不同地方豬重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)SNP芯片分型及群體遺傳結(jié)構(gòu)研究

陶 璇，何志平，梁 艷，楊雪梅，雷云峰，王 言，胡紫惠，廖 坤，肖賢勛，格 桑，馬貴云，吉絨丹增，敖 翔，呂學(xué)斌，顧以韌*

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院 動物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066；2.通江縣農(nóng)業(yè)局，巴中 636700； 3.稻城縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局，甘孜 627750；4.鄉(xiāng)城縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局，甘孜 627850；5. 榮縣農(nóng)牧農(nóng)村和科技局，甘孜 627950；6.四川鐵騎力士集團(tuán)馮光德實(shí)驗(yàn)室，綿陽 621006)

我國是豬種遺傳多樣性特別豐富的國家之一，2011年在《中國畜禽遺傳資源志·豬志》中公布的地方豬遺傳資源有76個(gè)，它們具有性成熟早、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)優(yōu)異以及耐粗飼等特點(diǎn)。豐富的豬種遺傳資源是培育新品種、配套系最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)和基本育種素材，這不僅是中國也是世界動物遺傳資源寶庫的重要組成部分。地方豬遺傳資源是關(guān)乎我國養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重大戰(zhàn)略性資源，是實(shí)現(xiàn)種業(yè)安全的根本性保障。然而，由于大量高效外種豬的引進(jìn)，使許多地方豬種數(shù)量急劇減少，有的已處于瀕危狀態(tài)或?yàn)l臨滅絕。四川悠久的養(yǎng)豬歷史和復(fù)雜多樣的地理環(huán)境造就了內(nèi)江豬、成華豬、雅南豬、烏金豬(涼山類群)、青峪豬、丫杈豬和藏豬等優(yōu)良地方豬種資源，均已列入《國家畜禽遺傳資源品種名錄(2021年版)》。研究四川省地方豬種的遺傳多樣性，對于地方豬遺傳資源的正確認(rèn)識和評價(jià)、優(yōu)勢性狀挖掘以及科學(xué)開發(fā)利用具有重要意義。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)作為第三代分子標(biāo)記，已被廣泛用于生物群體遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助選擇的研究，全基因組SNP芯片技術(shù)則是群體遺傳結(jié)構(gòu)和多樣性分析的一把利器?！爸行疽惶枴笔墙鬓r(nóng)業(yè)大學(xué)黃路生院士團(tuán)隊(duì)研發(fā)的豬育種芯片，它包含繁殖、生長肥育、胴體、肉質(zhì)、免疫等7大類422個(gè)性狀的相關(guān)位點(diǎn)，涵蓋豬從出生到屠宰共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)，擁有51 368個(gè)SNPs位點(diǎn)，其中包含有81個(gè)亞洲特有地方品種位點(diǎn)，具有高效性和精準(zhǔn)性優(yōu)勢，對我國特有豬品種的選育工作更具針對性。為增加對四川省地方豬種遺傳價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的認(rèn)識，充分發(fā)掘、評價(jià)和利用地方豬種優(yōu)良種質(zhì)特性，促進(jìn)地方豬種資源保護(hù)，本研究采用“中芯一號”芯片分析了四川省地方豬種和山東省徒河黑豬重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的SNP基因型分布以及群體間遺傳結(jié)構(gòu)，為地方豬種資源的科學(xué)保護(hù)和利用提供分子水平的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集四川省6個(gè)地方豬種7個(gè)類群和徒河黑豬共562頭豬的耳組織樣本，包括23頭成華豬、26頭雅南豬、60頭青峪豬、57頭內(nèi)江豬、151頭丫杈豬、57頭烏金豬(涼山類群)、51頭平原藏豬、109頭高原藏豬和28頭徒河黑豬，四川省地方豬種來自四川省內(nèi)各個(gè)豬種的保種場，徒河黑豬來自于四川省鐵騎力士食品有限公司。采集的耳組織樣置于裝有75%酒精的2 mL凍存管中，-20 ℃保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取與分型 采用磁珠法提取DNA，首先用酒精消毒后的鑷子從原始樣本管夾出組織并用衛(wèi)生紙吸干表面保護(hù)液，用消毒后的剪刀剪取大米粒大小的動物組織放入加入20 μL Proteinase K和 300 μL Buffer WL的裂解管中，渦旋混勻振蕩，將裂解管放入56 ℃恒溫水浴鍋裂解 40 min，將裂解完成的裂解管放入離心機(jī)進(jìn)行瞬時(shí)離心，轉(zhuǎn)移上清液至96深孔板中，向96深孔板中加入相關(guān)試劑，然后用磁棒套進(jìn)行磁珠吸附，最后將洗脫產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至1.5 mL 收集管中低溫保存。

提取好的DNA經(jīng)紫外分光光度儀(NanoDrop2000)和凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測，檢測合格后的DNA樣本使用“中芯一號”芯片(北京康普森農(nóng)業(yè)科技有限公司，北京)進(jìn)行SNP基因分型。

1.2.2 芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控 利用Plink V1.90軟件對SNP基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，只使用常染色體上的位點(diǎn)，再剔除檢出率小于90%、最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)小于0.05的SNP位點(diǎn)，用于后續(xù)分析。

1.2.3 重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)SNP基因型分析 利用Pink V1.90版本、R 等軟件對豬的7個(gè)影響肉質(zhì)、生長和體型的基因及抗病性基因進(jìn)行基因型分析統(tǒng)計(jì)，對經(jīng)濟(jì)性狀有利的等位基因統(tǒng)一用Q表示，不利的等位基因統(tǒng)一用q表示。

1.2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用Mega X(V10.0)進(jìn)行聚類分析，使用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)，基于IBS遺傳距離，對四川省地方豬種和徒河黑豬樣本進(jìn)行聚類。使用Plink V1.90軟件對四川省6個(gè)地方豬種7個(gè)類群和徒河黑豬進(jìn)行主成分分析(PCA)，分析各豬種間遺傳距離。同時(shí)基于全基因組SNP芯片結(jié)果，根據(jù)PCA分析結(jié)果，利用VCFtools(V0.1.17)軟件計(jì)算地方豬種群間的指數(shù)，分析群體間遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近。

2 結(jié) 果

2.1 重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的SNP基因型

對四川省地方豬和徒河黑豬群體中與重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)的SNP基因型檢測結(jié)果(表1)顯示，四川省地方豬群體中，采食量、酸肉和應(yīng)激性狀的雜合基因型Qq和隱性基因型qq總比例很低，均低于2.20%；料重比和抗仔豬腹瀉性狀的Qq、qq基因型總比例分別為11.80%和8.99%，其中qq基因型僅為0.38%和0.56%；多肋和公豬精液品質(zhì)性狀的Qq、qq基因型總比例較高，分別為95.32%和73.97%。徒河黑豬群體中，應(yīng)激性狀的等位基因q已完全剔除，采食量和酸肉性狀的Qq、qq基因型總比例很低，均為3.57%；料重比、多肋、抗仔豬腹瀉和公豬精液品質(zhì)性狀的Qq、qq基因型總比例較高，分別為82.14%、92.86%、50.00%、39.29%。

四川省地方豬群體中(表2)，采食量性狀僅烏金豬和高原藏豬分別有2個(gè)和1個(gè)非優(yōu)勢雜合基因型Qq，比例分別為3.51%和0.92%；應(yīng)激性狀僅丫杈豬、烏金豬和高原藏豬分別有7個(gè)、3個(gè)和1個(gè)非優(yōu)勢雜合基因型Qq，比例分別為4.64%、5.26%和0.92%；抗仔豬腹瀉性狀的非優(yōu)勢基因型主要集中在丫杈豬和烏金豬群體，比例分別為17.88%和28.07%；酸肉性狀的非優(yōu)勢基因型只有高原藏豬群體中存在，Qq、qq基因型各3個(gè)，占比均為2.75%；料重比性狀的非優(yōu)勢基因型主要集中在成華豬、青峪豬、丫杈豬和烏金豬群體，比例分別為17.39%、25.00%、22.52%和15.79%；各豬種多肋性狀的非優(yōu)勢基因型總比例均高于80.00%，且多為隱性基因型qq，雜合基因型Qq比例丫杈豬最高(55.63%)，烏金豬次之(28.07%)，其余豬種比例均低于4.00%；各豬種公豬精液品質(zhì)性狀的非優(yōu)勢基因型比例較高，按比例高低順序排列為內(nèi)江豬(92.98%)、成華豬(91.30%)、平原藏豬(90.20%)、烏金豬(82.45%)、青峪豬(80.00%)、丫杈豬(73.51%)、雅南豬(73.08%)、高原藏豬(45.87%)。平原藏豬和高原藏豬各性狀的基因型分布基本一致，主要不同之處在于高原藏豬的酸肉性狀有6個(gè)非優(yōu)勢等位基因型，且公豬精液品質(zhì)性狀的qq基因型比例(6.42%)遠(yuǎn)低于平原藏豬(47.06%)。

2.2 群體間遺傳距離

聚類分析結(jié)果顯示(圖1)，同一品種的所有個(gè)體均能夠聚在一起，品種間沒有交叉，平原藏豬和高原藏豬兩個(gè)群體間有1頭交叉。主成分分析可以用來解析群體間分層結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示(圖2)，徒河黑豬與四川省地方豬種遺傳距離較遠(yuǎn)，群體分層結(jié)構(gòu)明顯。四川省地方豬種中，丫杈豬、烏金豬、內(nèi)江豬和藏豬(平原和高原)各自聚為一類，品種間群體分層結(jié)構(gòu)明顯；雅南豬、成華豬、青峪豬聚為一類，3個(gè)品種之間距離較近并有部分個(gè)體重疊。

YC.丫杈豬；QY.青峪豬；NJ.內(nèi)江豬；YN.雅南豬；WJ.烏金豬；CH.成華豬；PTB.平原藏豬；HTB.高原藏豬；HZ.徒河黑豬。下同YC.Yacha pig; QY. Qingyu pig; NJ. Neijiang pig; YN. Ya’nan pig; WJ. Wujin pig; CH. Chenghua pig; PTB. Plain Tibetan pig; HTB. Plateau Tibetan pig; HZ. Tuhe black pig. The same as below圖1 聚類分析結(jié)果Fig.1 Results of cluster analysis

圖2 PCA分析結(jié)果Fig.2 Results of principal component analysis (PCA)

丫杈豬和青峪豬同屬湖川山地豬，分別分布于四川北部山區(qū)和南部山區(qū)，在地域分布上存在很大差異，同時(shí)在性能表型上也存在顯著差異，主成分分析結(jié)果顯示青峪豬與丫杈豬形成了明顯各自的簇(cluster)，表明兩個(gè)群體分層結(jié)構(gòu)明顯，且明顯高于成華豬與雅南豬。為進(jìn)一步解析丫杈豬和青峪豬的群體分化程度，在基因組層面分別計(jì)算了丫杈豬與青峪豬間、內(nèi)江豬與烏金豬間的群體遺傳分化指數(shù)()。結(jié)果顯示，丫杈豬與青峪豬間的指數(shù)達(dá)0.48(圖3A)，高于內(nèi)江豬與烏金豬間的0.44(圖3B)，說明丫杈豬和青峪豬群體間存在高度遺傳分化。

A.青峪豬與丫杈豬間群體Fst指數(shù)；B. 內(nèi)江豬與烏金豬間群體Fst指數(shù)A. Fst index between Qingyu pigs and Yacha pigs; B. Fst index between Neijiang pigs and Wujin pigs圖3 種群間Fst指數(shù)計(jì)算結(jié)果Fig.3 Calculation results of Fst index

3 討 論

3.1 不同豬群重要經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)位點(diǎn)SNP基因型分析

SNP分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于畜禽遺傳學(xué)研究、品種選育、種質(zhì)資源保護(hù)等領(lǐng)域，促進(jìn)了畜禽產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。本研究中，四川省地方豬群體除高原藏豬外，酸肉性狀已無不利的等位基因q，應(yīng)激性狀的不利等位基因q只存在于丫杈豬、烏金豬和高原藏豬的極個(gè)別個(gè)體中，這與地方豬肉質(zhì)優(yōu)異、抗應(yīng)激性好的特性一致。采食量性狀的不利等位基因q只存在于烏金豬和高原藏豬個(gè)別個(gè)體中。料重比和抗仔豬腹瀉性狀的非優(yōu)勢基因型比例較低，在不影響群體血緣的情況下，可通過針對性的選擇，盡快淘汰qq基因型個(gè)體，同時(shí)加強(qiáng)雜合子Qq基因型個(gè)體后代的檢測，提升Q等位基因比例。多肋和公豬精液品質(zhì)性狀的非優(yōu)勢基因型比例高，說明四川省地方豬種沒有通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在該位點(diǎn)上對這兩個(gè)性狀進(jìn)行選育。

徒河黑豬群體中沒有應(yīng)激性狀的非優(yōu)勢等位基因型，采食量和酸肉性狀也分別只有1個(gè)Qq基因型和1個(gè)qq基因型個(gè)體，在不影響群體血緣的情況下可及時(shí)淘汰；料重比、多肋、抗仔豬腹瀉和公豬精液品質(zhì)性狀的非優(yōu)勢基因型比例較高，說明之前沒有通過分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在該位點(diǎn)上對這3個(gè)性狀進(jìn)行選育，可根據(jù)血緣覆蓋原則慢慢淘汰qq基因型個(gè)體，同時(shí)加強(qiáng)Qq基因型個(gè)體后代基因型檢測，不斷提升Q等位基因頻率。

3.2 不同豬群間遺傳距離分析

研究品種間的遺傳距離對于研究品種的形成以及豬品種的分類具有重要意義。本研究基于SNP芯片數(shù)據(jù)，對四川省7個(gè)地方豬類群和山東省徒河黑豬群體進(jìn)行了主成分分析，并基于IBS遺傳距離，使用鄰接法(neighbor-joining, NJ)進(jìn)行了聚類分析。山東省徒河黑豬與四川地方豬種間遺傳距離較遠(yuǎn)，涇渭分明；雅南豬、成華豬、青峪豬聚為一類，品種間遺傳距離較近，丫杈豬、烏金豬、內(nèi)江豬和藏豬各自聚為一類。

1977年根據(jù)四川省地方豬種資源聯(lián)合調(diào)查結(jié)果，四川盆地周圍的丫杈豬、黔江豬、青峪豬及南江豬被統(tǒng)一歸并命名為盆周山地豬，載入《四川省畜禽品種志》；1980年，四川的盆周山地豬、湖北的鄂西黑豬和與湖南西部接壤地區(qū)的豬種又被歸并統(tǒng)一命名為湖川山地豬；2009年，經(jīng)國家畜禽遺傳資源委員會豬專業(yè)委員會組織專家討論，認(rèn)為丫杈豬體型較大，與盆周山地豬有一定差異，在湖川山地豬中單獨(dú)作為一個(gè)類群。丫杈豬和青峪豬在地域分布和肥育、胴體和肉質(zhì)性能表型上都存在明顯差異，本研究中，聚類和主成分分析均顯示，青峪豬與丫杈豬形成了明顯各自的簇類(cluster)，表明兩個(gè)豬群遺傳距離較遠(yuǎn)，差異很大；群體遺傳分化指數(shù)()計(jì)算結(jié)果也表明，兩個(gè)群體間存在高度遺傳分化，從基因組層面表明了丫杈豬與青峪豬不屬于一個(gè)類群，且將其歸類于湖川山地豬同一品種缺乏依據(jù)，有待商榷。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，四川省地方豬群體的采食量、酸肉、應(yīng)激、抗仔豬腹瀉和料重比性狀的非優(yōu)勢基因型比例較低，公豬精液品質(zhì)和多肋性狀的非優(yōu)勢基因型比例較高；徒河黑豬群體的應(yīng)激性狀已無q等位基因，采食量和酸肉性狀的非優(yōu)勢基因型比例較低，公豬精液品質(zhì)、抗仔豬腹瀉、料重比和多肋性狀的非優(yōu)勢基因型比例較高。同時(shí)，明晰了四川省地方豬種間遺傳分化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)丫杈豬與青峪豬都?xì)w類于湖川山地豬有待商榷，為地方豬種遺傳資源保護(hù)和科學(xué)的種群分類提供了理論依據(jù)。