為對(duì)照組，右為處理組)Fig.2 The represent of mice after challenge(left is the control group, right is the treatment group)

圖3 攻毒后小鼠解剖圖(左為對(duì)照組，右為處理組)Fig.3 Anatomy of mice after challenge(left is the control group, right is the treatment group)

2.3 數(shù)據(jù)質(zhì)控

將采集好的小鼠空腸組織樣品送北京諾禾致源科技股份有限公司，分別提取總RNA，檢測(cè)結(jié)果顯示，所有樣本濃度均>702 ng·μL，RIN值>8.7，質(zhì)量全部合格，可以正常建庫(kù)(表3)。通過Illumina 2000測(cè)序平臺(tái)的nova-seq分別對(duì)兩組樣品進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過濾、整理原始數(shù)據(jù)后，共獲得273 195 306條高質(zhì)量數(shù)據(jù)，共計(jì)40.99 Gb堿基，且每個(gè)樣品的堿基量均達(dá)到6.45以上。各樣品的錯(cuò)誤率均<0.03，Q20均>96%，Q30均>90%，GC含量均在50%左右，表明測(cè)序數(shù)據(jù)有效，可以用于后續(xù)分析。另外，6個(gè)樣本與參考基因組的對(duì)比率均>92.62%，比對(duì)到參考基因組唯一位置，即用于后續(xù)定量數(shù)據(jù)分析的reads數(shù)及其百分比為77.09%～88.87%，比對(duì)到基因組外顯子區(qū)域的reads數(shù)及其占clean reads數(shù)的比例為94.08%～97.70%，具體內(nèi)容如表4所示。

表3 總RNA質(zhì)量檢測(cè)Table 3 Examination of total RNA quality

表4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 4 Statistical analysis of transcriptome sequencing data

2.4 差異表達(dá)基因分析與驗(yàn)證

通過方法“1.2.5”分析比較對(duì)照組和處理組的基因表達(dá)情況，如圖4A火山圖所示，共得到795個(gè)差異基因，與對(duì)照組相比，處理組中有229個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，有566個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，有23 669個(gè)基因表達(dá)無(wú)顯著性差異。為了后續(xù)進(jìn)行差異基因的功能富集分析，對(duì)所有樣本的基因表達(dá)值(FPKM表達(dá)矩陣)進(jìn)行聚類分析，對(duì)行(Row)進(jìn)行均一化處理(Z-score)。如圖4B熱圖所示，表達(dá)模式相近的基因被聚集在一起，共有4個(gè)不同的功能相關(guān)類群，且每組有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣品間相互關(guān)聯(lián)。以上結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，組內(nèi)不同個(gè)體的基因表達(dá)譜具有較低的變異。

A.火山圖：每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，紅色表示上調(diào)表達(dá)的基因，綠色表示下調(diào)表達(dá)的基因，藍(lán)色表示非顯著差異表達(dá)基因。B.熱圖：每列表示一個(gè)樣本，每行表示一個(gè)基因；顏色代表該基因在單個(gè)樣本中的表達(dá)量，紅色代表表達(dá)量較高，藍(lán)色代表表達(dá)量較低；左側(cè)為基因聚類的樹狀圖和子聚類的模塊圖A. Volcano map：Each dot represents a single gene. Red dots represent the up-regulated genes；green dots represent the down-regulated genes；Blue dots represent stably expressed genes. B. Heat map：Each column represents a sample and each row represents a gene. The color represents the expression level of the gene in a single sample, with red representing higher expression and blue representing lower expression. On the left is a dendrogram of gene clusters and a block diagram of subclusters圖4 差異表達(dá)基因火山圖(A)及熱圖(B)Fig.4 Volcano map (A) and heat map (B) of DEGs

另外，為了驗(yàn)證篩選后的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選5個(gè)上調(diào)差異表達(dá)基因(4、、、2、4)和5個(gè)下調(diào)差異表達(dá)基因(1、186、、4、9)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR試驗(yàn)。結(jié)果如圖5所示，上述所挑選的差異表達(dá)基因的q-PCR變化規(guī)律與RNA-seq中表達(dá)規(guī)律一致，進(jìn)一步表明所分析的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可信。

圖5 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證Fig.5 q-PCR verification of DEGs

2.5 GO注釋分析

GO(Gene Ontology)是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)，可分為生物過程(biological process)、細(xì)胞組成(cellular component)和分子功能(molecular function)3個(gè)部分。將篩選獲得的差異表達(dá)基因通過GO功能富集，以校正值<0.05作為顯著性富集的閾值進(jìn)行再次篩選，分析GO注釋結(jié)果，繪制條形圖如圖6所示。其中，上調(diào)的差異表達(dá)基因注釋主要涉及生物過程部分，如G蛋白偶聯(lián)核苷酸受體活性、G蛋白偶聯(lián)嘌呤核苷酸受體活性、嘌呤核苷酸受體活性以及核苷酸受體活性等(圖6A)。而下調(diào)的差異表達(dá)基因注釋主要涉及分子功能部分，如酶活性、受體活性、轉(zhuǎn)錄激活因子活性以及MHC Ⅰ類蛋白結(jié)合等(圖6B)。

A為上調(diào)的差異表達(dá)基因注釋，B為下調(diào)的差異表達(dá)基因注釋。橫坐標(biāo)為基因數(shù)，縱坐標(biāo)為各注釋內(nèi)容A is the up-regulated differential expression gene annotation, and B is the down-regulated differential expression gene annotation. The ordinate is the number of genes, and the abscissa is the annotation content圖6 差異表達(dá)基因的GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Fig.6 GO database annotation of DEGs

2.6 KEGG富集分析

KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)是整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合性數(shù)據(jù)庫(kù)。將篩選獲得的差異表達(dá)基因通過KEGG通路富集，以校正值<0.05作為顯著性富集的閾值進(jìn)行再次篩選，從富集結(jié)果中選取最顯著的20個(gè)通路，繪制散點(diǎn)圖(圖7)。結(jié)果顯示，KEGG通路主要富集在TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等信號(hào)通路。

橫坐標(biāo)為注釋到KEGG通路上的差異基因數(shù)與差異基因總數(shù)的比值，縱坐標(biāo)為KEGG通路，點(diǎn)的大小代表注釋到KEGG通路上的基因數(shù)，顏色從紅到紫代表富集的顯著性大小The abscissa is the ratio of the number of differential genes annotated to the KEGG pathway to the total number of differential genes, and the ordinate is the KEGG pathway. The size of the dots represents the number of genes annotated on the KEGG pathway, and the colors from red to purple represent the significance of enrichment圖7 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of DEGs

3 討 論

產(chǎn)氣莢膜梭菌作為人畜共患病原菌，引發(fā)的疾病具有發(fā)病快，病死率高的特點(diǎn)，引起了世界性的廣泛關(guān)注，成為嚴(yán)重影響公共衛(wèi)生和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的問題。但是該菌的致病機(jī)理尚不清晰，還需進(jìn)一步研究相關(guān)分子機(jī)制，為產(chǎn)氣莢膜梭菌病的治療方案提供新的思路。由病原菌產(chǎn)生的毒素(例如產(chǎn)氣莢膜梭菌和艱難梭菌)可以刺激腸黏膜大量分泌黏液，同時(shí)小腸絨毛細(xì)胞受到毒素的作用會(huì)啟動(dòng)多種死亡機(jī)制，細(xì)胞損傷時(shí)產(chǎn)生的多種炎性細(xì)胞因子，例如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β, IL-1β)等炎癥細(xì)胞因子會(huì)加劇細(xì)胞脫落的情況，致使小腸絨毛表面積減少，黏膜吸收能力降低，造成臨床上的腹瀉癥狀。在此過程中，原本機(jī)體內(nèi)受到嚴(yán)格調(diào)控的免疫耐受和防御性炎癥反應(yīng)之間的平衡發(fā)生紊亂，導(dǎo)致腸道微生物種群生態(tài)進(jìn)而出現(xiàn)紊亂，腸道固有層通透性發(fā)生變化，黏膜免疫系統(tǒng)反應(yīng)異常，最終發(fā)展為炎癥性腸病(IBD)。而本研究中對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒的產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清，即含有病原菌的主要毒力因子——單獨(dú)或協(xié)同作用的多種外毒素。本研究中小鼠腹腔剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小鼠腸壁因充滿氣體擴(kuò)張而菲薄，腸壁黏膜出現(xiàn)血腫，呈明顯的炎癥狀態(tài)。進(jìn)一步采集小鼠腸道組織樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選差異表達(dá)基因，并對(duì)差異基因集進(jìn)行基因功能富集分析, 進(jìn)而研究產(chǎn)氣莢膜梭菌引起壞死性腸炎的生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用的生物通路。

在C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的多種毒素中，Beta1毒素對(duì)于壞死性腸炎的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。許多上皮細(xì)胞系，包括豬和人腸上皮細(xì)胞對(duì)Beta1毒素的作用不敏感，而內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和不同的白細(xì)胞系則對(duì)Beta1毒素高度敏感。這表明Beta1毒素的作用可能是細(xì)胞類型特異性的，推測(cè)可能與細(xì)胞類型特異性受體的表達(dá)相關(guān)。同時(shí)也有研究表明，細(xì)胞膜上ATP門控的P2X purino receptor 7(P2X7)可能是Beta1毒素的潛在受體，Beta1毒素與靶細(xì)胞上的P2X7受體的結(jié)合可誘導(dǎo)ATP 從Pannexin 1通道快速釋放。釋放的ATP將進(jìn)一步刺激Beta1毒素與內(nèi)皮細(xì)胞膜的結(jié)合和寡聚體形成，促進(jìn)毒素的成孔活性。在本研究中，GO注釋的生物學(xué)過程中，C59-2培養(yǎng)上清處理組小鼠腸組織中的G蛋白偶聯(lián)核苷酸受體活性及G蛋白偶聯(lián)嘌呤核苷酸受體活性顯著上調(diào)，提示毒素可能通過結(jié)合P2Y受體引起炎性反應(yīng)，破壞腸道屏障，導(dǎo)致腸道損傷。而C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的主要致死性毒素即為Alpha及Beta1毒素，作者也利用Beta1毒素單克隆抗體檢測(cè)證實(shí)了C59-2培養(yǎng)上清中含有大量的Beta1毒素。產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的腸毒血癥也是業(yè)界所關(guān)注的問題之一，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)是膿毒癥的常見并發(fā)癥，由于伴隨的血栓發(fā)炎和微血管通透性變化而嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。P2X7受體通過ERK1/2信號(hào)通路介導(dǎo)膿毒癥幼鼠大腦皮質(zhì)中NLRP3/ Caspase1相關(guān)的細(xì)胞焦亡，與膿毒癥相關(guān)性腦病相關(guān)。利用RNAi技術(shù)沉默衛(wèi)星神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的P2X4受體(P2X家族)，可以減輕人類免疫缺陷病毒(HIV)表面毒性顆粒gp120所引起的靶細(xì)胞Caspase1活化以及IL-1β、IL-18等炎性因子的釋放。因此推測(cè)，針對(duì)P2X家族的靶點(diǎn)藥物有望成為治療Beta1毒素所致的相關(guān)疾病的治療手段。

在新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(一種新生兒炎癥性腸道疾病)的體內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)，TNF-α通過絲裂原活化蛋白激酶1 (mitogen-activated protein kinase 1, MAPK1)/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2(extracellular regulated protein kinases2, ERK2)-MAPK3/ERK1途徑誘導(dǎo)自噬，從而抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)炎癥性腸道疾病的發(fā)展。且腸道上皮細(xì)胞會(huì)由于細(xì)胞膜上的Toll 樣受體(Toll-like receptors, TLR)等模式識(shí)別受體因腸道菌群的變化而激活，進(jìn)而分泌β-防御素。本研究的KEGG通路富集分析結(jié)果與其相符，顯示產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清處理組小鼠腸組織中的TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、FOXO信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路，NF，κB信號(hào)通路等炎性相關(guān)信號(hào)通路顯著富集，且在這些通路中NF-κB抑制劑α(NF-kappa-B inhibitor alpha，Nfkbia)和趨化因子CXC配體2(C-X-C motif chemokine 2，Cxcl2)顯著表達(dá)上調(diào)。目前，隨著對(duì)TNF的深入研究，確定其為炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。TNF與被稱為TNFR1和TNFR2的兩種受體相互作用，能夠在細(xì)胞和組織上差異表達(dá)并啟動(dòng)不同以及相互重疊的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這些信號(hào)級(jí)聯(lián)導(dǎo)致一系列的細(xì)胞反應(yīng)，包括細(xì)胞存活、分化、增殖、遷移和死亡。血管內(nèi)皮細(xì)胞可通過發(fā)生許多促炎變化對(duì)TNF作出反應(yīng)，導(dǎo)致白細(xì)胞黏附增加，經(jīng)內(nèi)皮遷移和血管滲漏促進(jìn)血栓形成。并且，TNF在炎癥中的核心作用已通過阻斷其作用的藥劑治療一系列炎性疾病的能力得到證明，包括炎癥性腸病和銀屑病等。另外，IL-17家族能夠與其對(duì)應(yīng)的受體相互作用并激活下游信號(hào)通路，如NF-κB以誘導(dǎo)許多促炎介質(zhì)的分泌，包括IL-6、TNF-α和IL-1β。而NF-κB激活和IL-1β的高表達(dá)是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵特征，提示人們?cè)诤罄m(xù)的關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素致病機(jī)理的研究中需要關(guān)注細(xì)胞焦亡在腸道損傷中的作用。

細(xì)胞焦亡在炎性機(jī)制相關(guān)的宿主抗感染過程中是一把“雙刃劍”：一方面，細(xì)胞焦亡可激活細(xì)胞內(nèi)在的死亡機(jī)制，釋放炎性因子，清除病原體，防止感染；另一方面，過度的IL-1β和IL-18釋放則可導(dǎo)致炎癥的失控及機(jī)體病理狀態(tài)的發(fā)生。IL-1β在炎性疾病中作用也受到廣泛關(guān)注，其病理性的產(chǎn)生可引起許多表現(xiàn)不同的炎癥疾病，甚至可激發(fā)致機(jī)體休克的細(xì)胞因子風(fēng)暴； 近年的大量的研究表明，IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)似乎在介導(dǎo)腸道炎癥中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，腸道生態(tài)失調(diào)可以通過IL-1β依賴性方式誘導(dǎo)骨髓炎，阻斷IL-1β的產(chǎn)生可改善艱難梭菌和鼠傷寒沙門菌引起的腸炎；產(chǎn)生的IL-1β和IL-18還可以作用于細(xì)胞上的IL-1家族受體，進(jìn)而激活更強(qiáng)的免疫調(diào)控以及適應(yīng)性免疫應(yīng)答。鑒于這兩種細(xì)胞因子都是重要的免疫調(diào)節(jié)劑，如果不加以控制，它們?cè)诓煌愋图?xì)胞中的高水平表達(dá)可能會(huì)對(duì)機(jī)體造成災(zāi)難性的后果。目前，多項(xiàng)研究認(rèn)為，抑制細(xì)胞焦亡產(chǎn)生的終產(chǎn)物(成熟的IL-1β和IL-18)的過度表達(dá)對(duì)一些臨床疾病具有治療潛力。例如，Glyburide是一種通過抑制胰腺β細(xì)胞中ATP敏感的K通道治療Ⅱ型糖尿病的藥物，還可以通過特異性抑制NLRP3的成熟而抑制IL-1β的產(chǎn)生。Parthenolide是一種天然的植物倍半萜內(nèi)酯，已被廣泛用作治療各種炎癥性疾病，且副作用極小，可以通過影響NLRP3、NLRP1和NLRC4等炎性小體的組裝而抑制Caspase1的活化。細(xì)胞焦亡的誘發(fā)因素之一，是細(xì)胞內(nèi)K水平的降低，因此調(diào)節(jié)K水平也是治療干預(yù)的目標(biāo)。該過程受P2X7的控制，目前已開發(fā)出P2X7的小分子抑制劑(AZD9056)并在人體中進(jìn)行了測(cè)試，經(jīng)治療后的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的炎性癥狀有明顯的臨床改善。因此，在產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的慢性腸炎等疾病中是否可以NLRP3炎性小體為靶點(diǎn)進(jìn)行治療，阻止過度的細(xì)胞因子釋放，緩解隨之而來(lái)的組織破壞有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

本研究制備C型產(chǎn)氣莢膜梭菌分泌的外毒素，感染BALB/c小鼠，通過分析小鼠腸道組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，并利用q-PCR 進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果表明,C型產(chǎn)氣莢膜梭菌外泌毒素侵入機(jī)體時(shí)，通過激活TNF等關(guān)鍵炎性信號(hào)通路以及NLRP3炎性小體信號(hào)通路造成腸道發(fā)生炎性損傷甚至壞死，進(jìn)而引起動(dòng)物的死亡。本研究結(jié)果將為產(chǎn)氣莢膜梭菌病的致病機(jī)理研究提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為尋找該病的治療靶點(diǎn)提供新的思路。