竹蓀水提物抗氧化及改善秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)代謝作用

肖嵋方，陳欣彤，蔡雯雯，李 娜，陳海明，劉 斌,3,*，曾 峰,*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002；2.海南省食品營(yíng)養(yǎng)與功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228；3.福建農(nóng)林大學(xué) 國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002）

目前，肥胖和高脂血癥的高患病率被視為公共衛(wèi)生的主要威脅，全球約有5億5千萬(wàn)肥胖人口和14億超重人口。越來(lái)越多的科學(xué)研究證實(shí)，肥胖可導(dǎo)致胰島素抵抗、II型糖尿病、心血管疾病等代謝類(lèi)疾病，如何科學(xué)有效地預(yù)防、改善肥胖和高脂血癥一直是科學(xué)研究的重大挑戰(zhàn)。

食用菌富含多糖、活性蛋白和多肽、黃酮及多酚類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)與功能活性物質(zhì)，具有極高的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，在抗氧化、降血脂、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抑菌和抗腫瘤等方面應(yīng)用廣泛。為探究食用菌水提物在脂質(zhì)代謝及調(diào)控上發(fā)揮的作用，趙圓圓通過(guò)建立高脂動(dòng)物模型研究杏鮑菇多糖（polysaccharides，PEP）的降脂作用，發(fā)現(xiàn)PEP能顯著降低總膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白膽固醇的含量，且降脂功效具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，還通過(guò)血清代謝組分析發(fā)現(xiàn)PEP參與機(jī)體甘油磷脂和脂肪酸代謝，改善能量代謝，其機(jī)制可能與腺苷酸活化蛋白激酶-乙酰輔酶A羧化酶等信號(hào)通路發(fā)生改變相關(guān)。竹蓀（）作為“菌中皇后”，富含多糖等活性物質(zhì)，在改善脂質(zhì)代謝方面同樣有廣泛的利用價(jià)值，Wang Wenshuai等發(fā)現(xiàn)從竹蓀子實(shí)體分離的多糖成分能夠減輕肥胖小鼠體質(zhì)量，改善肥胖相關(guān)的肝腎代謝異常，穩(wěn)定血脂，降低胰島素和瘦素的耐受性，還對(duì)機(jī)體氧化應(yīng)激損傷有恢復(fù)作用。由此可知，竹蓀等食用菌以其自身營(yíng)養(yǎng)功能優(yōu)勢(shì)在改善食源性肥胖、降血脂方面有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)（簡(jiǎn)稱(chēng)線(xiàn)蟲(chóng)）是抗氧化、抗衰老相關(guān)功能評(píng)價(jià)的常用模式生物之一，其同源基因已被證實(shí)與人類(lèi)高度相似，且研究還發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)蟲(chóng)參與脂質(zhì)合成和代謝的機(jī)制同樣可與人體聯(lián)系，能夠作為功效成分降脂作用的評(píng)價(jià)模型。目前，竹蓀中的活性成分與抗氧化和降脂功效有關(guān)的研究多集中在水提多糖，而關(guān)于竹蓀水提物中的其他成分如蛋白、多酚及黃酮類(lèi)化合物等與多糖作為整體發(fā)揮聯(lián)合效應(yīng)的研究較少，因此，本研究采用熱水浸提法制備竹蓀水提物，并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，再以線(xiàn)蟲(chóng)為模型，評(píng)價(jià)其對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗應(yīng)激和減少脂質(zhì)積累的能力，通過(guò)測(cè)定其對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的調(diào)控作用，分析竹蓀水提物的降脂功效，以期為竹蓀等食用菌營(yíng)養(yǎng)功能性食品的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長(zhǎng)裙竹蓀子實(shí)體 福建省古田縣戴氏果蔬專(zhuān)業(yè)合作社；野生N2型秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng) 福建上源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、油紅O 北京索萊寶科技有限公司；2,2’-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）上海源葉生物科技有限公司；Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；TG2003甘油三酯試劑盒 南京建成生物工程公司；UNlQ-10柱式總RNA抽提試劑盒、M-MuLV型cDNA合成試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；Novoprotein E047-01A型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒 上海近岸蛋白有限公司；巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 揚(yáng)州市博睿糖生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MK3型酶標(biāo)儀、ICS5000型離子色譜儀、ABI7900熒光定量PCR儀 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；DHG-9203A型熒光電子顯微鏡 德國(guó)蔡司公司；SRA03-11型恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SX2-2.5-10G型馬弗爐 山東歐萊博儀器有限公司；MA35M型全自動(dòng)紅外線(xiàn)水分測(cè)定儀 濟(jì)南愛(ài)來(lái)寶儀器有限公司；LC-10A型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 竹蓀水提物的制備

參照Liu Xiaoyan等的方法制備竹蓀水提物。竹蓀經(jīng)烘干、磨粉、過(guò)40 目篩得到竹蓀粗粉。稱(chēng)取100 g竹蓀粗粉，按料液比1∶35（/）加入去離子水，于92 ℃恒溫水浴鍋熱水浸提2 h，4 000 r/min離心20 min，收集上清液，70 ℃蒸發(fā)濃縮至原體積的1/10，凍干得到竹蓀水提物，貯藏在-20 ℃條件下備用，待后續(xù)指標(biāo)分析。

1.3.2 竹蓀水提物的組成分析

1.3.2.1 總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)

參照溫文娟等的研究，采用苯酚-硫酸法測(cè)定竹蓀水提物的總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.2 總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)

參照Yu等的方法，采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定竹蓀水提物的總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.3 水分、總灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

采用全自動(dòng)紅外線(xiàn)水分測(cè)定儀測(cè)定竹蓀水提物水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，具體操作參考儀器說(shuō)明書(shū)，平行測(cè)定3 次。

參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中灰分的測(cè)定》測(cè)定竹蓀水提物中灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.4 脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)

參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》測(cè)定脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.5 竹蓀水提物中多糖的組成分析

樣品預(yù)處理：參照1.3.1節(jié)方法制備竹蓀水提物提取液，70 ℃蒸發(fā)濃縮至原體積的1/8，然后加入4 倍體積的無(wú)水乙醇，混勻后靜置24 h，過(guò)濾收集沉淀，凍干得到多糖。精密稱(chēng)量10 mg多糖樣品置于安瓿瓶中，加入10 mL 3 mol/L三氟乙酸溶液，120 ℃水解3 h，通入氮?dú)獯蹈?。加?0 mL去離子水渦旋混勻，取100 μL加入900 μL去離子水，然后12 000 r/min離心5 min。取上清液采用離子色譜儀進(jìn)行分析。

檢測(cè)條件：色譜柱：DionexCarbopacTMPA20（3 mm×150 mm）；流動(dòng)相A：超純水；流動(dòng)相B：15 mmol/L NaOH溶液；流動(dòng)相C：含15 mmol/L NaOH的100 mmol/L醋酸鈉溶液；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：30 ℃；檢測(cè)器：電化學(xué)檢測(cè)器。洗脫程序：0.0～18.0 min，98.8% A、1.2% B、0.0% C；20.0～30.0 min，50.0% A、50.0% B、0.0% C；30.1～46.0 min，0.0% A、0.0% B、100.0% C；46.1～50.0 min，0.0% A、100.0% B、0.0% C；50.1～60.0 min，98.8% A、1.2% B、0.0% C；60.1～80.0 min，98.8% A、1.2% B、0.0% C。

取巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、鹽酸氨基葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制質(zhì)量濃度均為5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液作為混標(biāo)。采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，根據(jù)峰面積計(jì)算竹蓀水提物多糖中不同單糖的含量，并計(jì)算物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)。

1.3.2.6 竹蓀水提物中多糖分子質(zhì)量的測(cè)定

利用高效凝膠滲透色譜（high performance gel perme ation chromatography，HPGPC）法采用高效液相色譜儀測(cè)定多糖分子質(zhì)量和純度。樣品及標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制：精密稱(chēng)取樣品和葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品（分子質(zhì)量分別為1 152、5 000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da），配制質(zhì)量濃度為5 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后備用。

色譜條件：色譜柱：BRT105-104-102串聯(lián)凝膠柱（8 mm×300 mm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L NaCl溶液；流速：0.6 mL/min，柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；檢測(cè)器：RI-10A示差檢測(cè)器。

以標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)（底數(shù)為10）為縱坐標(biāo)，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程和竹蓀水提物中多糖組分的保留時(shí)間計(jì)算竹蓀水提物中主要多糖組分的分子質(zhì)量。

1.3.3 體外抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.3.1 DPPH自由基清除率

參照文獻(xiàn)[18-19]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)竹蓀水提物分別配制成1、2、3、4、5 mg/mL水溶液。實(shí)驗(yàn)組分別以500 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與500 μL DPPH溶液（0.4 mmol/L）混合。以等體積無(wú)水乙醇作為空白對(duì)照，以等體積VC溶液（1、2、3、4、5 mg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照。室溫下避光反應(yīng)30 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定517 nm波長(zhǎng)處吸光度，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3 次。對(duì)質(zhì)量濃度與清除率關(guān)系進(jìn)行線(xiàn)性擬合計(jì)算竹蓀水提物對(duì)DPPH自由基的半抑制質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）。

1.3.3.2 羥自由基清除率

參照文獻(xiàn)[20-21]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)竹蓀水提物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL水溶液。實(shí)驗(yàn)組分別將500 μL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液與250 μL FeSO溶液（1.5 mmol/L）、115 μL HO溶液（6.7 mmol/L），混勻，以等體積去離子水作為空白對(duì)照，以等體積VC溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照。37 ℃水浴10 min后，加入75 μL水楊酸溶液（20 mmol/L），置于水浴鍋反應(yīng)30 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液測(cè)定562 nm波長(zhǎng)處吸光度，每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3 次，計(jì)算水提物對(duì)羥自由基的IC。

1.3.3.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

參照文獻(xiàn)[22]的方法并稍作修改。將1.3.1節(jié)竹蓀水提物分別配制成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL水溶液。將ABTS母液用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4、0.01 mol/L，下同）稀釋至在734 nm波長(zhǎng)處吸光度為0.70±0.02，配得ABTS工作液。按照50 μL/孔在96 孔板中加入不同質(zhì)量濃度竹蓀水提物水溶液，30 ℃下靜置3 min，然后每孔加入150 μL ABTS工作液混合，30 ℃反應(yīng)6 min，測(cè)定734 nm波長(zhǎng)處吸光度，以等體積PBS作為空白對(duì)照，以等體積VC溶液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL）作為陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)質(zhì)量濃度平行測(cè)定3 次，計(jì)算水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的IC。

1.3.4 線(xiàn)蟲(chóng)同步化與分組

線(xiàn)蟲(chóng)同步化和培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[23]的方法并稍作修改。挑取成蟲(chóng)置于新鮮NGM培養(yǎng)基，于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待其產(chǎn)卵后將成蟲(chóng)挑出，在培養(yǎng)基中加入100 μL OP50（尿嘧啶缺陷大腸桿菌）培養(yǎng)液（OD為0.4～0.6，后同），繼續(xù)培養(yǎng)48 h，即完成線(xiàn)蟲(chóng)的同步化，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將竹蓀水提物溶解在OP50培養(yǎng)液中，配制竹蓀水提物培養(yǎng)液。挑取同步化的成蟲(chóng)，分為4 組，每日分別給予100 μL OP50培養(yǎng)液（空白組）、0.25 mg/mL竹蓀水提物培養(yǎng)液（低劑量組）、0.5 mg/mL竹蓀水提物培養(yǎng)液（中劑量組）與1.0 mg/mL竹蓀水提物培養(yǎng)液（高劑量組），每日更換NGM培養(yǎng)基，72 h后收集蟲(chóng)體，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9]的方法并稍作修改。取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲(chóng)體（＝30），轉(zhuǎn)移至加有15 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% HO溶液的NGM培養(yǎng)基（10 mL）上，每隔1 h觀察線(xiàn)蟲(chóng)存活情況并記錄存活線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量，直至線(xiàn)蟲(chóng)全部死亡，重復(fù)測(cè)定3 次，分別按式（1）、（2）計(jì)算各組線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激的存活率和平均壽命，并繪制生存曲線(xiàn)（不同時(shí)間下的存活率情況）。

式中：x為第小時(shí)存活的線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量；為初始總線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量。

取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲(chóng)體（＝30），轉(zhuǎn)移至新鮮NGM培養(yǎng)基上，于38 ℃培養(yǎng)，每隔1 h觀察線(xiàn)蟲(chóng)存活情況并記錄存活線(xiàn)蟲(chóng)數(shù)量，直至線(xiàn)蟲(chóng)全部死亡，重復(fù)測(cè)定3 次，分別按式（1）、（2）計(jì)算各組抗熱應(yīng)激的存活率和平均壽命，并繪制生存曲線(xiàn)。

1.3.6 油紅O染色

參照文獻(xiàn)[24-25]的方法并稍作修改。取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲(chóng)體（＝30），加1 mL M9緩沖液，3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入200 μL油紅O染色液，染色2 h后，3 000 r/min離心5 min，棄去上清液，用M9緩沖液洗去多余染液，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。選擇去頭尾的線(xiàn)蟲(chóng)中段，運(yùn)用Image-Pro Plus6.0軟件處理圖片計(jì)算各竹蓀活性物質(zhì)組與空白組線(xiàn)蟲(chóng)油紅O染色光密度值的比值，即為各劑量組線(xiàn)蟲(chóng)體脂的相對(duì)光密度值。

1.3.7 甘油三酯濃度的測(cè)定

取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲(chóng)體（＝150），加1 mL M9緩沖液，3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，然后繼續(xù)用M9緩沖液洗滌3 次，收集沉淀。加入200 μL預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，冰上孵育1 h后勻漿處理，3 000 r/min離心5 min，取上清液采用甘油三酯試劑盒測(cè)定甘油三酯濃度。

1.3.8 脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)水平的測(cè)定

取1.3.4節(jié)收集的4 組蟲(chóng)體（＝150），加20 μL M9緩沖液，依次進(jìn)行總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用SYBR染料法和ABI 7300 PCR系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。擴(kuò)增條件：95 ℃，1 min；95 ℃，20 s；60 ℃，1 min，40 個(gè)循環(huán)。相關(guān)引物的設(shè)計(jì)如表1所示，以為內(nèi)參基因，基因相對(duì)表達(dá)水平采用2法計(jì)算。

表1 線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for amplification of lipid metabolismrelated genes in C. elegans

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Excel和Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及作圖。采用Excel軟件進(jìn)行顯著性分析，采用檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，＜0.05和＜0.01分別表示差異顯著和差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹蓀水提物的總糖、總蛋白、水分和灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

竹蓀水提物的總糖、總蛋白、粗脂肪、水分和灰分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為（38.5±1.5）%、（14.4±1.2）%、（1.6±0.1）%、（17.9±0.3）%、（23.4±1.9）%。由此可知，竹蓀水提物中總糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，說(shuō)明糖類(lèi)組分在竹蓀水提物中的占比最大。

2.2 竹蓀水提物的單糖組成和分子質(zhì)量

2.2.1 單糖組成

由圖1、表2可知，竹蓀水提物主要由巖藻糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖和葡萄糖組成，且葡萄糖的占比最大（物質(zhì)的量分?jǐn)?shù)達(dá)到85.3%），其次是半乳糖和巖藻糖。

表2 竹蓀水提物的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of water extract from D. indusiate

圖1 竹蓀水提物的單糖組成離子色譜圖Fig. 1 Ion chromatogram of monosaccharide composition of water extract from D. indusiate

2.2.2 分子質(zhì)量

由葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品得到的校正曲線(xiàn)方程為＝-0.206 5+12.529，＝0.995 3。由圖2可知，竹蓀水提物中多糖分子質(zhì)量分布較廣泛，4 個(gè)主要組分的分子質(zhì)量依次為5.64×10、2.80×10、8.00×10、77.0 Da。

圖2 竹蓀水提物多糖的HPGPC圖Fig. 2 High performance gel permeation chromatogram of polysaccharides from water extract from D. indusiate

2.3 竹蓀水提物的體外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除率

如圖3所示，1～5 mg/mL竹蓀水提物質(zhì)量濃度與DPPH自由基清除率呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。5 mg/mL竹蓀水提物的DPPH自由基清除率達(dá)84.13%，但低于該質(zhì)量濃度下VC的清除率（97.20%）。竹蓀水提物對(duì)DPPH自由基的IC為2.36 mg/mL。

圖3 竹蓀水提物對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of water extract from D. indusiate

2.3.2 羥自由基清除率

由圖4可知，0.5～2.5 mg/mL竹蓀水提物對(duì)羥自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，2.5 mg/mL竹蓀水提物的羥自由基清除率達(dá)到80.91%，但低于該質(zhì)量濃度下VC的清除率（95.50%）。竹蓀水提物對(duì)羥自由基的IC為1.44 mg/mL。

圖4 竹蓀水提物對(duì)羥自由基的清除能力Fig. 4 Hydroxyl radical scavenging capacity of water extract from D. indusiate

2.3.3 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率

由圖5可知，0.5～2.5 mg/mL竹蓀水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系。2.5 mg/mL竹蓀水提物的ABTS陽(yáng)離子自由基清除率達(dá)到最大（79.38%），但低于該質(zhì)量濃度下VC的清除率（96.45%），竹蓀水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的IC為0.86 mg/mL。

圖5 竹蓀水提物對(duì)ABTS陽(yáng)離子自由基的清除能力Fig. 5 ABTS cation radical scavenging capacity of water extract from D. indusiate

2.4 竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激的影響

添加HO的NGM培養(yǎng)基能夠引起線(xiàn)蟲(chóng)產(chǎn)生急性氧化應(yīng)激，使機(jī)體細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平增加，從而激活線(xiàn)粒體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由圖6可知，HO對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的刺激作用較強(qiáng)，線(xiàn)蟲(chóng)的存活率急劇下降，而與空白組相比，不同劑量竹蓀水提物組線(xiàn)蟲(chóng)的平均壽命均極顯著延長(zhǎng)（＜0.01），低、中、高劑量組的平均壽命分別延長(zhǎng)了20.4%、32.7%、54.6%，且竹蓀水提物質(zhì)量濃度與線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激的壽命存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖6 竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化應(yīng)激的影響（n＝30）Fig. 6 Effect of water extract from D. indusiate on antioxidant stress in C. elegans (n = 30)

2.5 竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗熱應(yīng)激的影響

熱應(yīng)激是指動(dòng)物暴露在熱環(huán)境中產(chǎn)生的一系列高溫性全身急性炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致動(dòng)物休克甚至死亡。由圖7可知，在38 ℃熱刺激下，線(xiàn)蟲(chóng)的存活率隨時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，與空白組相比，竹蓀水提物各劑量組線(xiàn)蟲(chóng)的存活率明顯升高；此外，竹蓀水提物各劑量組的抗熱應(yīng)激平均壽命更長(zhǎng)，其中，與空白組相比，中、高劑量組平均壽命分別顯著延長(zhǎng)了6.6%和19.8%（＜0.05）。

圖7 竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)抗熱應(yīng)激的影響（n＝30）Fig. 7 Effect of water extract from D. indusiate on heat stress resistance in C. elegans (n = 30)

2.6 竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂質(zhì)積累的影響

2.6.1 油紅O染色觀察結(jié)果

未經(jīng)染色的線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)體在顯微鏡下呈透明色，當(dāng)固定后的線(xiàn)蟲(chóng)被置于油紅O工作液中時(shí)，染料能與線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的甘油三酯結(jié)合，溶于組織細(xì)胞脂質(zhì)中，使組織內(nèi)的脂滴呈現(xiàn)紅色。使用熒光顯微鏡拍攝線(xiàn)蟲(chóng)體脂染色情況，顯微鏡下各劑量組線(xiàn)蟲(chóng)形態(tài)如圖8所示，空白組線(xiàn)蟲(chóng)蟲(chóng)體顏色整體較深，各劑量組蟲(chóng)體中段的染色面積隨竹蓀水提物質(zhì)量濃度增大而逐漸減小，且在中、高劑量組中表現(xiàn)比較明顯。由圖9可知，1.0 mg/mL竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)降脂功效最佳，低、中、高劑量組的相對(duì)光密度值分別為空白組的71.6%、53.0%、43.0%。與空白組相比，竹蓀水提物高劑量組線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的脂質(zhì)沉積極顯著減少了57.0%（＜0.01）。整體來(lái)看，竹蓀水提物能極顯著減少線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪積累。

圖8 線(xiàn)蟲(chóng)油紅O染色圖（6×）Fig. 8 Photographs of oil red O staining (6 ×)

圖9 線(xiàn)蟲(chóng)油紅O染色后相對(duì)光密度值Fig. 9 Relative optical density after oil red O staining

2.6.2 甘油三酯濃度

線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的脂質(zhì)主要積累在皮下細(xì)胞及腸道組織內(nèi)，甘油三酯是線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)的主要組成，常作為判定脂質(zhì)代謝紊亂的標(biāo)準(zhǔn)之一。由圖10可知，與空白組相比，竹蓀水提物能夠減少線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂質(zhì)的積累，且隨著質(zhì)量濃度的升高，線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)甘油三酯濃度逐漸降低，最低為0.548 mmol/L，與空白組相比極顯著降低了40.5%（＜0.01）。

圖10 竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)甘油三酯濃度的影響Fig. 10 Effect of water extract from D. indusiate on TG content in C. elegans

2.7 竹蓀水提物對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的影響

線(xiàn)蟲(chóng)的脂質(zhì)代謝是極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及的脂質(zhì)代謝相關(guān)通路與人類(lèi)高度同源，包括脂肪酸的合成、氧化分解，此外還與糖代謝和能量代謝有關(guān)。線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)代謝通路主要有5 條，測(cè)定各代謝通路上關(guān)鍵基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平，分析竹蓀水提物對(duì)正常狀態(tài)下線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)（5-羥色胺信號(hào)通路）、（核激素受體信號(hào)通路）、、（胰島素信號(hào)通路）、、（mdt-15/sbp-1信號(hào)通路）、、（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β信號(hào)通路）以及-9脂肪酸去飽和酶基因//、脂肪酸β-氧化基因等12 個(gè)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)量的影響。由圖11可看出，竹蓀水提物對(duì)5 條脂質(zhì)代謝通路均有顯著調(diào)控作用，竹蓀水提物低、中、高劑量組能夠誘導(dǎo)、基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)（＜0.05、＜0.01），對(duì)、、和基因有顯著上調(diào)作用（＜0.05、＜0.01）；對(duì)、、、的下調(diào)和對(duì)的上調(diào)作用只在中、高劑量組中表現(xiàn)明顯，低劑量組無(wú)顯著干預(yù)效果（＞0.05）。

圖11 竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)代謝通路關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 11 Effect of water extract from D. indusiate on the relative expression levels of key genes involved in the lipid metabolism pathway of C. elegans

3 討 論

本研究采用熱水浸提法制備竹蓀水提物，對(duì)其主要成分、多糖中單糖組成及分子質(zhì)量進(jìn)行分析，然后以DPPH自由基、羥自由基和ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力為指標(biāo)，評(píng)價(jià)了竹蓀水提物的抗氧化活性，隨后以線(xiàn)蟲(chóng)為模型，測(cè)定了不同劑量竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)氧化應(yīng)激和熱應(yīng)激耐受能力的影響，采用油紅O染色法測(cè)定線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂肪沉積情況并分析了甘油三酯濃度，評(píng)價(jià)其對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)脂質(zhì)水平的影響，最后通過(guò)測(cè)定脂質(zhì)代謝相關(guān)通路關(guān)鍵基因的相對(duì)表達(dá)水平，初步探討了竹蓀水提物在改善線(xiàn)蟲(chóng)機(jī)體脂質(zhì)代謝過(guò)程中的分子機(jī)制。

ROS作為機(jī)體基礎(chǔ)代謝的常見(jiàn)產(chǎn)物，當(dāng)其長(zhǎng)期出現(xiàn)不正常積累時(shí)，過(guò)多的ROS會(huì)氧化蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和核酸等細(xì)胞成分，使機(jī)體出現(xiàn)活動(dòng)能力下降等多種病理狀況。大量研究發(fā)現(xiàn)，線(xiàn)蟲(chóng)壽命與機(jī)體的抗氧化能力具有較大的關(guān)聯(lián)性，活性物質(zhì)可能通過(guò)發(fā)揮抗氧化功效達(dá)到延長(zhǎng)線(xiàn)蟲(chóng)壽命的作用。因此結(jié)合體外抗氧化結(jié)果分析，竹蓀水提物對(duì)修復(fù)線(xiàn)蟲(chóng)氧化應(yīng)激損傷有明顯的效果，究其原因可能與竹蓀水提物的抗氧化活性有關(guān)。

油紅O染色結(jié)果及甘油三酯濃度變化均表明竹蓀水提物具有明顯的降脂效果，以此為出發(fā)點(diǎn)，采用熒光定量PCR法初步分析其中的分子機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)竹蓀水提物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)5 條降脂通路的關(guān)鍵基因均有調(diào)控作用（圖12），從而進(jìn)一步驗(yàn)證了竹蓀水提物的降脂功效。5-羥色胺（又名血清素）是調(diào)節(jié)機(jī)體能量消耗和外周組織中脂質(zhì)代謝基因mRNA表達(dá)的神經(jīng)遞質(zhì)，主要通過(guò)腸-腦軸影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)，控制機(jī)體的食欲，達(dá)到減肥降脂的目的。該通路下的mod-1受體能夠通過(guò)影響脂肪酸β-氧化關(guān)鍵酶的限速基因調(diào)節(jié)機(jī)體的脂質(zhì)代謝平衡。線(xiàn)蟲(chóng)的基因是單不飽和脂肪酸合成通路mdt-15/sbp-1的重要組成，主要通過(guò)協(xié)調(diào)其他脂肪酸代謝基因的表達(dá)維持脂肪酸穩(wěn)態(tài)；其下游基因是哺乳動(dòng)物調(diào)控脂質(zhì)合成基因的同源基因，二者與維持機(jī)體的營(yíng)養(yǎng)平衡密切相關(guān)，基因受基因的直接調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，二者中任一基因表達(dá)量降低，機(jī)體的脂質(zhì)沉積都會(huì)顯著減少。哺乳動(dòng)物的過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPARs）系列基因是脂肪代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠通過(guò)調(diào)控脂肪消耗、能量獲取及儲(chǔ)存，從而維持脂質(zhì)代謝平衡，而作為的高度同源基因，在調(diào)控脂肪酸平衡上具有重要作用。/6/7是編碼-9脂肪酸去飽和酶的特異性基因，是促使棕櫚酸向棕櫚油酸轉(zhuǎn)化的基因，而/則促使硬脂酸向油酸轉(zhuǎn)化，三者共同維持機(jī)體飽和脂肪酸/單不飽和脂肪酸的比例平衡，也直接影響甘油三酯的合成。

圖12 竹蓀水提物調(diào)節(jié)線(xiàn)蟲(chóng)脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制Fig. 12 Mechanism of regulating lipid metabolism of C. elegans by water extract from D. indusiate

綜合來(lái)看，竹蓀水提物對(duì)FAT家族3 個(gè)基因的調(diào)控包括多條途徑，和基因的上調(diào)可能與和的作用有關(guān)，其中，與其上游基因之間存在負(fù)反饋調(diào)控；而基因的下調(diào)則與和胰島素信號(hào)通路基因有關(guān)，其中基因又與基因存在負(fù)反饋調(diào)控，這一結(jié)果與Du Xiaocui和Chumphoochai等的研究類(lèi)似，其潛在原因可能是，3 個(gè)基因在功能上有所重疊且受到、、等多通路多基因的共同影響，即當(dāng)其中的一個(gè)基因顯著下調(diào)時(shí)，其他基因發(fā)生上調(diào)導(dǎo)致基因功能的代償現(xiàn)象，從而維持機(jī)體脂肪酸比例的平衡；Xu Xiaoying等研究發(fā)現(xiàn)除基因作用的復(fù)雜關(guān)系外，還有另外一種可能，即基因在調(diào)控脂質(zhì)積累的過(guò)程中可能更多的是扮演一種介導(dǎo)的角色，即介導(dǎo)活性物質(zhì)發(fā)揮脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)的作用。此外，基因的表達(dá)被抑制，這與Peng Huimin和吉鑫等的研究結(jié)果一致，可能是其他通路（如核激素受體通路）調(diào)節(jié)脂質(zhì)積累發(fā)生的負(fù)反饋機(jī)制，目的是防止能量的進(jìn)一步消耗；另一方面有研究發(fā)現(xiàn)敲除基因可降低表達(dá)水平，因此也可能是基因下調(diào)的結(jié)果。胰島素信號(hào)通路和TGF信號(hào)通路是兩條平行的通路，可以平行調(diào)控線(xiàn)蟲(chóng)的脂代謝，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)竹蓀水提物能夠提高的表達(dá)，影響胰島素基因的表達(dá)，抑制下游的核轉(zhuǎn)位，從而減少脂肪積累；而在TGF信號(hào)通路中，和雖然都出現(xiàn)了下調(diào)，但只在高劑量組具有差異顯著性（＜0.05），說(shuō)明可能是竹蓀水提物在該通路上發(fā)揮作用的主要因子。結(jié)合之前的結(jié)果來(lái)看，盡管竹蓀水提物減少線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的脂質(zhì)積累作用具有劑量-效應(yīng)關(guān)系，但對(duì)某些基因（如和）表達(dá)的影響并不明顯，這可能與竹蓀水提物調(diào)控脂質(zhì)代謝的復(fù)雜分子機(jī)制有關(guān)，其具體的作用方式和精準(zhǔn)的作用靶點(diǎn)后續(xù)還需要利用RNA干擾技術(shù)，對(duì)幾條通路上的個(gè)別或者部分基因進(jìn)行敲除，使該基因沉默，檢測(cè)這些基因在脂質(zhì)累積的具體作用，從而更全面地研究和分析竹蓀水提物改善脂質(zhì)代謝的功效機(jī)制。

綜上，竹蓀水提物對(duì)提高線(xiàn)蟲(chóng)抗氧化和熱應(yīng)激能力有較好的效果，還能通過(guò)脂肪酸β氧化、脂肪酸合成與分解、胰島素信號(hào)等通路調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平，有效減少線(xiàn)蟲(chóng)體內(nèi)的脂質(zhì)沉積和甘油三酯濃度，發(fā)揮降脂功效。