無硝干腌火腿中紅色素形成機(jī)制研究進(jìn)展

楊子江，張麗紅，廖國(guó)周，田 梅，呂東霖，何 穎，王桂瑛,*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省畜產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650201）

干腌火腿是以豬后腿為原料，以食鹽為主要腌制劑，經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間腌制發(fā)酵而成的肉制品。根據(jù)產(chǎn)地氣候條件和文化傳統(tǒng)不同，其加工工藝略有差異，主要包括原料選擇、腿胚修整、腌制、洗曬整形、發(fā)酵、成熟等。干腌火腿不僅具有良好的感官特性，而且含有許多生物活性物質(zhì)。作為傳統(tǒng)腌臘肉制品中的典型代表，肉色鮮紅似火是其最重要的感官特性之一，在加工和銷售過程中，如何保持干腌火腿良好的色澤狀態(tài)一直是研究熱點(diǎn)。干腌火腿的色澤與其獨(dú)特的加工方式密切相關(guān)，且受原料豬品種、加工時(shí)間、光照、添加劑、微生物等因素的影響。

為了賦予干腌火腿典型的鮮紅色，常常將硝鹽（硝酸鹽或亞硝酸鹽）用于干腌火腿加工，這樣不僅能穩(wěn)定火腿色澤，還能增強(qiáng)火腿風(fēng)味。一般情況下，亞硝酸鹽的添加量最低需要在50～75 mg/kg之間才能獲得腌肉制品特有的色澤和風(fēng)味特征。Armenteros等將NaCl、KNO（150 mg/kg）、NaNO（100 mg/kg）共同混合添加到干腌火腿中，在腌制發(fā)酵過程中，部分亞硝酸鹽被還原為NO，參與干腌火腿紅色素的形成，促進(jìn)發(fā)色，在腌制270 d后，亞硝酸鹽的殘留量為2.22 mg/kg；另外一項(xiàng)研究報(bào)道，在干腌火腿中添加150 mg/kg KNO或添加150 mg/kg KNO與150 mg/kg NaNO的混合物進(jìn)行腌制，12 個(gè)月后干腌火腿中亞硝酸鹽殘留量超過13 mg/kg。這可能是加工處理方式不同造成的。此外，Iacumin等研究報(bào)道，由于原料肉存在內(nèi)源形成的硝鹽，因此在無硝San Daniele火腿中也檢測(cè)到亞硝酸鹽殘留，約為1 mg/kg，但遠(yuǎn)低于外源添加硝鹽形成的亞硝酸鹽殘留量。由于亞硝酸鹽在一定條件下會(huì)轉(zhuǎn)變成亞硝胺，具有致癌性，且較高的亞硝酸鹽殘留量易導(dǎo)致產(chǎn)品中形成更多的亞硝胺，因此在國(guó)外一些著名火腿中都是禁止添加的，如西班牙的伊比利亞火腿和塞拉諾火腿、意大利的帕爾瑪火腿等，但這些無硝干腌火腿仍表現(xiàn)出誘人的鮮紅色。相關(guān)研究證實(shí)，這些無硝干腌火腿中紅色的主要貢獻(xiàn)者為Zn-原卟啉IX（Zn protoporphyrin IX，ZnPP）。ZnPP的發(fā)現(xiàn)為替代亞硝酸鹽的發(fā)色作用提供了更好的思路，然而其形成途徑尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。本文對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外關(guān)于干腌火腿紅色素形成機(jī)制的研究進(jìn)行綜述，旨在闡明無硝干腌火腿中紅色素的形成機(jī)制，為干腌火腿加工過程的色澤調(diào)控提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 添加硝鹽干腌火腿的發(fā)色研究

干腌肉制品的固有色澤與其本身的可銷售性及消費(fèi)者的接受性有很大的關(guān)聯(lián)。干腌火腿經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間腌制發(fā)酵而成，其外表鮮紅，在腌制過程中除了添加食鹽外，也添加硝鹽。在國(guó)內(nèi)外，亞硝酸鹽常被用作肉制品加工過程中的發(fā)色劑，其可以促進(jìn)肉制品形成誘人的紅色。干腌肉制品的色澤由水分、脂肪含量等多種因素共同決定，但占主導(dǎo)的因素是肌紅蛋白（myoglobin，Mb）和血紅蛋白（hemoglobin，Hb），特別是Mb的化學(xué)形式和含量。相關(guān)研究表明在添加硝鹽肉制品中形成的穩(wěn)定紅色色澤主要化學(xué)成分為亞硝基肌紅蛋白（nitroso myoglobin，NO-Mb）。

1.1 NO-Mb的形成機(jī)制

Mb作為肉制品的主要呈色物質(zhì)，由1 個(gè)血紅素輔基和含1 條多肽鏈的珠蛋白共同構(gòu)成，起呈色作用的主要是血紅素輔基。Mb中的血紅素輔基由一個(gè)亞鐵離子（Fe）和一個(gè)扁平的卟啉環(huán)組成，F(xiàn)e位于卟啉環(huán)中心，其有6 個(gè)配位鍵，其中4 個(gè)與卟啉環(huán)中的N原子結(jié)合，另外兩個(gè)垂直于卟啉環(huán)平面與其他分子（CO、NO等）結(jié)合，從而表現(xiàn)出不同的色澤。當(dāng)中心Fe的第6個(gè)配位鍵與CO結(jié)合時(shí)，形成羧基肌紅蛋白（CO-Mb），肉色呈現(xiàn)亮紅色；而與NO結(jié)合時(shí)，形成亞硝基肌紅蛋白（NO-Mb），肉色呈現(xiàn)粉紅色。研究表明，NO-Mb的形成存在一個(gè)過程反應(yīng)，亞硝酸鹽作為干腌肉制品中NO的主要來源，其在酸性條件下被還原物質(zhì)還原轉(zhuǎn)化為NO，NO與Mb中血紅素輔基第6個(gè)配位鍵結(jié)合并被氧化成亞硝基高鐵肌紅蛋白（nitroso ferrimyoglobin，NO-MetMb），NO-MetMb在腌制期間又被還原為最穩(wěn)定的NO-Mb，從而呈現(xiàn)粉紅色。血紅素輔基卟啉環(huán)中的鐵離子價(jià)態(tài)會(huì)影響亞硝酸鹽與Mb的相互作用，當(dāng)鐵離子為三價(jià)時(shí)，亞硝酸鹽主要與Mb上的氨基酸發(fā)生作用，而當(dāng)鐵離子為二價(jià)時(shí)，亞硝酸鹽與鐵離子配位，形成NO-Mb。亞硝酸鹽、酸性環(huán)境和還原性物質(zhì)是干腌肉制品中NO-Mb形成的幾個(gè)重要條件。Ning Cheng等認(rèn)為亞硝酸鹽是形成NO-Mb所必需的，其在干腌香腸中添加酸性氨基酸（-半胱氨酸）與亞硝酸鹽進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)添加亞硝酸鹽相比，香腸的紅色色澤得到了顯著提高（NO-Mb含量顯著增加），表明酸性環(huán)境對(duì)于亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為NO具有促進(jìn)作用。G?tterup等研究表明，硝酸鹽或亞硝酸鹽是發(fā)酵香腸中形成紅色色素所必需的物質(zhì)，此外，抗壞血酸和其他還原性物質(zhì)可以促進(jìn)這種紅色素的形成。Posthuma等的研究表明，在添加亞硝酸鹽的腌制肉模型系統(tǒng)中，與不添加還原性化合物的處理組相比，添加還原性化合物的處理組顯示出更高的紅度（*），并且*值與亞硝基血紅素含量呈正相關(guān)。Choi等也發(fā)現(xiàn)，使用抗壞血酸和亞硝酸鈉聯(lián)合處理的乳化香腸的*值高于單獨(dú)使用亞硝酸鈉處理的乳化香腸。

1.2 部分替代硝鹽的發(fā)色劑研究

硝鹽除了良好的發(fā)色性能外，也會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生不利影響：一方面，亞硝酸鹽在一定條件下與仲胺反應(yīng)生成亞硝胺，容易致畸、致癌、致突變；另一方面，由于亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的氧化性，它可以氧化Hb中的Fe，導(dǎo)致人體出現(xiàn)呼吸困難和缺氧等癥狀。因此，目前許多研究都集中于尋找硝鹽的替代物，但由于硝鹽在干腌肉制品中的應(yīng)用范圍廣，并且對(duì)于干腌肉制品紅色形成具有顯著的促進(jìn)作用，想要將其全部替換并不容易。硝鹽的替代物包括天然來源物質(zhì)和人工合成物質(zhì)兩類。曾友明等研究發(fā)現(xiàn)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的復(fù)合護(hù)色劑（由茶多酚、抗壞血酸、檸檬酸、復(fù)合磷酸鹽復(fù)配而成）可以使低溫貯藏待售的肉制品在20 d時(shí)顏色仍然可以接受，在一個(gè)月后仍保留一定的紅色，并且可以減少亞硝酸鈉添加量。?oji?等將天然食品添加劑香菜精油添加到香腸中，結(jié)果表明，0.12 μL/g香菜精油與60 mg/kg的亞硝酸鈉聯(lián)合使用可以顯著提高熟豬肉香腸的*值，增強(qiáng)抗氧化活性，減少亞硝酸鹽的使用量并且有益于熟豬肉香腸的品質(zhì)保護(hù)。Ning Cheng等將-賴氨酸、-精氨酸、-半胱氨酸聯(lián)合亞硝酸鈉添加到香腸中，發(fā)現(xiàn)三者均能改善香腸的紅色，促進(jìn)NO-Mb的形成并增強(qiáng)其穩(wěn)定性，同時(shí)減少了亞硝酸鈉的殘留量。亞硝基血紅蛋白（NO-Hb）是利用血液中血紅素制備的一種安全發(fā)色劑，其可以應(yīng)用到肉制品中改善肉制品的色澤和營(yíng)養(yǎng)特性等。Liu Pengxue等將從豬血細(xì)胞中制備的糖化亞硝基血紅蛋白（glycosylated nitrosohemoglobin，G-NO-Hb）作為亞硝酸鈉的替代品添加到哈爾濱天然干發(fā)酵香腸中，G-NO-Hb添加量為2 g/kg時(shí)，紅色色澤與添加亞硝酸鹽組（0.1 g/kg）相比沒有差異，而G-NO-Hb添加量為4 g/kg時(shí)，其紅色色澤顯著高于添加亞硝酸鹽組（0.1 g/kg）。楊慧娟等將0.06%（以肉制品質(zhì)量計(jì)，后同）G-NO-Hb結(jié)合0.1%甜菜粉添加到豬肉糜中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其*值高于添加100 mg/kg亞硝酸鹽組，表明G-NO-Hb可以作為替代亞硝酸鹽發(fā)色的一種策略。ZnPP作為無硝干腌肉制品中紅色素的主要貢獻(xiàn)者，它的發(fā)現(xiàn)也為替代亞硝酸鹽發(fā)色提供了更好的研究思路。Asaduzzaman等通過微生物的篩選，成功得到3 株具有高ZnPP生產(chǎn)能力的食用菌種：乳酸乳球菌（）、腸系膜明串珠菌（）、屎腸球菌（），然后分別將其接種到無菌豬肉糜上，與添加硝鹽的樣品對(duì)比，最終的發(fā)色效果相當(dāng)，并且色澤具有一定的熱穩(wěn)定性，證明這3 種細(xì)菌可以作為有效的亞硝酸鹽替代物進(jìn)行發(fā)色。Adamsen等通過構(gòu)建肉制品模型體系研究了硝鹽與ZnPP形成的關(guān)系，結(jié)果表明在腌制劑中添加硝鹽會(huì)明顯抑制ZnPP的形成。即使較低的硝鹽添加量（＜1 mmol/L）對(duì)ZnPP具有較強(qiáng)的抑制作用。

2 未添加硝鹽干腌火腿的發(fā)色研究

未添加硝鹽的腌制肉或熟肉通常會(huì)變成暗棕色（如生腌制品）或灰色（如加熱處理的熟肉），消費(fèi)者對(duì)于這兩種色澤的肉制品接受度不高，而且這樣的肉制品容易發(fā)生腐敗。干腌帕爾瑪火腿在腌制過程中沒有添加硝鹽，但是仍然表現(xiàn)出穩(wěn)定的桃紅色。無硝干腌帕爾瑪火腿呈現(xiàn)穩(wěn)定桃紅色是由于其形成了一種新的卟啉化合物。Wakamatsu等通過提取純化帕爾瑪火腿中的紅色色素，結(jié)合熒光光譜、高效液相色譜、質(zhì)譜等分析方法證實(shí)了無硝帕爾瑪火腿中的紅色色澤是由ZnPP提供的。通過進(jìn)一步研究，在伊比利亞火腿色素提取物質(zhì)譜圖上也觀察到同樣的ZnPP特征峰，由此可以推斷，不添加硝鹽干腌肉制品的色澤主要貢獻(xiàn)者為ZnPP。鋅在動(dòng)物骨骼中的含量要高于鐵，且鋅是僅次于銅最容易插入卟啉的一種金屬，此外不需要催化劑，因此這一結(jié)論具有一定的可靠性。

2.1 干腌火腿中ZnPP的形成機(jī)制

ZnPP的形成機(jī)制還尚未完全闡明，目前一般有以下3 種推論。

2.1.1 ZnPP的形成是非酶促反應(yīng)的結(jié)果

ZnPP的形成是一種涉及Zn和Fe之間相互交換的非酶促金屬反應(yīng)。Becker等通過研究發(fā)現(xiàn)，鉛作為一種亞鐵螯合酶（ferrochelatase，F(xiàn)ECH）抑制劑，低濃度下能夠抑制ZnPP的形成，而在高濃度下能夠促進(jìn)ZnPP的形成，從而證明ZnPP的形成是一種非酶促金屬反應(yīng)的結(jié)果，Mb中的Fe被Zn所替代；Zn作為FECH的底物抑制劑，向肉勻漿中添加10 μmol/L鋅-乙酸鹽時(shí)，與對(duì)照組相比ZnPP在591 nm波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度顯著上升，說明在沒有酶存在的情況下也能形成ZnPP。電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）技術(shù)可以對(duì)物質(zhì)原子或分子中所含的不配對(duì)電子進(jìn)行定性和定量，并探索其周圍環(huán)境的結(jié)構(gòu)特性。Grossi等使用EPR波譜檢測(cè)帕爾瑪火腿中鐵離子的化學(xué)環(huán)境變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，一部分無機(jī)鐵離子游離出來，在其他條件作用下被氧化成Fe，在氨基酸等螯合劑存在的情況下被螯合沉淀，這個(gè)過程可能是一個(gè)非酶促金屬交換過程，對(duì)于Zn取代Fe形成ZnPP具有非常大的貢獻(xiàn)作用。Giovanni等為了探究溫度對(duì)無硝干腌火腿紅色素形成的影響，在16 ℃和4 ℃下腌制火腿，并分別在6、9、12 個(gè)月時(shí)取樣進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干腌火腿在16 ℃和4 ℃下都成功形成了紅色素（ZnPP），但是4 ℃組ZnPP的形成速率要低于16 ℃組，且在低溫下ZnPP的形成沒有表現(xiàn)出酶活性依賴機(jī)制，這也表明ZnPP的形成可能是一種非酶促反應(yīng)。

2.1.2 ZnPP的形成是酶促反應(yīng)的結(jié)果

在ZnPP形成的過程中FECH起到主要作用。對(duì)無硝干腌火腿中除鐵酶純化的研究結(jié)果證明了該除鐵酶為FECH，還原性輔酶I-細(xì)胞色素b還原酶將血紅素中的Fe還原為Fe，從而重組FECH才能除去Fe，使Zn插入到卟啉中形成ZnPP。FECH是一種與線粒體內(nèi)膜相關(guān)的蛋白質(zhì)，是血液生物合成途徑的末端酶，可以催化Fe插入原卟啉IX（protoporphyrin IX，PPIX）形成血紅素。FECH在所有的原核生物和真核生物中幾乎都存在，而且參與各種二價(jià)金屬離子（Fe、Zn、Co、Mn）進(jìn)入卟啉環(huán)。研究發(fā)現(xiàn)從牛肝臟分離得到的FECH Zn螯合活性高于Fe；此外，Zn是繼Cu之后第二容易插入卟啉環(huán)的金屬離子，且不需要催化劑就能很容易插入卟啉環(huán)。通過FECH的催化作用，有助于Fe從卟啉環(huán)中脫除而Zn插入到PPIX中，形成ZnPP。相關(guān)研究表明，Zn插入PPIX的反應(yīng)催化常數(shù)約為去除Fe反應(yīng)的11 倍，說明FECH催化Zn插入反應(yīng)的作用較Fe去除反應(yīng)作用強(qiáng)；并且pH值是影響FECH活性的一個(gè)重要因素，pH值在5.5～6.0的條件下有利于FECH從卟啉中去除Fe，而pH值在中性或偏堿性條件下（pH 7.5～8.0）更有利于Zn插入到PPIX中形成ZnPP。PPIX作為ZnPP形成的一種關(guān)鍵物質(zhì)，其來源途徑尚不清楚，目前研究人員普遍認(rèn)同兩個(gè)途徑：一是FECH催化的血紅素除鐵反應(yīng)；另一是血紅素生物合成途徑。Becker等在研究中發(fā)現(xiàn)ZnPP的形成與溫度有關(guān)，在室溫（26.5 ℃）下ZnPP的含量最高，隨著溫度的升高，ZnPP含量呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，高溫可能影響FECH的活性從而影響ZnPP的形成；-甲基卟啉（-methyl porphyrin，-MeMP）已經(jīng)被證明是FECH的抑制劑，通過向肉勻漿中加入少量的-MeMP，能夠抑制ZnPP的形成。Abril等認(rèn)為ZnPP是由FECH催化生成的，其通過超聲處理從豬肝中提取FECH，結(jié)果表明，超聲處理可以增強(qiáng)FECH的活性從而進(jìn)一步促進(jìn)ZnPP的形成。Chau等將FECH與Mb在還原劑（抗壞血酸和半胱氨酸）的作用下進(jìn)行孵育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FECH可以有效地將Mb中的血紅素轉(zhuǎn)化為ZnPP，該學(xué)者繼續(xù)以肉為底物，通過添加外源重組酵母FECH，發(fā)現(xiàn)重組酵母FECH可以促進(jìn)Mb中的血紅素轉(zhuǎn)化為ZnPP。

2.1.3 ZnPP的形成是細(xì)菌性酶促反應(yīng)的結(jié)果

腸桿菌（）已被證明能夠以代謝物的形式形成ZnPP。相關(guān)研究表明，某些細(xì)菌內(nèi)的FECH能夠?qū)⒀t素轉(zhuǎn)化為ZnPP。Wandersman等報(bào)道，熒光假單胞菌（）能夠通過血球與血紅素結(jié)合，使細(xì)胞外的血紅素運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中，血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）通常將血紅素轉(zhuǎn)化為游離鐵、膽綠素和CO。Khozroughi等在原料肌肉和肌肉的水提取物中接種熒光假單胞菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，肌肉中ZnPP的含量和對(duì)照組并沒有顯著差異，而肌肉的水提物中ZnPP含量與對(duì)照組相比呈現(xiàn)顯著增加的趨勢(shì)，這是由于細(xì)菌誘導(dǎo)ZnPP的形成可能依賴于微生物營(yíng)養(yǎng)底物（食物基質(zhì)中的多肽和蛋白質(zhì)）的可利用性，在肉的水提取物中，肉中內(nèi)源肽和蛋白質(zhì)可以被立即使用，因此導(dǎo)致ZnPP含量顯著增加。Asaduzzaman等選取在不同畜產(chǎn)品中廣泛運(yùn)用的11 株細(xì)菌和從環(huán)境與益生菌中分離的126 株細(xì)菌進(jìn)行高ZnPP生產(chǎn)菌篩選實(shí)驗(yàn)，最終分離出3 株具有高ZnPP生產(chǎn)能力的食用型細(xì)菌，然后將其接種到無菌肉糜中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種細(xì)菌組有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度，而未接種組熒光強(qiáng)度很微弱甚至沒有，表明ZnPP的形成機(jī)制與細(xì)菌存在很大的關(guān)聯(lián)。Wakamatsu等通過細(xì)菌的分離純化，在未添加抗生素的豬肉勻漿中成功分離得到兩株具有高ZnPP生產(chǎn)能力的細(xì)菌，分別為分歧型卡諾桿菌（）和液化沙雷氏菌（），雖然液化沙雷氏菌并不是可食用型細(xì)菌，但也證實(shí)了微生物對(duì)于ZnPP生成具有重要貢獻(xiàn)。Kauser-Ul-Alam等從市場(chǎng)中收集了包括帕爾瑪火腿、發(fā)酵香腸、干腌魚翅、香蕉、奶茶等在內(nèi)的55 份樣品用于篩選具有改善肉制品色澤能力的食品級(jí)乳酸菌，結(jié)果共篩選得到450 株乳酸菌，其中有25株乳酸菌具有ZnPP形成能力，對(duì)這25 株菌在不同環(huán)境條件下的生長(zhǎng)情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)所有的菌株在30 ℃下有最大生長(zhǎng)速率，其中絕大部分在好氧或厭氧條件下也能很好地生長(zhǎng)；將其接種到無菌肉勻漿模型中，與對(duì)照組相比表現(xiàn)出較高的ZnPP形成能力，其中有13 株乳酸菌在加鹽的無菌肉勻漿模型中也表現(xiàn)出較好的ZnPP形成能力。

2.2 干腌火腿中ZnPP形成的影響因素

ZnPP的形成涉及到一個(gè)較為復(fù)雜的過程，受多種因素的影響。在火腿腌制過程中，各理化參數(shù)的變化對(duì)ZnPP的形成也有著一定的影響。通過對(duì)商業(yè)帕爾瑪火腿中ZnPP和血紅素含量與各理化指標(biāo)之間相關(guān)性的研究，發(fā)現(xiàn)ZnPP和血紅素與多個(gè)理化指標(biāo)之間存在相關(guān)性，包括大理石花紋、水分含量、pH值、蛋白水解指數(shù)、鹽分含量等。

2.2.1 pH值

pH值的變化對(duì)于干腌火腿中ZnPP的形成存在較大的影響。Bou等以宰后24 h的豬后腿半膜肌pH值（pH）為參數(shù)，選取不同pH的豬后腿進(jìn)行火腿腌制，并通過縮短腌制時(shí)間來研究pH和腌制時(shí)間二者對(duì)于ZnPP含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在pH較高（≥5.9）的火腿中血紅素含量增加，而ZnPP含量和蛋白水解指數(shù)下降；較低的pH（≤5.4）導(dǎo)致游離脂肪酸中總多不飽和脂肪酸含量升高，同時(shí)ZnPP含量也呈上升趨勢(shì)，pH與游離脂肪酸和ZnPP含量呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，然而血紅素和ZnPP含量的變化對(duì)最終產(chǎn)品的顏色沒有顯著影響。Wakamatsu等使用抗生素處理樣品，研究不同種類的酸和微生物對(duì)ZnPP形成的影響，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)在添加抗生素組中ZnPP的形成主要取決于酸的種類，在pH 4.50～4.75時(shí)檢測(cè)到ZnPP含量的最大值；而在未添加抗生素組中，當(dāng)pH＞4.75時(shí)ZnPP的形成顯著增加，含量最高時(shí)pH值為5.5，這可能是由于污染微生物造成的影響。而Maere等對(duì)干腌發(fā)酵香腸中紅色素研究的結(jié)果則不同，在豬肉組、豬肉、馬肉混合組香腸中，pH值越高，*值（紅度）也越高，并且在高pH值條件下，ZnPP的含量明顯較高，但*值與ZnPP含量之間并沒有顯著相關(guān)性。Wakamatsu等通過研究還發(fā)現(xiàn)，ZnPP形成的最適pH值與豬肌原纖維的類型顯著相關(guān)，如肱二頭肌和棘上肌ZnPP形成的最適pH值為4.75、半膜肌和背闊肌的最適pH值為5.5、股二頭肌和半腱肌的最適pH值分別為4.75和5.5。pH值對(duì)于ZnPP含量的影響可能涉及蛋白質(zhì)水解和脂質(zhì)分解等多個(gè)復(fù)雜的變化，其機(jī)制尚未完全闡明，需要繼續(xù)進(jìn)行研究。

2.2.2 鹽分

ZnPP的含量與鹽分含量存在一定相關(guān)性。Bou等的研究表明ZnPP的含量與鹽分含量呈正相關(guān)。Adamsen等通過建立肉制品模型研究NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)ZnPP形成的影響，結(jié)果表明當(dāng)腌制肉中添加的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于9%時(shí)，ZnPP的含量隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；但在腌制肉中添加亞硝酸鹽則顯著抑制了ZnPP的生成，Cl輔助Fe從Mb中解離可能是肉制品中ZnPP形成速率的決定因素。然而，有研究表明腌制時(shí)間的縮短導(dǎo)致最終火腿中的鹽分含量降低，而ZnPP和血紅素的含量并沒有受到影響。Chau等的研究也得到類似的結(jié)論，在樣品中分別添加0、100、500 mmol/L的NaCl對(duì)FECH活性和ZnPP產(chǎn)量并沒有產(chǎn)生任何影響。造成研究結(jié)果差異的原因可能是實(shí)驗(yàn)環(huán)境或酶源的不同，也有可能是NaCl含量改變不足以影響微生物、酶等的生長(zhǎng)環(huán)境。

2.2.3 蛋白質(zhì)

有研究報(bào)道ZnPP/血紅素與蛋白水解指數(shù)呈正相關(guān)。在腌制過程中，火腿中的水分會(huì)滲出，相反，鹽分則向肌肉的內(nèi)部擴(kuò)散，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白會(huì)發(fā)生強(qiáng)烈的水解，形成小肽和游離氨基酸。蛋白質(zhì)的水解也會(huì)造成體系pH值的增加。Paganelli等報(bào)道，胃蛋白酶通過對(duì)Mb的有限水解，打開了與枯草芽孢桿菌重組FECH相關(guān)的金屬交換反應(yīng)通道，促進(jìn)Zn與Fe的交換，從而顯著提高了ZnPP的形成速率。Grossi等使用熒光光譜法對(duì)帕爾瑪火腿成熟過程中ZnPP的形成機(jī)制進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在成熟過程中，隨著低分子質(zhì)量肽的形成，含ZnPP的血紅素濃度增加，并通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳發(fā)現(xiàn)Mb的降解與ZnPP的熒光強(qiáng)度增加呈正相關(guān)。也有相關(guān)研究報(bào)道ZnPP不僅只存在于Mb中，從其他蛋白質(zhì)中也能夠觀察到ZnPP的存在，并且有游離于Mb之外的ZnPP，因此有可能其他蛋白質(zhì)也會(huì)影響ZnPP的形成。Wang等發(fā)現(xiàn)，雖然ZnPP不溶于水，但在帕爾瑪火腿的水提物中觀察到有ZnPP存在，帕爾瑪火腿水提物中的ZnPP主要與Hb和Mb以絡(luò)合物的形式（ZnPP-Hb、ZnPP-Mb）存在，并且這些絡(luò)合物的形成不依賴于蛋白質(zhì)的水解。Khozroughi等使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)豬腰最長(zhǎng)肌提取物中含Mb的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0～72 h的孵育過程中ZnPP熒光強(qiáng)度持續(xù)增加，而蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析結(jié)果沒有發(fā)生明顯變化；同時(shí)，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)Mb進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)，在0～72 h的孵育過程中Mb的濃度沒有顯著變化，二者均表明Mb沒有發(fā)生進(jìn)一步降解，因此ZnPP的形成可能與Mb的降解沒有直接關(guān)系。

2.2.4 脂質(zhì)

脂肪含量和脂肪分解程度對(duì)ZnPP的形成也存在一定程度的影響。肌內(nèi)脂肪含量（大理石花紋）對(duì)提高血紅素轉(zhuǎn)化為ZnPP的比率至關(guān)重要。Bou等的研究表明部分游離脂肪酸（如亞油酸、硬脂酸和花生四烯酸）含量與ZnPP含量呈正相關(guān)。Chau等研究發(fā)現(xiàn)，多種脂質(zhì)（包括脂肪酸和磷脂）會(huì)使FECH的活性增加，當(dāng)棕櫚酸鈉的質(zhì)量濃度增加到100 mg/mL時(shí)，正向（Zn螯合）與反向（Fe去除）反應(yīng)速率分別提高2.5 倍和2.0 倍，硬脂酸和油酸等也表現(xiàn)出與棕櫚酸鈉相似的效果，當(dāng)磷脂酰膽堿質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，正向反應(yīng)速率提高，而反向反應(yīng)速率降低，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

2.3 干腌火腿中ZnPP形成的潛在調(diào)控方法

2.3.1 酶法調(diào)控

研究表明，F(xiàn)ECH在ZnPP的形成過程中起到至關(guān)重要的作用。在體內(nèi)，F(xiàn)e已經(jīng)被證明是FECH的優(yōu)先作用底物，F(xiàn)ECH不可逆地催化金屬離子進(jìn)入卟啉環(huán)，但通過體外研究也發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ECH可以催化血紅素中Fe的去除生成PPIX，隨后將Zn插入PPIX形成ZnPP。Parolari等通過研究發(fā)現(xiàn)，在干腌火腿的整個(gè)加工過程中，F(xiàn)ECH都保持一個(gè)高活性狀態(tài)。FECH在低溫下（4 ℃）沒有表現(xiàn)出高催化活性，而在適宜的溫度下（如16、26.5 ℃）表現(xiàn)出較高的ZnPP催化活性。國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的干腌火腿，如宣威火腿、諾鄧火腿和三川火腿，其發(fā)酵成熟期的平均溫度均在15～25 ℃，這一溫度下有利于FECH催化ZnPP的形成。在國(guó)外，歐洲生產(chǎn)的干腌火腿發(fā)酵成熟溫度在16～25 ℃之間，與國(guó)內(nèi)相似，而美國(guó)生產(chǎn)的干腌火腿其發(fā)酵成熟溫度通常高于28 ℃，溫度過高可能會(huì)抑制FECH的活性，降低ZnPP的形成速率。Chau等報(bào)道pH 5.5～6.0條件下利于FECH從卟啉中去除Fe，而將Zn插入到PPIX中形成ZnPP則是在中性或偏堿性（7.5～8.0）條件下更有利。干腌火腿的pH值因火腿品種和產(chǎn)地的不同而有所差異，如國(guó)內(nèi)的宣威火腿（pH 5.82～6.57）、宣恩火腿（pH 5.99～6.22）和盤縣火腿（pH 5.74～5.94）等。因此可以通過調(diào)控干腌火腿腌制發(fā)酵過程中的FECH活性，進(jìn)而促進(jìn)ZnPP的形成。

2.3.2 微生物調(diào)控

微生物是形成干腌火腿特征風(fēng)味和顏色的主要貢獻(xiàn)者，干腌火腿中的主要微生物一般包括細(xì)菌、霉菌和酵母菌，這些微生物可能來源于豬肉本身、食鹽和加工環(huán)境等，也包括工人自身攜帶的微生物，根據(jù)干腌火腿的種類和特定的生產(chǎn)工藝條件，其微生物的相對(duì)豐度存在很大差異。部分細(xì)菌可以顯著改善無硝干腌肉制品的紅色色澤，促進(jìn)ZnPP的形成。在先前的研究中，已經(jīng)成功分離鑒定出一些具有高ZnPP形成能力的細(xì)菌，如腸桿菌、熒光假單胞菌、乳酸乳球菌、腸系膜明串珠菌、屎腸球菌、分歧型卡諾桿菌、液化沙雷氏菌、植物乳桿菌（）、乳酸乳球菌亞種（subsp.）、乳酸明串珠菌（），這些細(xì)菌中的絕大部分都是可食用型細(xì)菌，對(duì)人體沒有危害，對(duì)調(diào)控?zé)o硝干腌火腿中ZnPP的形成具有潛在應(yīng)用價(jià)值。植物乳桿菌不僅具有良好的ZnPP形成能力，且母雨等將植物乳桿菌作為發(fā)酵劑接種到火腿中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果還發(fā)現(xiàn)其對(duì)火腿的風(fēng)味具有顯著的改善作用。Morita等報(bào)道從帕爾瑪火腿中分離出來的一些葡萄球菌（），如表皮葡萄球菌（）、沃氏葡萄球菌（）和慢葡萄球菌（），會(huì)產(chǎn)生一種紅色色素，其主要成分為ZnPP。研究人員對(duì)意大利和西班牙火腿發(fā)酵過程中細(xì)菌種類變化研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵初始階段，腸桿菌是意大利和西班牙火腿的表面優(yōu)勢(shì)微生物，而在發(fā)酵過程中，微球菌（）和葡萄球菌的數(shù)量急劇增加。微生物是干腌火腿品質(zhì)形成的關(guān)鍵影響因素，利用微生物來調(diào)控?zé)o硝干腌火腿中ZnPP的形成促進(jìn)其發(fā)色具有重要的研究意義。

3 結(jié) 語

傳統(tǒng)干腌火腿的加工通常通過添加硝鹽來促進(jìn)發(fā)色，已有研究證實(shí)添加硝鹽所形成的紅色色澤主要貢獻(xiàn)者為NO-Mb，且NO-Mb的形成機(jī)制已被基本闡明。目前國(guó)外關(guān)于干腌火腿紅色素的研究主要集中于無硝干腌火腿中的ZnPP，但其形成機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，ZnPP的形成涉及一系列復(fù)雜過程，與許多因素有關(guān)。干腌火腿腌制需要經(jīng)歷一個(gè)長(zhǎng)期的過程，在這個(gè)過程中干腌火腿的理化成分會(huì)發(fā)生變化，如蛋白質(zhì)水解和脂肪分解，這與ZnPP的形成存在很大的關(guān)聯(lián)，其中起主要作用的可能是蛋白質(zhì)和脂肪分解后所形成的小分子化合物。此外，干腌火腿中的微生物比較復(fù)雜，在加工過程中會(huì)發(fā)生微生物群落的更新和演替，分析鑒定干腌火腿加工過程中對(duì)ZnPP形成有貢獻(xiàn)的優(yōu)勢(shì)微生物很有意義。干腌火腿的腌制過程是一個(gè)復(fù)雜體系，采用多組學(xué)聯(lián)用方法（如代謝組學(xué)與微生物組學(xué)聯(lián)用）來闡述ZnPP的形成機(jī)制很有必要，未來的研究應(yīng)更多集中于這一方面，從而深入闡述ZnPP的形成機(jī)制，為干腌火腿加工過程中的色澤調(diào)控提供科學(xué)理論依據(jù)。