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    北京地區(qū)犬呼吸道冠狀病毒感染狀況的監(jiān)測(cè)與分析

    2022-10-29 04:02:36呂艷麗孫艷爭
    畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào) 2022年10期
    關(guān)鍵詞:感染率陽性率檢出率

    肖 園,呂艷麗,2*,孫艷爭,2*

    (1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院,北京 100193; 2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,北京 100193)

    犬呼吸道冠狀病毒(canine respiratory coronavirus,CRCoV)首次發(fā)現(xiàn)于2003年英國的某家大型流浪動(dòng)物中心,CRCoV與犬腸道冠狀病毒(canine coronavirus,CCoV,屬于α冠狀病毒屬)的同源性低(在穩(wěn)定的聚合酶基因上的核苷酸相似性僅為69%,而在可變區(qū)的氨基酸序列相似性僅為21%),但與牛冠狀病毒同源性很高(90%以上),因此被歸類于β冠狀病毒屬。CRCoV主要侵害犬的呼吸道,尤其是咽扁桃體和氣管。單獨(dú)感染通常只引起輕度的呼吸道癥狀,如噴嚏、鼻流分泌物和干咳等。免疫力強(qiáng)的犬也可能表現(xiàn)為無呼吸道癥狀。該病的潛伏期為6~10 d,感染后6 d可通過口咽途徑排毒。迄今為止,尚無針對(duì)CRCoV感染的特異性療法及針對(duì)該病毒的疫苗。

    CRCoV在全球范圍內(nèi)多個(gè)國家和地區(qū)廣泛流行,但國內(nèi)的流行性研究報(bào)道較少。臨床上,CRCoV還可與其他呼吸道病原體發(fā)生混合感染,這可能對(duì)犬類造成較為嚴(yán)重的健康威脅。本研究對(duì)CRCoV進(jìn)行流行病學(xué)、致病特點(diǎn)等方面的調(diào)查,以期對(duì)CRCoV有更為深入的了解,從而有利于對(duì)犬傳染性呼吸道疾病進(jìn)行防治,保障動(dòng)物健康。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    2015年12月—2017年3月,于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院收集的487份犬咽鼻拭子。

    病毒基因組DNA/RNA快速提取試劑盒II購自北京艾德萊生物科技有限公司。AMV reverse transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑購自Promega公司(USA)。2×Taq PCR MasterMix試劑購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司。瓊脂糖購自 Biowest(西班牙)。Goldview核酸染料購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司。PCR引物及PCR產(chǎn)物序列測(cè)定由三博生物工程技術(shù)有限公司完成。采用PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。

    1.2 試驗(yàn)方法

    1.2.1 CRCoV RT-PCR檢測(cè)方法的建立和臨床樣本的檢測(cè) ①引物:選擇Erles 等檢測(cè)CRCoV所使用的巢式引物,經(jīng)生物學(xué)軟件Primer評(píng)估合格后進(jìn)行合成。擴(kuò)增序列位于基因,引物序列及擴(kuò)增片段長度見表1。②核酸提取及PCR擴(kuò)增:按照RNA提取試劑盒說明提取鼻咽拭子樣本中的總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄,然后利用巢式PCR檢測(cè)方法對(duì)CRCoV目的片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增。擴(kuò)增分為兩步,第一步以反轉(zhuǎn)錄獲得的DNA為模板,使用外圍引物(CRCoV NO-up, CRCoV NO-down)進(jìn)行CRCoV特異性PCR擴(kuò)增;第二步以上述PCR產(chǎn)物為模板,用內(nèi)圍引物(CRCoV NI-up, CRCoV NI-down)進(jìn)行CRCoV特異性PCR擴(kuò)增。③凝膠電泳及成像:將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,利用SIM成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察,保存圖像并記錄試驗(yàn)結(jié)果。將陽性擴(kuò)增產(chǎn)物送至三博生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行進(jìn)行序列測(cè)定和分析,并將測(cè)序鑒定結(jié)果為CRCoV陽性的樣本于-20 ℃保存,作為陽性質(zhì)控。

    表1 CRCoV檢測(cè)用PCR引物Table 1 PCR primer for detecting CRCoV

    此CRCoV巢式PCR方法驗(yàn)證成功后,收集有或無臨床癥狀的臨床樣本進(jìn)行CRCoV檢測(cè)并記錄檢測(cè)結(jié)果,用于后續(xù)分析。

    1.2.2 犬腺病毒II型、犬副流感病毒和犬瘟熱病毒PCR/RT-PCR檢測(cè) 采用本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的犬腺病毒II型(canine adenovirus type 2,CAV-2)、犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV)和犬瘟熱病毒(canine distemper virus,CDV)的PCR/RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)部分樣本進(jìn)行檢測(cè),所用引物見表2。陽性質(zhì)控品為碩騰衛(wèi)佳伍疫苗。CPIV、CAV-2和CDV的檢測(cè)用引物序列及擴(kuò)增片段長度見表2。

    表2 CPIV、CAV-2、CDV檢測(cè)用PCR引物Table 2 PCR primer for detecting CPIV, CAV-2, CDV

    1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 利用Microsoft Excel 2007軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入、整理和分析。本試驗(yàn)中涉及的分類資料間的差異性情況通過卡方檢驗(yàn)進(jìn)行比較,通過回歸統(tǒng)計(jì)對(duì)CRCoV感染率與年齡的關(guān)系進(jìn)行分析。<0.05表示差異顯著,<0.01差異極顯著。

    2 結(jié) 果

    2.1 驗(yàn)證CRCoV檢測(cè)方法的特異性及穩(wěn)定性

    對(duì)臨床樣本進(jìn)行CRCoV盲測(cè),部分樣品擴(kuò)增后電泳得到了預(yù)期大小的目的條帶,圖1為盲測(cè)的CRCoV陽性樣本電泳圖。

    1. CRCoV第一輪擴(kuò)增結(jié)果;2. CRCoV第二輪結(jié)果;N.陰性對(duì)照;M. DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1. CRCoV first round; 2. CRCoV second round; N. Negative control; M. DNA molecular weight marker圖1 CRCoV陽性樣本PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR results of CRCoV-positive samples

    將3個(gè)不同時(shí)間內(nèi)獲得的CRCoV陽性擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行核苷酸測(cè)序,測(cè)序結(jié)果在Nucleotide BLAST上比對(duì),發(fā)現(xiàn)第一輪和第二輪擴(kuò)增條帶的核苷酸序列與已知的CRCoV毒株及牛冠狀病毒毒株的符合率均在96%以上,而與CCoV毒株的符合率均低于50%。這與國外研究結(jié)論相同,可表明該CRCoV的檢測(cè)方法特異性高。對(duì)碩騰衛(wèi)佳伍疫苗(含CPIV、CAV-2、CDV)及臨床中獲得的CCoV陽性糞便樣本進(jìn)行CRCoV RT-PCR檢測(cè),結(jié)果為陰性,說明CRCoV可被特異檢出。

    用所設(shè)計(jì)的PCR方法對(duì)5個(gè)CRCoV陽性樣本各進(jìn)行3次重復(fù)性試驗(yàn),均擴(kuò)增出相應(yīng)目的條帶,無其他雜帶,說明該引物和該方法穩(wěn)定性良好,可長期使用。

    2.2 CRCoV、CPIV、CAV-2、CDV檢出情況

    對(duì)所有487份樣品進(jìn)行CRCoV巢式RT-PCR檢測(cè),其中有104份檢出陽性,陽性率為21.36%;對(duì)2016年6月―2017年3月的321份樣品進(jìn)行CPIV RT-PCR檢測(cè),其中50份檢出陽性,陽性率15.58%;對(duì)2016年11月―2017年3月的156份樣品進(jìn)行CDV RT-PCR檢測(cè),其中22份檢出陽性,陽性率14.10%;對(duì)2016年11月―2017年3月的156份樣品進(jìn)行CAV-2 PCR檢測(cè),其中4份檢出陽性,陽性率2.56%(表3)。

    表3 CRCoV、CPIV、CAV-2、CDV檢出情況Table 3 The detection of CRCoV, CPIV, CAV-2, CDV

    CRCoV、CPIV混合感染的樣本數(shù)為11,CRCoV、CAV-2混合感染的樣本數(shù)為0,CRCoV、CDV混合感染的樣本數(shù)為6。CRCoV與CPIV、CAV-2、CDV的混合感染率分別為3.43%(11/321)、0%(0/156)和3.85%(6/156)。

    2.3 CRCoV流行趨勢(shì)

    2015年12月—2017年3月病毒檢出情況見圖2。整體而言,CRCoV在2015年末和2016年初的檢出率較高,隨著氣候變暖,檢出率逐漸下降(除7月份的檢出率較高),在2016年11月氣候轉(zhuǎn)冷時(shí)又有上升趨勢(shì)。

    圖2 2015年12月―2017年3月各月份CRCoV檢出率Fig.2 Positive rate of CRCoV from December 2015 to March 2017

    2.4 CRCoV感染與犬年齡的相關(guān)性

    在所有已檢測(cè)CRCoV的樣本中,有454份有年齡記錄,年齡跨度為1月齡~15歲,感染犬的年齡跨度為2月齡~12歲。犬的體況和免疫力隨年齡增長有一定變化規(guī)律,根據(jù)這種變化規(guī)律進(jìn)行年齡段劃分,每個(gè)分段均有CRCoV陽性犬分布。各年齡段犬感染CRCoV的情況見表4。回歸統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,犬的年齡與CRCoV感染之間無顯著性趨勢(shì);卡方檢驗(yàn)各年齡段間檢出率無顯著差異(>0.05)。

    表4 各年齡段犬CRCoV檢出情況Table 4 The detection of CRCoV in dogs of different ages

    2.5 CRCoV感染犬的呼吸道癥狀

    在呼吸道癥狀記錄完整的455例樣本中,有96例檢出CRCoV陽性。在這些CRCoV陽性犬中,無呼吸道癥狀的有31例,占所有無呼吸道癥狀犬(455例樣本中無呼吸道癥狀的有114例)的27.19%(31/114);呈現(xiàn)輕度呼吸道癥狀(鼻液、咳嗽)的有59例,占所有輕度呼吸道癥狀犬的19.73%(59/299);呈現(xiàn)中至重度呼吸道癥狀(肺炎)的有6例,占所有中至重度呼吸道癥狀犬的14.29%(6/42)(表5)。

    表5 CRCoV感染犬的呼吸道癥狀嚴(yán)重程度分布情況Table 5 Severity distribution of respiratory symptoms in CRCoV-infected dogs

    2016年11月—2017年3月,對(duì)156例樣本進(jìn)行了CRCoV、CPIV、CDV和CAV-2檢測(cè)。在這156例中,呼吸道癥狀記錄完整的有146例。在呈現(xiàn)無呼吸道癥狀的39只犬中,有8例為CRCoV陽性,此8例中有1例混合感染CPIV,混合感染率12.50%(1/8);在呈現(xiàn)輕度呼吸道癥狀的97只犬中,有17例為CRCoV陽性,此17例中有5例混合感染CPIV,2例混合感染CDV,混合感染率41.18%(7/17);在呈現(xiàn)中至重度呼吸道癥狀的10只犬中,有2例為CRCoV陽性,此2例均混合感染CDV,混合感染率100.00%(2/2)(表6)。發(fā)生呼吸道病毒(CPIV、CDV、CAV-2)混合感染的CRCoV感染犬的無呼吸道癥狀發(fā)生率、輕度呼吸道癥狀發(fā)生率以及中至重度呼吸道癥狀的發(fā)生率分別為10.00%(1/10)、70.00%(7/10)和20.00%(2/10)(表6)。

    表6 2016年11月—2017年3月CRCoV感染犬的呼吸道癥狀嚴(yán)重程度分布情況及混合感染情況Table 6 Distribution of respiratory symptom severity and mixed infection in CRCoV-infected dogs from November 2016 to March 2017

    3 討 論

    3.1 CRCoV流行病學(xué)概況

    一般來說,與人類一樣,犬呼吸道疾病在冬春季更易流行,尤其是在北方地區(qū)。如圖2所示,CRCoV檢出率的整體趨勢(shì)大致符合上述規(guī)律,但氣候炎熱的2016年7月份的檢出率比冬季的檢出率還高,這與部分地區(qū)人流感夏季暴發(fā)的情況相似,可能是室內(nèi)空調(diào)使用過度導(dǎo)致,也可能和夏季氣溫高、體能消耗大,犬發(fā)生應(yīng)激相關(guān)。

    各年齡段犬的CRCoV的感染率與年齡并無的線性關(guān)系(=0.020 2<1),且卡方檢驗(yàn)結(jié)果(=0.870 8>0.05)也表明各年齡段犬的CRCoV感染率并無差異。雖然國外文獻(xiàn)中提到2~8歲犬由于頻繁與外界其他犬接觸而呈現(xiàn)較高的CRCoV血清抗體陽性率,但病毒陽性率與血清抗體陽性率是兩個(gè)不同概念。

    據(jù)德國某文獻(xiàn)報(bào)道,在2011年7月—2012年7月,CRCoV與CPIV、CDV、CAV-2、支氣管敗血波氏桿菌的混合感染率分別為1.32%(2/151)、0%(0/151)、0%(0/151)、2.65%(4/151)。經(jīng)卡方檢驗(yàn)比較,本試驗(yàn)中CRCoV與CPIV、CDV、CAV-2的混合感染率與該文獻(xiàn)所報(bào)道的感染率無顯著差異(>0.05),即北京地區(qū)CRCoV與CPIV、CDV、CAV-2的混合感染率和德國基本相同。

    3.2 CRCoV感染犬的癥狀及CRCoV感染犬混合感染其他呼吸道病毒的癥狀分析

    為研究CRCoV的致病力強(qiáng)弱,將CRCoV感染犬的癥狀分為三類進(jìn)行分析。從表6來看,呈中至重度呼吸道癥狀的CRCoV感染犬有100.00%混合感染了其他呼吸道病毒,且這2例犬均混合感染了致病力強(qiáng)的CDV,故不能說明CRCoV致病力強(qiáng)。而呈無呼吸道癥狀和輕度呼吸道癥狀的CRCoV感染犬的混合感染率相對(duì)較低,分別為12.50%(1/8)和41.18%(7/17),且所有CRCoV感染犬有93.75%(90/96)表現(xiàn)無呼吸道癥狀及輕度呼吸道癥狀,無呼吸道癥狀的CRCoV感染犬占所有無呼吸道癥狀犬的比例較高(27.19%,表5),這說明CRCoV單一感染多表現(xiàn)為無呼吸道癥狀或輕度呼吸道癥狀,CRCoV對(duì)呼吸系統(tǒng)的致病力較弱。

    從表6來看,CRCoV感染混合感染其他呼吸道病毒(CPIV/CDV/CAV-2)的患犬共10只,多表現(xiàn)輕度呼吸道癥狀(70.00%),其次是中至重度呼吸道癥狀(20.00%),較少表現(xiàn)為無呼吸道癥狀(10.00%)。

    4 結(jié) 論

    北京地區(qū)CRCoV的分子流行率較高,在冬春季節(jié)更易流行,且各年齡段犬的檢出率差異不顯著。該病毒與CPIV、CAV-2、CDV的混合感染率較低。該病毒的致病力較弱,感染犬通常無呼吸道癥狀或表現(xiàn)輕度呼吸道癥狀。

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