蝦青素DHA單酯對(duì)脂多糖誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用

伍露露，王曉旭，羅京義，李藝洋，王志高，徐 杰，薛長(zhǎng)湖

（中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

炎癥反應(yīng)是人類免疫系統(tǒng)的重要生理反應(yīng)過(guò)程，可保護(hù)身體免受刺激并恢復(fù)受損的組織結(jié)構(gòu)和功能。然而，過(guò)度和不受控制的炎癥反應(yīng)會(huì)誘發(fā)各種慢性病和機(jī)體紊亂，包括糖尿病、癌癥、心血管疾病、關(guān)節(jié)炎、自身免疫性疾病和炎癥性腸病等。近年來(lái)，炎癥是生物醫(yī)學(xué)研究人員關(guān)注的主要研究領(lǐng)域之一。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁中特有的成分，適量的LPS能夠激發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng)，濃度過(guò)高則會(huì)引起強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)，促使炎性因子大量分泌，使其成為多種炎癥模型構(gòu)建的首選誘導(dǎo)劑。蝦青素（3,3’-二羥基-,’胡蘿卜素-4,4’-二酮基）是類胡蘿卜素中唯一一種能夠穿透血-腦屏障和血-視網(wǎng)膜屏障的活性物質(zhì)。研究表明，蝦青素具有抗炎、抗癌、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力和降低氧化損傷等生理功能。自然界中的蝦青素以游離態(tài)、單酯或雙酯的混合形式存在。二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）是-3多不飽和脂肪酸，對(duì)胎兒大腦及視力的發(fā)育和成人神經(jīng)系統(tǒng)的正常運(yùn)作十分重要。游離DHA可以通過(guò)結(jié)合并激活質(zhì)膜受體和胞質(zhì)受體來(lái)調(diào)節(jié)炎癥。本課題組前期采用體外和體內(nèi)消化模型研究了14 種不同分子結(jié)構(gòu)蝦青素酯的穩(wěn)定性和生物利用度，結(jié)果表明具有長(zhǎng)鏈和飽和脂肪酸的蝦青素酯比其他類型的蝦青素酯更穩(wěn)定，蝦青素單酯的生物利用度高于游離蝦青素（free astaxanthin，F(xiàn)-Asta），蝦青素DHA單酯（astaxanthin DHA monomer，AST-DHA）在14 種蝦青素酯中具有最高的生物利用度，這種新型活性物質(zhì)可能在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮蝦青素和DHA的協(xié)同作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2細(xì)胞）被證明是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，響應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的病理刺激。近年來(lái)，斑馬魚(yú)疾病模型廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，如免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、神經(jīng)科學(xué)等。斑馬魚(yú)因其生命周期短、繁殖率高、易于飼養(yǎng)，且胚胎的光學(xué)透明性可以對(duì)體內(nèi)炎癥進(jìn)行無(wú)創(chuàng)動(dòng)態(tài)成像，被公認(rèn)是有效的體內(nèi)抗炎實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀１緦?shí)驗(yàn)主要利用以上兩種模型探究AST-DHA抗炎活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BV2細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院上海生化與細(xì)胞研究所；合成蝦青素（純度10%） 浙江巴仕曼生物科技有限公司；DHA（純度80%） 中國(guó)海洋大學(xué)食品科學(xué)與人類健康實(shí)驗(yàn)室制備；野生型斑馬魚(yú)（AB品系）國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心；LPS、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichloro-dihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）、3-乙氧?；桨芳谆撬猁}（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate，MS222） 上海阿拉丁生化科技公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測(cè)定試劑盒 南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒 美國(guó)Bio Tek公司；EvaGreen qPCR Master Mix試劑盒 加拿大ABM公司；胎牛血清-培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；Griess試劑 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

斑馬魚(yú)養(yǎng)殖設(shè)備 上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HF90/HF240 CO培養(yǎng)箱 上海力新儀器有限公司；LRH-70恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒儀器有限公司；PZMIII體視顯微鏡、PV830斑馬魚(yú)顯微注射系統(tǒng) 美國(guó)WPI公司；Ti2-E熒光顯微鏡 日本Nikon公司；iCycler iQ5系統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增儀、680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 F-Asta和AST-DHA的制備

參考楊魯?shù)确椒ǎ訢HA與蝦青素作為反應(yīng)底物合成AST-DHA，具體反應(yīng)條件為蝦青素250 mg、DHA 282 mg、無(wú)水丙酮5 mL、4-二甲氨基吡啶100 mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽100 mg，充氮后避光并進(jìn)行磁力攪拌，在25 ℃反應(yīng)3 h。合成的產(chǎn)物通過(guò)硅膠柱純化后，用C色譜柱進(jìn)行梯度洗脫，流動(dòng)相為甲醇和甲基叔丁基醚，采用高效液相色譜-質(zhì)譜法對(duì)純化后樣品進(jìn)行分析，鑒定得到純化后F-Asta純度為（96.2±0.5）%，AST-DHA純度為（94.0±0.6）%。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)觀察

BV2細(xì)胞培養(yǎng)于含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青霉素及鏈霉素的10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）胎牛血清-培養(yǎng)基中。細(xì)胞在37 ℃、5% CO下無(wú)菌培養(yǎng)。細(xì)胞以1∶4隔天傳代，以1×10個(gè)/mL孔接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔接種0.5 mL，待細(xì)胞貼壁后，加入含質(zhì)量濃度0、100、200、400 μg/mL LPS的2%胎牛血清-培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h和48 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.3 四甲基偶氮唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞存活率

BV2細(xì)胞以5×10個(gè)/mL接種于96 孔板中，每孔接種100 μL。待細(xì)胞貼壁后，加入含質(zhì)量濃度0、100、200、400 μg/mL LPS的2%胎牛血清-培養(yǎng)基。持續(xù)孵育24 h或48 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加200 μL 3-(4,5-二甲基噻唑)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2--tetrazolium bromide，MTT）溶液（用質(zhì)量濃度0.5 mg/mL、pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液配制），繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸取并丟棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加100 μL酸化異丙醇（HCl濃度為1 mol/L，（鹽酸）∶（異丙醇）＝1∶8），振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。細(xì)胞存活率計(jì)算如公式（1）所示。

1.3.4 Griess法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)NO產(chǎn)生量

采用Griess方法，取1.3.3節(jié)加入不同質(zhì)量濃度LPS孵育24 h或48 h的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液與Griess試劑等體積混合，反應(yīng)5 min后，于550 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以NaNO濃度為橫軸、吸光度為縱軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)NaNO標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)基上清液中NO產(chǎn)生量。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為＝0.072+0.048（＝0.997），線性關(guān)系良好，以NaNO濃度表征NO產(chǎn)生量。

1.3.5 LPS誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞模型及實(shí)驗(yàn)分組

炎癥細(xì)胞模型蝦青素干預(yù)實(shí)驗(yàn)分成4 組：空白對(duì)照組、模型組、F-Asta組和AST-DHA組。用質(zhì)量濃度400 μg/mL LPS處理BV2細(xì)胞48 h構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型；模型組、F-Asta組和AST-DHA組均用LPS處理，同時(shí)F-Asta組和AST-DHA組分別添加終質(zhì)量濃度200 ng/mL的F-Asta和AST-DHA。

1.3.6 斑馬魚(yú)胚胎的獲得及實(shí)驗(yàn)分組

斑馬魚(yú)成魚(yú)養(yǎng)殖于循環(huán)水系統(tǒng)中，溫度控制在（28±1）℃，pH值控制在7.0±0.5，每天明/暗時(shí)間為14 h/10 h。

選擇成年斑馬魚(yú)，雌魚(yú)與雄魚(yú)數(shù)量按照1∶1的比例置于配魚(yú)盒內(nèi)，中間放置隔板，次日清晨抽去隔板，30 min后將魚(yú)卵收集于培養(yǎng)皿中，加入胚胎培養(yǎng)液，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.7 LPS誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)炎癥及實(shí)驗(yàn)分組

炎癥造模：將LPS粉末用斑馬魚(yú)胚胎培養(yǎng)液配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的母液備用，實(shí)驗(yàn)時(shí)將母液用培養(yǎng)液稀釋為質(zhì)量濃度10、15、20 μg/mL的工作液。在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育至2 d（day post fertilization，dpf）自然破膜后，挑選發(fā)育正常的斑馬魚(yú)胚胎移入6 孔板中，每孔30 條，每個(gè)質(zhì)量濃度組設(shè)3 個(gè)重復(fù)孔。模型組中預(yù)先加入5 mL不同質(zhì)量濃度LPS溶液，空白對(duì)照組加入5 mL培養(yǎng)液。將給藥后的6 孔板放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，待其發(fā)育至3 dpf檢測(cè)胚胎體內(nèi)ROS水平。

蝦青素干預(yù)實(shí)驗(yàn)分組：分成4 組，空白對(duì)照組、模型組、F-Asta組和AST-DHA組。空白對(duì)照組在24 孔板中加入2 mL胚胎培養(yǎng)液；模型組、F-Asta組和AST-DHA組加入2 mL質(zhì)量濃度15 μg/mL的LPS溶液。每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)孔，每孔30 條胚胎（2 dpf）。將給藥后的胚胎放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

F-Asta和AST-DHA通過(guò)顯微注射的方式注射入受精后2 h（hour post fertilization，hpf）斑馬魚(yú)胚胎中，分別吸取10 μL質(zhì)量濃度200 ng/mL的F-Asta和AST-DHA溶液于玻璃注射針中，注射液滴大小為2 nL。將2 hpf左右的斑馬魚(yú)胚胎排列擺放至瓊脂板上，在體視顯微鏡下進(jìn)行注射。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組需注射約200 個(gè)胚胎。待胚胎發(fā)育至2 dpf，挑選健康的胚胎進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.8 體視顯微鏡觀察胚胎發(fā)育情況

在各組胚胎發(fā)育至72 hpf時(shí)，體視顯微鏡下觀察胚胎畸形情況，按式（2）計(jì)算畸形率。

1.3.9 免疫熒光分析ROS水平

將3 dpf斑馬魚(yú)胚胎轉(zhuǎn)移至24 孔板中，每孔5 條胚胎，用2 mL熒光探針染料DCFH-DA溶液（質(zhì)量濃度5 μg/mL）處理，在28.5 ℃避光孵育1 h。將胚胎用胚胎培養(yǎng)液沖洗3 次，并在觀察前用體積分?jǐn)?shù)0.016% MS222將斑馬魚(yú)胚胎麻醉。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用Image J圖像處理軟件分析熒光成像圖片并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度，ROS水平以平均熒光強(qiáng)度表示。

1.3.10 MDA含量測(cè)定

待胚胎發(fā)育至4 dpf時(shí)，從每組中取10 個(gè)斑馬魚(yú)胚胎，用磷酸鹽緩沖溶液洗滌3 次，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)定胚胎MDA含量，結(jié)果以蛋白計(jì)，重復(fù)3 個(gè)平行。

1.3.11 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)測(cè)定促炎因子的表達(dá)

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取BV2細(xì)胞和斑馬魚(yú)的總RNA，用超微量分光光度計(jì)測(cè)定不同實(shí)驗(yàn)組RNA濃度；參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA為模板，加入相關(guān)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR），擴(kuò)增各目的基因。擴(kuò)增結(jié)束后，分別以和為內(nèi)參基因，用2相對(duì)定量法計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1所示。

表1 qPCR的基因引物Table 1 Gene-specific primers for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用GraphPad Prism 8.0軟件作圖并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組數(shù)據(jù)之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析采用單因素方差分析，＜0.05被認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AST-DHA對(duì)BV2細(xì)胞炎癥的作用

2.1.1 LPS對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞存活率及NO產(chǎn)生量的影響

用質(zhì)量濃度0、100、200、400 μg/mL的LPS處理BV2細(xì)胞24 h和48 h，觀察BV2細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞活力及NO產(chǎn)生量的變化，由此確定構(gòu)建BV2細(xì)胞炎癥模型的LPS質(zhì)量濃度。由圖1A可知，加入不同質(zhì)量濃度LPS培養(yǎng)48 h，空白對(duì)照組和質(zhì)量濃度100 μg/mL LPS組細(xì)胞形態(tài)正常，多為小的圓形或具有長(zhǎng)的突觸。而LPS質(zhì)量濃度達(dá)到200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞胞體明顯變大，突觸變短。LPS質(zhì)量濃度400 μg/mL時(shí)細(xì)胞狀態(tài)改變更加明顯。由圖1B可知，100 μg/mL以上LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞48 h可以極顯著降低細(xì)胞存活率（＜0.01），與空白對(duì)照組相比，細(xì)胞存活率下降了約50%。而各質(zhì)量濃度LPS誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞存活率均與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異（＞0.05）。NO是炎癥進(jìn)程中的重要信使，與免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)。由圖1C可知，在質(zhì)量濃度100、200、400 μg/mL LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞48 h，其NO產(chǎn)生量與空白對(duì)照組相比極顯著升高（＜0.01）。質(zhì)量濃度100 μg/mL和200 μg/mL LPS處理24 h時(shí)，細(xì)胞NO產(chǎn)生量與空白對(duì)照組相比變化不顯著（＞0.05）。綜合上述結(jié)果，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用質(zhì)量濃度400 μg/mL LPS處理BV2細(xì)胞48 h構(gòu)建炎癥細(xì)胞模型。

圖1 LPS誘導(dǎo)BV2細(xì)胞炎癥模型的建立Fig. 1 Establishment of BV2 cell model of LPS-induced inflammation

2.1.2 AST-DHA對(duì)BV2細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平的影響

細(xì)胞中促炎因子表達(dá)水平的上升會(huì)加速細(xì)胞炎癥的進(jìn)展。常見(jiàn)的促炎因子有TNF-α和IL-1β。由圖2可知，模型組中和表達(dá)水平均高度顯著高于空白對(duì)照組（＜0.000 1、＜0.001），分別約為對(duì)照組的1.5 倍和1.4 倍，而AST-DHA組和mRNA相對(duì)表達(dá)量接近于空白對(duì)照組，說(shuō)明AST-DHA顯著降低了LPS誘導(dǎo)的BV2細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平（＜0.001、＜0.01），F(xiàn)-Asta對(duì)細(xì)胞中的表達(dá)作用效果不顯著（＞0.05）。結(jié)果表明，AST-DHA能夠下調(diào)炎癥細(xì)胞中炎癥因子的表達(dá)水平，對(duì)LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥具有改善作用。

圖2 AST-DHA降低BV2細(xì)胞中炎癥因子mRNA表達(dá)水平Fig. 2 Astaxanthin DHA monoester decreased the mRNA expression of inflammatory factors in BV2 cells

2.2 AST-DHA對(duì)LPS誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)炎癥的保護(hù)作用

2.2.1 LPS誘導(dǎo)斑馬魚(yú)炎癥模型的建立

ROS通常是壽命短活性高的小分子，包括氧衍生的自由基，如超氧陰離子自由基和羥自由基等。體內(nèi)高水平的ROS可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致各種細(xì)胞或組織損傷。將斑馬魚(yú)胚胎暴露在質(zhì)量濃度0、10、15、20 μg/mL的LPS中，染色后，熒光顯微鏡下檢測(cè)ROS水平。圖3結(jié)果顯示，用LPS處理斑馬魚(yú)胚胎后，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到15 μg/mL時(shí)綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，與空白對(duì)照組相比染色效果最明顯，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采取該質(zhì)量濃度LPS處理斑馬魚(yú)胚胎建立炎癥模型。

圖3 不同質(zhì)量濃度LPS誘導(dǎo)的炎癥斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)ROS熒光圖（4×）Fig. 3 Fluorescence images of ROS in zebrafish embryos with inflammation induced by different concentrations of LPS (4 ×)

2.2.2 AST-DHA對(duì)炎癥斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育畸形的調(diào)節(jié)作用

斑馬魚(yú)具有胎身透明的特點(diǎn)，因此其發(fā)育過(guò)程在顯微鏡下清晰可見(jiàn)。在體視顯微鏡下觀察到正常發(fā)育至48 hpf的斑馬魚(yú)胚胎（圖4A）和經(jīng)LPS誘導(dǎo)各組典型的發(fā)育陰滯胚胎（圖4A）。發(fā)育陰滯的情況有卵黃囊水腫、尾部發(fā)育不全、眼部發(fā)育不全和脊索畸形等。如圖4B所示，模型組畸形率是空白對(duì)照組的2 倍多，F(xiàn)-Asta組和AST-DHA組斑馬魚(yú)胚胎畸形率與模型組相比高度顯著下降（＜0.001、＜0.000 1），尤其是AST-DHA組，其畸形率接近于空白對(duì)照組。以上結(jié)果表明，AST-DHA對(duì)炎癥斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育具有保護(hù)作用。

圖4 AST-DHA對(duì)炎癥斑馬魚(yú)胚胎畸形率的影響Fig. 4 Effect of astaxanthin DHA monoester on the rate of embryo malformation in zebrafish with inflammation

2.2.3 AST-DHA對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS水平的影響

如圖5A所示，注射AST-DHA的斑馬魚(yú)熒光強(qiáng)度明顯低于模型組。進(jìn)一步采用Image J軟件分析熒光成像圖像并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度。如圖5B所示，與模型組相比，F(xiàn)-Asta和AST-DHA均能有效抑制炎癥斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS的產(chǎn)生（＜0.001、＜0.000 1）。AST-DHA組斑馬魚(yú)的ROS水平較F-Asta組極顯著降低（＜0.01），其ROS水平接近于空白對(duì)照組。以上結(jié)果表明AST-DHA較F-Asta具有更好的降低炎癥斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS產(chǎn)生量的效果。

圖5 AST-DHA對(duì)炎癥斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)ROS水平的影響Fig. 5 Effect of astaxanthin DHA monoester on ROS levels in zebrafish embryos with inflammation

2.2.4 AST-DHA對(duì)斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)MDA含量的影響

體內(nèi)MDA水平常用來(lái)反映過(guò)氧化程度，反映機(jī)體清除氧自由基的能力。由圖6可知，模型組與空白對(duì)照組相比，斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)MDA含量高度顯著上升（＜0.000 1），約為對(duì)照組的2.5 倍。與模型組相比，AST-DHA和F-Asta均能高度顯著減少炎癥斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)MDA含量（＜0.000 1），且AST-DHA組MDA含量的下降較F-Asta組更明顯（＜0.01）。結(jié)果表明，LPS的暴露會(huì)導(dǎo)致斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)過(guò)氧化物MDA含量增加，AST-DHA可以緩解這種應(yīng)激狀態(tài)。

圖6 AST-DHA對(duì)炎癥斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)MDA含量的影響Fig. 6 Effect of astaxanthin DHA monoester on MDA content in zebrafish embryos with inflammation

2.2.5 AST-DHA對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)炎癥因子的調(diào)節(jié)作用

由圖7可知，LPS處理后斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)促炎因子和水平較空白對(duì)照組極顯著升高（＜0.01）。F-Asta對(duì)mRNA表達(dá)水平無(wú)顯著作用（＞0.05），但能顯著降低mRNA表達(dá)（＜0.05）；AST-DHA能顯著降低和的表達(dá)水平（＜0.01、＜0.05）。結(jié)果表明，蝦青素對(duì)LPS誘導(dǎo)的斑馬魚(yú)胚胎炎癥反應(yīng)有改善作用，并且AST-DHA較F-Asta下調(diào)炎癥因子的效果更好。

圖7 AST-DHA對(duì)炎癥斑馬魚(yú)胚胎體內(nèi)炎癥因子表達(dá)水平的影響Fig. 7 Effect of astaxanthin DHA monoester on the expression of inflammatory factors in zebrafish embryos with inflammation

3 討 論

蝦青素是一種具有抗氧化特性的類胡蘿卜素，可作為食品補(bǔ)充劑使用，它是一種親脂化合物，生物利用度低，與其他類胡蘿卜素類似。F-Asta和蝦青素酯均具有很強(qiáng)的生物學(xué)活性。Rao等發(fā)現(xiàn)，相比于F-Asta，蝦青素酯的抗癌活性更強(qiáng)，認(rèn)為蝦青素酯在生物體內(nèi)具有更優(yōu)的生物利用度。Kamath等對(duì)蝦青素單/雙酯、F-Asta的單線態(tài)氧猝滅能力進(jìn)行了比較，表明相對(duì)于其他實(shí)驗(yàn)組蝦青素酯具有更好猝滅能力。本課題組前期考察了脂質(zhì)基質(zhì)效應(yīng)對(duì)蝦青素酯生物利用度的影響，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈脂肪酸含量的增加有利于蝦青素酯生物利用度的提高，在此基礎(chǔ)上合成了AST-DHA并優(yōu)化了反應(yīng)條件。

斑馬魚(yú)具有與人類相似的形態(tài)和生理功能，被廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)研究。目前研究表明，斑馬魚(yú)的免疫系統(tǒng)與人類有著很高的相似度，幾乎所有的人類免疫系統(tǒng)細(xì)胞在斑馬魚(yú)中均存在。本實(shí)驗(yàn)中利用斑馬魚(yú)胚胎身體透明的特點(diǎn)，觀察斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程并通過(guò)活體染色來(lái)監(jiān)測(cè)體內(nèi)ROS水平變化。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生ROS以破壞入侵的細(xì)菌和病毒顆粒，因此ROS可被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)強(qiáng)度的指標(biāo)。體內(nèi)產(chǎn)生過(guò)量的ROS可能導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷。抑制ROS過(guò)度產(chǎn)生可以有效陰止炎癥反應(yīng)的進(jìn)展，這種抑制可以被視為潛在的抗炎藥物開(kāi)發(fā)目標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明LPS可引起斑馬魚(yú)的炎癥反應(yīng)并促進(jìn)ROS生成，而F-Asta和AST-DHA可減少斑馬魚(yú)體內(nèi)ROS產(chǎn)生量，表現(xiàn)出良好的抗炎活性，AST-DHA降低ROS水平的效果更優(yōu)于F-Asta。

炎癥反應(yīng)是體內(nèi)常見(jiàn)的生物反應(yīng)過(guò)程，可促進(jìn)激活巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β等促炎癥因子。TNF-α是體內(nèi)重要的早期炎癥反應(yīng)生物標(biāo)志物，可提高對(duì)中性粒細(xì)胞的吞噬作用，促進(jìn)IL-1β等促炎因子的產(chǎn)生，刺激局部炎癥反應(yīng)。過(guò)量的TNF-α可誘導(dǎo)生成線粒體ROS，導(dǎo)致分枝桿菌和受感染的巨噬細(xì)胞程序性壞死。IL-1β是一種強(qiáng)效促炎性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)合成前列腺素，活化免疫細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖。研究表明，體外和體內(nèi)毒物會(huì)增加斑馬魚(yú)體內(nèi)TNF-α和IL-1β的表達(dá)水平。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞和斑馬魚(yú)模型中AST-DHA組的炎癥應(yīng)激反應(yīng)較模型組顯著降低，效果優(yōu)于F-Asta組。

4 結(jié) 論

本研究利用不同質(zhì)量濃度LPS處理BV2細(xì)胞和斑馬魚(yú)，通過(guò)對(duì)體內(nèi)外模型生化指標(biāo)的檢測(cè)、染色結(jié)果的觀察以及qPCR檢測(cè)，確定了AST-DHA對(duì)LPS誘導(dǎo)的炎癥的保護(hù)作用，且AST-DHA較F-Asta表現(xiàn)出更好的抗炎活性，這可能得益于蝦青素與DHA的協(xié)同作用，為AST-DHA生物活性的研究和相關(guān)功能性食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。