幼齡反芻動物瘤胃微生物定植及其營養(yǎng)調(diào)控研究進展

趙 旭，凌玉釗，王建華，魏凌云*，焦金真，賀志雄*

(1.武漢工程大學(xué)環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，武漢 430205；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點實驗室，北京 100081)

生命早期消化道微生物的定植可影響動物機體，且具有長期健康效應(yīng)。這一觀點被越來越多科研人員所認可。反芻動物瘤胃微生物主要包括厭氧細菌、古生菌、真菌和原蟲，通過厭氧發(fā)酵可為宿主提供65%～75%的能量，從而保障宿主的基本代謝活動和生長發(fā)育。了解反芻動物幼齡階段瘤胃微生物組成及其變化，可為精準(zhǔn)掌握瘤胃微生物調(diào)控窗口，進而通過營養(yǎng)調(diào)控促進瘤胃健康發(fā)育提供理論基礎(chǔ)。

1 幼齡反芻動物瘤胃微生物的定植規(guī)律

反芻動物出生后，隨著飼料攝入以及與外界環(huán)境接觸，瘤胃微生物逐步定植、存活和繁殖，也由兼性厭氧逐漸變成完全厭氧。在反芻動物幼齡階段瘤胃中，重要的微生物如半纖維素分解菌、果膠分解菌、纖維素分解菌和產(chǎn)甲烷菌較活躍，瘤胃微生物定植、組織形態(tài)以及瘤胃代謝協(xié)同促進了從非反芻到反芻發(fā)育的轉(zhuǎn)變。反芻動物幼齡時期的瘤胃微生物定植是一個復(fù)雜的過程，表現(xiàn)出多變性和不確定性，但隨著年齡的增長，其微生物組成逐漸顯現(xiàn)出一定的規(guī)律性，并且在成年階段趨于穩(wěn)定。

1.1 瘤胃細菌

細菌是瘤胃中數(shù)量最多的微生物，成年反芻動物每克瘤胃液約有10～10個細菌。依靠瘤胃細菌對飼料的降解和發(fā)酵，反芻動物能獲得充足的蛋白質(zhì)和能量。瘤胃細菌按功能分為纖維降解菌、半纖維降解菌、淀粉降解菌、糖類分解菌、利用酸菌、蛋白分解菌、產(chǎn)甲烷菌和脂肪分解菌。分子生物學(xué)、高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，為研究者們提供了了解較早期瘤胃細菌定植狀況的科學(xué)手段。如Jami等利用焦磷酸測序方法發(fā)現(xiàn)瘤胃細菌定植始于犢牛出生的第1天；Guzman等在剛出生20 min的犢牛瘤胃中進一步檢測到細菌的定植。

幼齡階段反芻動物瘤胃微生物定植與動物種類密切相關(guān)。在門水平，犢牛上的研究表明，擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)是整個早期瘤胃的優(yōu)勢菌門，且各菌門在不同日齡所占的比例不同，但在羔羊上的研究表明，出生后80～100 d內(nèi)，瘤胃內(nèi)三大細菌門類是變形菌門、厚壁菌門和互養(yǎng)菌門(Synergistetes)，此時的互養(yǎng)菌門占比超過30%，直到第110天后才被擬桿菌門取代；在屬水平，Jami等發(fā)現(xiàn)，梭菌屬()在犢牛出生第1天占主要優(yōu)勢，隨后，普氏菌屬()和糞球菌屬()逐步定植，成為3日齡犢牛的優(yōu)勢菌屬。Li等研究表明，在14日齡犢牛瘤胃中，普氏菌屬是優(yōu)勢菌屬，占比33.1%，其次是擬桿菌屬()占比18.1%，顫桿菌克屬()占比12.9%，帕拉普氏菌屬()占比7.1%，屬占比3.1%和屬占比3.0%。Zhang等利用擴增子測序法研究不同日齡山羊瘤胃細菌定植過程，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬()、乳球菌屬()和鏈球菌屬()是山羊出生后定植的核心菌屬。其中，芽孢桿菌屬比例達55%，但在第21天芽孢桿菌屬和鏈球菌屬顯著下降到不可檢測的水平，這可能與母乳中營養(yǎng)素、益生菌和抗菌物質(zhì)對優(yōu)勢菌表現(xiàn)出的選擇性有關(guān)。de Barbieri等研究表明，在42日齡羔羊瘤胃中，擬桿菌屬是優(yōu)勢菌屬占比71.4%，其次是卟啉單胞菌屬()占比6.2%，普氏菌屬占比5.1%，屬占比2.0%和糞球菌屬()占比1.9%。此外，在羔羊出生后前3 d瘤胃中未檢測到卟啉單胞菌屬、擬桿菌屬、梭桿菌屬()和奈瑟氏菌科(Neisseriaceae)，但在第4～14天內(nèi)這些細菌數(shù)量卻急劇增加，表明了瘤胃細菌在定植初期的多變性和復(fù)雜性。

反芻動物幼齡階段瘤胃細菌組成與其成年后細菌組成具有明顯的差異性。馮肖然等通過Meta分析發(fā)現(xiàn)，4～6月齡羔羊瘤胃中普氏菌屬和瘤胃球菌屬()是優(yōu)勢菌屬，明顯不同于在早期瘤胃中占據(jù)優(yōu)勢比例的芽孢桿菌屬、乳球菌屬和鏈球菌屬等。盡管不同種類反芻動物瘤胃微生物在幼齡時期表現(xiàn)出不同的定植規(guī)律，但Henderson等對來自于不同國家不同種類的742頭成年反芻動物的瘤胃微生物進行對比研究，發(fā)現(xiàn)即使種類不同，但成年反芻動物瘤胃的核心菌群相同，表現(xiàn)出在目、科和屬水平上的優(yōu)勢菌分別為梭菌目(Clostridiales)和擬桿菌目(Bacteroidales)；消化球菌科(Peptoeaccaeeae)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)；丁酸弧菌屬()、普氏菌屬和瘤胃球菌屬。

1.2 瘤胃古生菌

反芻動物每克瘤胃內(nèi)容物中含有10～10個古生菌。古生菌可以分為廣古菌門(Euryachaeota)和泉古菌門(Crenarchaeota)兩大類。其中，產(chǎn)甲烷菌是廣古菌門中的一類專性厭氧菌，利用厭氧真菌產(chǎn)生的H改變瘤胃厭氧真菌的代謝途徑，提高粗飼料的降解效率，其在瘤胃液中變動范圍為1×10～1×10個·mL。隨著分子生物技術(shù)的不斷拓展，人們對瘤胃內(nèi)產(chǎn)甲烷菌菌群的種類劃分也在不斷細化。此前，甲烷桿菌屬()、甲烷短桿菌屬()、甲烷微菌屬()和甲烷八疊球菌屬()被認為是廣泛存在于反芻動物瘤胃內(nèi)的4個產(chǎn)甲烷菌屬，而現(xiàn)階段已知的反芻動物中瘤胃產(chǎn)甲烷菌的核心菌屬包括甲酸甲烷桿菌()、布氏產(chǎn)甲烷菌()、反芻獸甲烷短桿菌()、米氏甲烷短桿菌()、奧氏甲烷短桿菌()、可活動甲烷微菌和奧蘭湯基甲烷囊菌()。Jeyanathan等將奶牛和綿羊瘤胃中的產(chǎn)甲烷菌菌群進行對比，一致認為反芻獸甲烷短桿菌、奧氏甲烷短桿菌、戈氏甲烷短桿菌()、陶氏甲烷短桿菌()和米氏甲烷短桿菌以及甲烷球形菌屬()是反芻動物瘤胃中的核心產(chǎn)甲烷菌群，為瘤胃產(chǎn)甲烷菌多樣性研究提供了方向。

幼齡階段反芻動物的種類和出生后日齡均會直接地影響瘤胃產(chǎn)甲烷菌的定植。Guzman等利用PCR實時定量技術(shù)，在出生20 min后的犢牛瘤胃中檢測到3種產(chǎn)甲烷菌迅速定植，分別是可活動甲烷微菌()、和spp.，spp.的豐度低于和可活動甲烷微菌。Whitford等在犢牛出生3 d后，發(fā)現(xiàn)瘤胃優(yōu)勢產(chǎn)甲烷菌是未分類的甲烷短桿菌屬(unassignedspecies)和未分類的甲烷球形菌屬(unassignedspecies)，相對豐度分別為36.6%和26.8%。Morvan等在出生30 h的羔羊瘤胃中也檢測到產(chǎn)甲烷菌，出生后15 h時瘤胃產(chǎn)甲烷菌數(shù)量接近于成年綿羊。此外，以山羊為試驗動物，研究發(fā)現(xiàn)羔羊出生后1～60 d瘤胃產(chǎn)甲烷菌隨日齡增加呈上升趨勢，出生后第1天瘤胃液中spp.和分別占比38.5%和45.2%，而在出生后第60天時，分別變化為53.2%和13.9%。Abecia等對2～7月齡山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌組成及其變化展開研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲烷短桿菌屬和甲烷球形菌屬是2月齡山羊瘤胃中的優(yōu)勢菌屬，分別占比72%和26%；3月齡時，甲烷短桿菌屬占比增加至95%，甲烷球形菌屬占比減少至5%；7月齡時，兩種菌屬占比分別變?yōu)?3%和14%。Wright等對9～12月齡綿羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌進行克隆，發(fā)現(xiàn)甲烷短桿菌屬、甲烷炎菌屬()和甲烷球形菌屬是此階段的核心菌屬。

1.3 瘤胃原蟲

瘤胃原蟲是一類高度多樣的單細胞微生物，也是反芻動物瘤胃微生物的主要類群之一，其在瘤胃液中的數(shù)量變動范圍為10～10個·mL，直接參與植物性物質(zhì)的發(fā)酵和分解。最初，科研人員主要通過傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡實現(xiàn)對瘤胃原蟲的鑒定和計數(shù)，而18S rRNA測序技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用進一步明確了成年階段瘤胃原蟲種屬間的差異。Sylvester等利用實時PCR技術(shù)分析奶牛瘤胃原蟲多樣性，發(fā)現(xiàn)內(nèi)毛蟲屬()和等毛蟲屬()占主要優(yōu)勢，其中，數(shù)量最多的是尖尾內(nèi)毛蟲()、有尾內(nèi)毛蟲()和原口等毛蟲()。Ji等通過高通量測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在門水平，奶牛瘤胃優(yōu)勢菌門是囊泡蟲總門(Alveolata)；在屬水平，優(yōu)勢菌屬為內(nèi)毛蟲屬、等毛蟲屬、雙毛蟲屬()、頭毛蟲屬()、厚毛蟲屬()和屬；在綱水平，優(yōu)勢菌綱為纖毛蟲綱(Ciliata)和鞭毛蟲綱(Mastigophora)。

反芻動物幼齡階段瘤胃原蟲的定植過程較為復(fù)雜，易受到瘤胃內(nèi)環(huán)境、飼糧類型以及動物種類等因素影響。Ishaq等將剛出生的犢牛單獨隔離飼養(yǎng)，隔離期間未檢測出瘤胃原蟲；Imai等將含有纖毛原蟲的瘤胃液移植至無菌犢牛瘤胃中，纖毛原蟲在第14天后便開始定植，這表明出生后立即隔離的幼畜無法快速建立原蟲區(qū)系，需要與外界環(huán)境接觸。Abecia等對60只羔羊進行隨機分配，一部分跟隨母羊，另一部分與母羊隔離，前者的原蟲豐富度在羔羊出生后第3、5、7、14天內(nèi)顯著增加，表明母幼畜之間的相互舔舐能夠加快瘤胃原蟲的定植，且動物日齡直接影響了瘤胃原蟲的數(shù)量。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，纖毛蟲的定植始于幼齡反芻動物出生15 d后，且瘤胃內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定有助于原蟲的建立，當(dāng)瘤胃內(nèi)的pH升高至6.0時，毛屬原蟲開始定植；當(dāng)pH上升至6.5時，雙毛蟲和全毛蟲逐步定植。此外，研究表明成年階段反芻動物瘤胃原蟲群落穩(wěn)定單一，主要優(yōu)勢原蟲屬為內(nèi)毛蟲屬、厚毛蟲屬和硬甲屬()，其中內(nèi)毛蟲屬的數(shù)量最多，平均豐度高達40%。

1.4 瘤胃真菌

Orpin首次從綿羊瘤胃中檢測到瘤胃真菌，其生物量約占瘤胃微生物總量的10%～20%，按照孢子、菌絲的形態(tài)分類，可以分為多中心和單中心兩個類型：多中心類型真菌分為根囊鞭菌屬()和厭氧鞭菌屬()兩個屬；單中心類型真菌分為新美鞭菌屬()、梨囊鞭菌屬()和盲腸鞭菌屬()3個屬。此外，瘤胃真菌的存在形態(tài)主要分為兩種：一種是自由運動的游動孢子，可存活24～32 h；另一種是附著于纖維碎片上的真菌菌絲體形態(tài)，在瘤胃纖維消化中有一定作用。

早期研究表明，瘤胃真菌初步定植于幼齡反芻動物出生后8～10 d。但受限于傳統(tǒng)生物顯微鏡檢測方法，無法進一步探究。現(xiàn)隨著科技技術(shù)的進步，眾多學(xué)者利用新型分子檢測技術(shù)對瘤胃真菌基因組或轉(zhuǎn)錄組進行深入研究，一致認為瘤胃真菌在幼齡反芻動物出生后3周初步完成定植。隨著日齡的增加，瘤胃真菌群落定植組成發(fā)生著劇烈的變化。一項針對5組不同日齡山羊瘤胃真菌群落定植變化的研究證實，幼齡山羊瘤胃真菌的定植規(guī)律包括3個階段：第一階段為幼齡山羊出生后0～14 d，是瘤胃真菌生長發(fā)育的重要時期，容易受到母體、日糧以及生存環(huán)境各方面因素的影響；第二階段為出生后14～28 d，不同種屬的瘤胃真菌群落相互之間競爭抑制，含量上發(fā)生實質(zhì)性變化，有的菌屬在后期被取代；第三階段為出生后28～56 d，瘤胃真菌群落處于穩(wěn)定平衡狀態(tài)，優(yōu)勢菌屬恒定。門水平上，在幼齡山羊出生0 d時，子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)是主要優(yōu)勢菌門，分別占比74.11%和11.71%，隨著日齡的增加，新麗鞭毛菌門(Neocallimastigomycota)迅速成為優(yōu)勢菌門，含量超過60%；屬水平上，共有41個屬，山羊出生時，優(yōu)勢菌屬是曲霉屬()、耐冷酵母屬()和屬，第14～28天，盲腸鞭菌屬和未分類的毛孢科(unclassified Lasiosphaeriaceae)占主要優(yōu)勢，但在第28天被其他菌屬取代。另有研究表明，羔羊斷奶后30～50 d內(nèi)，子囊菌門的相對豐度達到97%，處于絕對主導(dǎo)地位；優(yōu)勢菌屬變?yōu)榈掳屠湍笇?)和青霉屬()。同時，反芻動物的發(fā)育階段也是影響瘤胃真菌群落組成定植的重要因素之一。陳林發(fā)現(xiàn)，60日齡斷奶犢牛瘤胃中擔(dān)子菌門的相對豐度隨著日齡的增加顯著增加，有趣的是，犢牛斷奶前的優(yōu)勢菌屬是酵母菌屬()、曲霉屬()、青霉菌屬、馬拉色氏霉菌屬()和鏈格孢屬()；而斷奶后，孢圓酵母屬()取代鏈格孢屬成為優(yōu)勢菌屬之一，這在一定程度上表明，斷奶應(yīng)激影響了瘤胃真菌群落定植組成。此外，大量研究表明，成年階段反芻動物瘤胃真菌核心菌屬大致相似，主要以新美鞭菌屬為主。以上研究表明，每個發(fā)育階段的瘤胃真菌群落發(fā)生著劇烈的變化，不同日齡的幼齡反芻動物主導(dǎo)的優(yōu)勢菌屬具有差異性，有待進一步對反芻動物早期瘤胃真菌定植深入研究。

2 幼齡反芻動物瘤胃微生物定植過程的營養(yǎng)調(diào)控

2.1 飼糧組成

幼齡反芻動物斷奶階段需要完成由液態(tài)飼料完全向固體飼料的轉(zhuǎn)變，而固體飼料除了滿足動物所需的營養(yǎng)成分外，還能為瘤胃提供一定程度的物理刺激，加速早期瘤胃微生物的定植，從而促進瘤胃的發(fā)育。幼齡反芻動物瘤胃細菌的定植受飼糧組成影響，有研究發(fā)現(xiàn)，飼喂混合干草能增加羔羊瘤胃細菌多樣性，提高厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度，促進營養(yǎng)代謝，維持動物健康。李希等研究表明，提高飼糧纖維水平會影響羔羊瘤胃微生物群落，在門水平上，提高厚壁菌門的相對豐度，降低變形菌門的相對豐度；在其他水平上，瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、解琥珀酸弧菌屬()、月形單胞菌屬()和密螺旋體屬()的相對豐度顯著提高，促進瘤胃纖維降解菌的增殖，加快羔羊消化代謝。

2.2 益生菌

益生菌作為一種安全的飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于幼齡反芻動物生產(chǎn)中，能有效調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，促進營養(yǎng)吸收，保持腸道健康，主要包括丁酸梭菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌和酵母菌及酵母培養(yǎng)物等。飼料中直接添加益生菌會影響幼齡階段反芻動物瘤胃微生物菌群結(jié)構(gòu)組成，在犢牛飼糧中添加Chikuso-1和sp.CO119，可以增加乳酸菌屬和梭菌屬的含量；在犢牛日糧中添加地衣芽孢桿菌()，可以提高犢牛日增重，促進瘤胃纖維分解菌的定植，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境；在羔羊日糧中噴灑乳酸桿菌會增加瘤胃NH濃度，促進蛋白分解菌的生長和定植。益生菌的添加不僅能促進有益菌群的增殖，還能抑制有害菌群的數(shù)量，李穩(wěn)穩(wěn)發(fā)現(xiàn)，在斷奶羔羊飼糧中添加丁酸梭菌()會顯著降低變形菌門和疣微菌門(Verrucomicrobia)的相對豐度，提高厚壁菌門的相對豐度。這是因為丁酸梭菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸和細菌素能增大對營養(yǎng)物質(zhì)的吸附，有效抑制有害菌定植，改善瘤胃菌群區(qū)系，提高機體免疫能力。此外，Koike等研究表明，在斷奶犢牛瘤胃微生物定植初期飼喂C-3102，有助于spp.和spp.的建立，減少甲烷的產(chǎn)生，提高斷奶后的飼料利用率。

2.3 植物提取物

植物提取物中含有生物堿、多酚、黃酮和植物精油等物質(zhì)，能抑制有害菌的增殖，提高機體免疫力。大量研究表明，飼糧中添加植物提取物能夠有效預(yù)防幼齡反芻動物代謝疾病，改善瘤胃內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)幼齡反芻動物的生長代謝。研究表明，日糧中添加白藜蘆醇影響羔羊瘤胃微生物組成，包括真桿菌屬(é)、優(yōu)桿菌屬()、未培養(yǎng)的腸道細菌(uncultured gut group bacterium BS11)、未培養(yǎng)的瘤胃細菌(uncultured rumen bacterium 0319-6G20)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae UCG-005)、unidentified Gastranaerophilales、uncultured Christensenellaceae、1、屬和屬。在羔羊飼料中添加葡萄籽可以提高擬桿菌門和普氏菌屬的相對豐度，降低厚壁菌門的相對豐度，從而合理調(diào)控瘤胃內(nèi)環(huán)境。Lyons等研究發(fā)現(xiàn)，在羔羊日糧中添加亞麻籽油會影響瘤胃細菌和古細菌的組成，主要是通過提高琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)和瘤胃球菌科的相對豐度，減少甲烷短桿菌屬的相對豐度，從而降低瘤胃甲烷的排放量。

2.4 其他添加劑

在無抗飼料產(chǎn)業(yè)背景下，研究新型飼料添加劑提高幼齡反芻動物腸道健康有著重要的意義。研究表明，早期斷奶山羊飼喂溴氯甲烷后，可顯著降低瘤胃產(chǎn)甲烷菌的數(shù)量，從而降低瘤胃甲烷的排放量。Li等以湖羊羔羊為研究對象，發(fā)現(xiàn)飼糧中添加尿素會提高顫螺菌屬(spp.)的相對豐度，降低Succinivibrionaceae UCG 001和1的相對豐度。此外，低濃度的尿素添加量能顯著提高羔羊瘤胃總原蟲的數(shù)量，有利于瘤胃原蟲的早期定植。

3 小結(jié)與展望

近些年來，隨著二代測序技術(shù)(NGS)如Roche/454、Illumina/Solexa、Applied Biosystems/SOLID和Helicos BioSciences等平臺的飛速發(fā)展，使得測序成本更低。NGS為研究胃腸道微生物(包括含量很低的微生物)多樣性及其功能提供了新的契機。同時，隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白組學(xué)等組學(xué)技術(shù)為研究胃腸道微生物與宿主互作關(guān)系提供了更全面的思路。目前，基于組學(xué)方法對宿主-消化道微生物互作的研究主要是對宿主表型/基因型與宿主微生物群相關(guān)關(guān)系進行探索，研究思路通常從以下一個或多個問題開始：a)誰在那里？b)數(shù)量多少？c)在做什么？在此基礎(chǔ)上進一步確定導(dǎo)致表型/基因型的微生物類群或基因以探索宿主與微生物互作關(guān)系。利用此方法研究宿主-微生物互作，通?？梢哉业脚c感興趣表型/基因型相關(guān)的生物標(biāo)記、基因或代謝物，但缺乏明確的生物學(xué)特性關(guān)聯(lián)。同時，基于此類方法研究宿主-微生物互作也不可能確定這些微生物組成/功能變化到底是宿主表型變化的驅(qū)動因素或產(chǎn)物結(jié)果。

在今后的研究中，應(yīng)結(jié)合多種組學(xué)技術(shù)，并探索微生物變化是起因于宿主表型驅(qū)動或者受代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的宿主-微生物互作的新思路，以進一步深入了解幼齡反芻動物瘤胃微生物的定植規(guī)律、核心菌屬間的相互作用機制、宿主-微生物間的免疫關(guān)聯(lián)作用以及早期營養(yǎng)調(diào)控對幼齡反芻動物生長發(fā)育的影響，更好地闡釋幼齡反芻動物瘤胃微生物的定植規(guī)律以及其調(diào)控機制。