Hlcs干擾對C2C12細(xì)胞成肌成脂分化后糖酵解基因表達(dá)的影響

代宇星，史銀銀，溫作晨，羅云燕，祝雪麗，鄭春婷，李淑英，洪 亮，張建斌，郭 亮，蒲 蕾

(天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 天津市農(nóng)業(yè)動(dòng)物繁育與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

全羧化酶合成酶(holocarboxylase synthetase, Hlcs)是動(dòng)物體內(nèi)多種羧化酶的合成酶，通過催化生物素與體內(nèi)無活性的羧化酶共價(jià)連接，使其形成有活性的羧化酶。Hlcs調(diào)控的羧化酶主要有乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase, ACC)、丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase, PC)、丙酰輔酶A羧化酶(propionyl-CoA carboxylase, PCC)和甲基巴豆酰輔酶A羧化酶(3-methylcrotonyl-coenzyme A carboxylase, MCC)4種。通過Hlcs合成產(chǎn)物酶之一ACC可以催化乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酸單酰輔酶A，阻止乙酰輔酶A進(jìn)入三羧酸循環(huán)。細(xì)胞糖酵解的產(chǎn)物丙酮酸穿梭進(jìn)入線粒體，可利用Hlcs合成產(chǎn)物酶之一PC轉(zhuǎn)化為草酰乙酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)能，并且PC在糖異生過程中也至關(guān)重要。因此Hlcs的產(chǎn)物酶與細(xì)胞糖酵解關(guān)系密切。缺失會(huì)導(dǎo)致生物素與羧化酶結(jié)合產(chǎn)生障礙，從而造成代謝產(chǎn)物在機(jī)體內(nèi)蓄積，使糖代謝出現(xiàn)障礙。

綜上表明，Hlcs與細(xì)胞糖酵解有關(guān)，但Hlcs對細(xì)胞糖酵解的影響鮮有報(bào)道。因此，本研究利用siRNA片段干擾基因，通過檢測在C2C12細(xì)胞成肌成脂分化過程中糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)情況，探明基因?qū)2C12細(xì)胞成肌成脂分化后糖酵解的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

C2C12細(xì)胞由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所豬遺傳育種創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、馬血清、胰島素購于Gibco公司；生物素(維生素B7)、轉(zhuǎn)膜液、電泳液和發(fā)光液購于索萊寶公司；Bodipy493/503染料購于Invitrogen公司；地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、油紅O染料購于Sigma公司；Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量染料均購于TaKaRa公司；Hlcs、Pkm和Gapdh一抗、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)購于碧云天生物技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購于上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；siRNA片段合成于吉瑪基因公司。

1.2 試驗(yàn)技術(shù)及方法

1.2.1 C2C12細(xì)胞的培養(yǎng)與siRNA轉(zhuǎn)染 將C2C12細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到70%匯合時(shí)，用胰蛋白酶消化細(xì)胞3～5 min，加入等量培養(yǎng)基終止消化，以1∶3比例接種細(xì)胞。

將對數(shù)期生長的細(xì)胞以每孔2.4×10個(gè)細(xì)胞的密度鋪入6孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后，更換為OPTI培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h，利用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染siRNA。siRNA處理8～12 h后，更換為生長培養(yǎng)基。

1.2.2 C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化及生物素處理 成肌分化：C2C12細(xì)胞接觸抑制后1 d，開始誘導(dǎo)分化。用含有2%孕馬血清和100 U·mL青鏈霉素的DMEM誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成肌分化，2 d后更換為生長培養(yǎng)基。

成脂分化：C2C12細(xì)胞接觸抑制后1 d，開始誘導(dǎo)分化。用孕馬血清成肌誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成肌分化2 d后，再用含有0.5 mg·L地塞米松、0.5 mmol·LIBMX、10 μg·mL胰島素的DMEM誘導(dǎo)液誘導(dǎo)成脂分化，最終分化為C2C12脂肪細(xì)胞。

生物素處理：前期研究發(fā)現(xiàn)1 μmol·L添加量為最適添加量。在誘導(dǎo)分化過程中，加入1 μmol·L濃度生物素處理細(xì)胞，共設(shè)4個(gè)處理組：1)對照組(NC)；2)生物素組(biotin)；3)干擾組(siHlcs)；4)生物素與干擾共同處理組(siHlcs+Biotin)。

1.2.3 油紅O染色和Bodipy染色 成脂分化C2C12細(xì)胞用PBS清洗2～3次，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15 min后，再用PBS清洗3次。

油紅O染色：油紅O染液37 ℃孵育30 min。再用PBS清洗3次。利用倒置顯微鏡觀察染色情況。

Bodipy染色：Bodipy染料避光孵育30 min，再用PBS清洗3次。加入DAPI染料，染核5 min，PBS洗3次。利用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 免疫熒光染色 C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)成肌分化4 d后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS清洗3次。通透液通透細(xì)胞15 min，PBS清洗1次。封閉液封閉1 h，PBS清洗1次。用封閉液按100∶1的比例稀釋一抗Myog，4 ℃孵育過夜或37 ℃孵育2 h。FITC熒光二抗，37 ℃避光孵育1.5 h。DAPI核染5 min，用PBS清洗3次，去除非特異染色，加入抗熒光淬滅劑。熒光顯微鏡下觀察染色后的肌管形態(tài)，并拍照。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量熒光PCR(RT-qPCR) 通過Primer軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。以cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系18 μL：2×qPCR Mix 9 μL，模板3 μL，上、下游引物各1 μL，ddHO 4 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以為內(nèi)參基因，且基因的相對表達(dá)量用2方法計(jì)算。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequences for real-time quantitative PCR

1.2.6 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting) 將C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化，提取分化6 d的細(xì)胞總蛋白。將變性處理后的蛋白在PAGE凝膠上進(jìn)行點(diǎn)樣，80 V 30 min后轉(zhuǎn)110 V 1.5 h，再將凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜2 h。在室溫下用5%脫脂奶封閉硝酸纖維膜30 min，加入Myog一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST清洗3次，每次10 min，再加入FITC二抗孵育2 h，最后用TBST清洗3次，每次10 min。用辣根過氧化物酶對硝酸纖維膜進(jìn)行曝光，獲得蛋白條帶，并利用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Hlcs基因及糖酵解相關(guān)基因在C2C12細(xì)胞成肌分化各個(gè)階段的時(shí)序表達(dá)

用2%馬血清誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成肌分化。C2C12細(xì)胞成肌分化重要階段的形態(tài)學(xué)觀察如圖1所示，圖1A中C2C12細(xì)胞為接觸抑制時(shí)的細(xì)胞形態(tài)，即細(xì)胞退出增殖期進(jìn)入分化期；圖1B為成肌誘導(dǎo)第1天的C2C12細(xì)胞，從圖中可以看出此時(shí)細(xì)胞縱向排列，少量細(xì)胞開始融合；圖1C中的C2C12細(xì)胞為成肌誘導(dǎo)第8天的細(xì)胞形態(tài)，肌管清晰可見且肌管數(shù)量增多。

A. 接觸抑制；B. 誘導(dǎo)成肌第1天；C. 誘導(dǎo)成肌第8天A. Contact inhibition; B. Myogenic day 1; C. Myogenic day 8圖1 C2C12成肌分化細(xì)胞形態(tài)Fig.1 C2C12 myoblast differentiation cell morphology

通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測細(xì)胞成肌分化第0、2、4、6、8天基因及酵解相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果如圖2所示，、、、-2基因的mRNA表達(dá)量先升高、后降低，在分化第4天表達(dá)量達(dá)到巔峰。、、、-2四者表達(dá)量趨勢一致，推測基因與細(xì)胞糖酵解具有相關(guān)性。

圖2 C2C12細(xì)胞成肌分化各階段Hlcs及糖酵解基因表達(dá)譜Fig.2 Expression profiles of Hlcs and glycolytic genes in various stages of myoblastic differentiation of C2C12

2.2 Hlcs基因及糖酵解相關(guān)基因在C2C12細(xì)胞成脂分化各個(gè)階段的時(shí)序表達(dá)

用“雞尾酒”誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞成脂分化。C2C12細(xì)胞成脂分化重要階段的形態(tài)學(xué)觀察如圖3所示，圖3A為C2C12細(xì)胞成脂誘導(dǎo)第1天時(shí)的細(xì)胞形態(tài)，可以看出此時(shí)細(xì)胞已經(jīng)匯合；圖3B為成脂誘導(dǎo)第3天的C2C12細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞有小的脂滴形成；圖3C為成脂誘導(dǎo)第8天時(shí)C2C12細(xì)胞的油紅O染色圖，可見小脂滴不斷聚集形成脂泡。

A. 誘導(dǎo)成脂分化第1天；B. 誘導(dǎo)成脂分化第3天；C. 誘導(dǎo)成脂分化第8天油紅O染色A. Induced adipogenic differentiation on day 1; B. Induced adipogenic differentiation on day 3; C. The Oil red O staining of C2C12 on day 8 of induced adipogenic differentiation圖3 C2C12細(xì)胞成脂分化與油紅O染色Fig.3 Adipogenic differentiation of C2C12 cells and Oil red O staining

通過實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測成脂分化第0、2、4、6、8天基因及糖酵解相關(guān)基因的mRNA表達(dá)變化。結(jié)果如圖4所示，、、、-2的mRNA表達(dá)量均呈增加趨勢，第2～4天表達(dá)量增加較第0～2天快，并在第8天表達(dá)量達(dá)到巔峰，且、、、-2四者mRNA表達(dá)量趨勢一致。

圖4 C2C12細(xì)胞成脂分化各階段Hlcs及糖酵解基因表達(dá)譜Fig.4 Expression profiles of Hlcs and glycolytic genes in various stages of lipogenic differentiation of C2C12 cell

2.3 siHlcs在成肌分化的C2C12細(xì)胞中對糖酵解基因表達(dá)的影響

用siRNA干擾片段降低基因的表達(dá)，用2%馬血清誘導(dǎo)成肌分化，在熒光倒置顯微鏡下觀察C2C12細(xì)胞成肌分化情況，結(jié)果如圖5所示，與NC組相比，生物素和siHlcs處理C2C12細(xì)胞后，其肌管數(shù)量明顯變少，且肌管融合指數(shù)顯著低于NC組(<0.05)。

A. Myog 免疫熒光染色；B.融合指數(shù)(融合指數(shù)為多核肌管核數(shù)(大于等于兩個(gè)細(xì)胞核)與總細(xì)胞核數(shù)的比例)A. Myog immunofluorescence staining; B. Fusion index (The fusion index is the ratio of the number of multinucleated myotubular nuclei (greater than or equal to two nuclei) to the total number of nuclei)圖5 C2C12細(xì)胞成肌分化免疫熒光染色Fig.5 Myogenic differentiation of C2C12 cells by immunofluorescence staining

RT-qPCR檢測mRNA結(jié)果如圖6所示。由圖6A可知，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了的mRNA表達(dá)量(<0.05)；圖6B顯示，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著升高了的mRNA表達(dá)量(<0.05)；由圖6C可知，與NC組相比，添加生物素組顯著升高了-2的表達(dá)量(<0.05)，而siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了-2的mRNA表達(dá)量(<0.05)；由圖6D可知，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了的mRNA表達(dá)量(<0.05)。此外，Western blotting結(jié)果顯示(圖6E-G)，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著降低了Hlcs的蛋白豐度(<0.05)；與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs和生物素共同處理組均顯著升高了Pkm的蛋白豐度(<0.05)。

A. Hlcs mRNA相對表達(dá)量；B. Pkm mRNA相對表達(dá)量；C. Hk-2 mRNA相對表達(dá)量；D. Pfkm mRNA相對表達(dá)量；E. Hlcs、Pkm蛋白的免疫印跡；F. Hlcs蛋白的免疫印跡定量分析；G. Pkm蛋白的免疫印跡定量分析。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同A. Relative mRNA expression of Hlcs; B. Relative mRNA expression of Pkm; C. Relative mRNA expression of Hk-2; D. Relative mRNA expression of Pfkm; E. Protein immunoblotting of Hlcs and Pkm; F. Quantitative analysis of Western blotting of Hlcs; G. Quantitative analysis of Western blotting of Pkm. Different lowercase letters mean significant difference (P<0.05), the same as below圖6 Hlcs基因干擾對C2C12成肌分化過程中酵解基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of Hlcs gene interference on the expression of glycolysis genes during myoblast differentiation of C2C12

2.4 siHlcs在成脂分化的C2C12細(xì)胞中對糖酵解基因的影響

用siRNA干擾的表達(dá)，用Bodipy染色檢測siHlcs對C2C12細(xì)胞成脂分化的影響，結(jié)果如圖7所示，與NC組相比，添加生物素組脂滴形成減少，siHlcs組脂滴形成減少，而siHlcs與生物素共同處理則可緩解siHlcs的抑制作用。

A. 脂滴Bodipy染色；B. Bodipy熒光強(qiáng)度量化圖A．Lipid droplet Bodipy staining；B. Bodipy fluorescence intensity quantification diagram圖7 C2C12細(xì)胞成脂分化Bodipy染色Fig.7 Adipogenic differentiation of C2C12 cells by Bodipy staining

RT-qPCR檢測mRNA表達(dá)量結(jié)果如圖8所示。由圖8A可知，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs與生物素共同處理組均顯著降低了的mRNA表達(dá)量。圖8B顯示，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組、siHlcs與生物素共同處理組均顯著升高了的mRNA表達(dá)量。圖8C中，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組顯著降低了-2的mRNA表達(dá)量，而siHlcs與生物素共同處理組無顯著差異(>0.05)。Western blotting結(jié)果顯示，與NC組相比，添加生物素組、siHlcs組和siHlcs與生物素共同處理組均顯著降低了Hlcs的蛋白表達(dá)量(圖8F)，而添加生物素組和siHlcs組均能上調(diào)Pkm的蛋白表達(dá)量，siHlcs與生物素共同處理組與NC組相比無顯著差異(圖8G)。

A. Hlcs mRNA相對表達(dá)量；B. Pkm mRNA相對表達(dá)量；C. Hk-2 mRNA相對表達(dá)量；D. Pfkm mRNA相對表達(dá)量；E. Hlcs、Pkm蛋白的免疫印跡；F. Hlcs蛋白的免疫印跡定量分析；G. Pkm蛋白的免疫印跡定量分析A. Relative mRNA expression of Hlcs; B. Relative mRNA expression of Pkm; C. Relative mRNA expression of Hk-2; D. Relative mRNA expression of Pfkm; E. Protein immunoblotting of Hlcs and Pkm; F. Quantitative analysis of Western blotting of Hlcs; G. Quantitative analysis of Western blotting of Pkm圖8 Hlcs基因干擾對C2C12成脂分化過程中酵解基因表達(dá)的影響Fig.8 Effects of Hlcs gene interference on the expression of glycolysis genes during adipogenic differentiation of C2C12

3 討 論

細(xì)胞中葡萄糖的利用分為兩部分，一部分是糖酵解，另一部分是通過糖酵解終產(chǎn)物進(jìn)入三羧酸循環(huán)產(chǎn)能。細(xì)胞糖酵解是利用己糖激酶(hexokinase 2，Hk-2)、磷酸果糖激酶(phosphofructokinase，Pfkm)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase，Pkm)等將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)楸岬倪^程。本研究發(fā)現(xiàn)，C2C12細(xì)胞成肌分化過程中、、和-2基因呈先升高，第4天時(shí)表達(dá)量最高，之后降低的表達(dá)趨勢。這可能是因?yàn)榧?xì)胞在成肌分化中期，細(xì)胞融合形成肌管，需要大量能量。本研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12成肌分化后期表達(dá)量下降，與孫慧

研究在衰老間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)量下降的結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著C2C12細(xì)胞成脂分化的進(jìn)行，基因的表達(dá)量逐漸升高，且在C2C12細(xì)胞成脂分化的后期、和-2基因表達(dá)量升高，可能與肌內(nèi)脂肪細(xì)胞主要通過周圍肌肉細(xì)胞提供的葡萄糖為來源合成脂肪，隨著分化的進(jìn)行，細(xì)胞需要產(chǎn)生更多的脂肪，糖酵解速率加快，產(chǎn)生更多的中間產(chǎn)物(如乙酰輔酶A)轉(zhuǎn)化為脂肪。所以C2C12細(xì)胞隨著成脂分化的進(jìn)行糖酵解基因表達(dá)量逐漸增加。

基于前期研究發(fā)現(xiàn)，基因與C2C12細(xì)胞不同分化狀態(tài)下糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)趨勢相同，且基因的下游羧化酶與糖酵解功能密切相關(guān)，故進(jìn)行后續(xù)干擾相關(guān)研究。細(xì)胞糖酵解過程只產(chǎn)生少量的ATP，但糖酵解中間產(chǎn)物可作為原料合成氨基酸。C2C12細(xì)胞成肌分化過程中對照組細(xì)胞糖酵解基因表達(dá)高，酵解活動(dòng)旺盛，中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為氨基酸。干擾基因后，與對照組相比，和-2表達(dá)量顯著降低。Hlcs作為全羧化酶合成酶，其表達(dá)量降低，PC的合成受阻，從而限制丙酮酸在線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，導(dǎo)致草酰乙酸減少，三羧酸循環(huán)無法順利進(jìn)行。草酰乙酸和三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物合成障礙，無法順利合成相應(yīng)氨基酸，導(dǎo)致相關(guān)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)蓄積，抑制和-2表達(dá)。且有研究證明，基因敲除的豬腎上皮細(xì)胞的糖酵解效率降低，造成糖酵解中間產(chǎn)物的積累，影響到線粒體活性，抑制細(xì)胞ATP的產(chǎn)生。細(xì)胞成肌分化過程中，肌肉糖代謝中間產(chǎn)物如丙酮酸和草酰乙酸等合成非必須氨基酸。C2C12細(xì)胞成肌分化過程中干擾基因后基因的表達(dá)增加，可能是因?yàn)槿笔?，?dǎo)致PC缺失，丙酮酸無法轉(zhuǎn)化成草酰乙酸，無法生成相應(yīng)氨基酸，導(dǎo)致Pkm的表達(dá)代償性增加。也有可能缺失減少了PC合成，導(dǎo)致草酰乙酸增補(bǔ)減少，進(jìn)而使磷酸烯醇式丙酮酸合成減少。加之糖酵解上游的和-2表達(dá)降低，同時(shí)導(dǎo)致磷酸烯醇式丙酮酸的合成降低，是否代償性導(dǎo)致Pkm表達(dá)增加尚不明確。生物素是多種羧化酶的輔助因子，可催化葡萄糖生成和氨基酸分解的關(guān)鍵反應(yīng)。缺乏生物素會(huì)導(dǎo)致葡萄糖的利用率降低，從而阻礙糖酵解反應(yīng)的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)，在成肌分化C2C12細(xì)胞中，添加生物素會(huì)上調(diào)Pkm、-2的表達(dá)，可能是由于添加生物素后，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)AMPK活性，從而促進(jìn)葡萄糖吸收而抑制糖異生，加速糖酵解進(jìn)程。

與成肌細(xì)胞不同，成脂細(xì)胞內(nèi)的大量能量向合成脂肪酸的途徑流轉(zhuǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，在C2C12細(xì)胞成脂分化中，干擾基因后Pkm表達(dá)量同樣增高。除了磷酸烯醇式丙酮酸減少導(dǎo)致Pkm代償性增加的原因外，還有可能是因?yàn)楸磉_(dá)量降低后，ACC缺失，乙酰輔酶A在ACC的催化下轉(zhuǎn)化為丙二酰單酰輔酶A受阻，無法起始脂肪酸合成途徑，導(dǎo)致脂肪酸含量降低，從而促進(jìn)Pkm的活性。有報(bào)道稱，高濃度長鏈脂肪酸會(huì)抑制Pkm的活性。加之高強(qiáng)度的成脂誘導(dǎo)分化，細(xì)胞內(nèi)需要大量的乙酰輔酶A合成脂肪，但是又由于缺乏ACC無法順利合成，所以代償性的增加Pkm，促進(jìn)丙酮酸的生成，進(jìn)而促進(jìn)乙酰輔酶A的產(chǎn)生。脂肪酸合成途徑中，三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系使用檸檬酸作為乙?；妮d體，將線粒體產(chǎn)生的乙酰輔酶A轉(zhuǎn)移到細(xì)胞溶膠中參與脂肪酸合成。本研究發(fā)現(xiàn)，在成脂分化的C2C12細(xì)胞中，干擾基因后表達(dá)量升高?？赡苁且?yàn)楦蓴_使ACC和PC合成受阻，導(dǎo)致三羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)體系中草酰乙酸的合成減少，丙酮酸產(chǎn)生更多的乙酰輔酶A，乙酰輔酶A無法合成脂肪，也由于缺乏草酰乙酸，乙酰輔酶A無法和草酰乙酸順利合成檸檬酸。所以與對照組相比，低濃度檸檬酸促進(jìn)Pfkm的表達(dá)。與對照組相比，在成脂過程中，干擾組ACC和PC缺乏，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)受限，脂肪生成受阻，導(dǎo)致ADP在體內(nèi)蓄積，ADP為Pfkm的促進(jìn)劑，促進(jìn)6-磷酸果糖利用Pfkm合成1,6-二磷酸果糖。上述過程均與脂肪生成有關(guān)，而-2基因是細(xì)胞糖酵解的初始階段，單獨(dú)受6磷酸葡萄糖含量的調(diào)控。成脂過程中，基因缺乏導(dǎo)致-2基因表達(dá)下調(diào)的原因尚待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在C2C12細(xì)胞成肌和成脂分化過程中，糖酵解相關(guān)基因-2、、mRNA的表達(dá)與基因表達(dá)趨勢一致；干擾基因可以抑制成肌分化C2C12細(xì)胞和-2基因的表達(dá)，促進(jìn)Pkm的表達(dá)；而促進(jìn)成脂分化C2C12細(xì)胞和Pkm的表達(dá)，抑制-2基因的表達(dá)；添加生物素能夠促進(jìn)C2C12細(xì)胞成肌成脂分化后酵解相關(guān)基因的表達(dá)。證明基因和生物素在C2C12細(xì)胞酵解過程中有重要調(diào)控作用。