紅腹海參消化道指標(biāo)、組織學(xué)和酶活性的季節(jié)變化

譚春明 ，趙 旺 , ，馬振華 , ，于 剛

1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心，海南 三亞 572018

2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300

3. 三亞熱帶水產(chǎn)研究院，海南 三亞 572018

熱帶海參具有豐富的物種多樣性，是中國經(jīng)濟海參養(yǎng)殖開發(fā)的物種資源庫。迄今全球被開發(fā)利用的50多種食用經(jīng)濟海參中21種在中國海域有分布記錄，除溫帶種仿刺參(Apostichopus japonicus) 和海地瓜 (Acaudina molpadioides) 外，中國的食用經(jīng)濟海參種類多分布于南海，且主要分布于雷州半島以南海域，西南中沙海域是中國食用經(jīng)濟海參種類的集中分布區(qū)[1]。熱帶食用經(jīng)濟海參種類主要屬于刺參科和海參科，包括5個屬：刺參屬 (Stichopus)、梅花參屬 (Thelenota)、海參屬 (Holothuria)、輻肛參屬 (Actinopyga) 和白尼參屬 (Bohadschia)[2]。

海參沒有復(fù)雜的消化系統(tǒng)，也無獨立的消化腺，其消化道僅由口、咽、食道、胃、腸和排泄腔組成[3]。刺參 (S. japonicus) 的消化道管壁結(jié)構(gòu)主要由黏膜層、黏膜下層、肌層和外膜組成。其中，消化道黏膜層為單層或假復(fù)層上皮 (包含柱狀細胞、黏液細胞和立方細胞)；黏膜下層為疏松的結(jié)締組織；肌層由外環(huán)和內(nèi)縱兩部分組成；而扁平細胞及其下方薄層結(jié)締組織組成了外膜[4-6]。研究表明，多種海參具有夏眠現(xiàn)象，在此期間，其消化道的形態(tài)學(xué)和腸道功能發(fā)生顯著變化，進而影響其自身生理指標(biāo)的變化[6]。溫度是誘導(dǎo)海參進入休眠狀態(tài)的主要因素。通過對熱帶海參不同季節(jié)消化道指標(biāo)和組織學(xué)特征的研究，可以初步判斷熱帶海參是否具有冬眠現(xiàn)象。另外，海參的養(yǎng)殖池塘通常建在沿岸淺水區(qū)域，圍堰塘的面積較小、水體交換量有限，當(dāng)天氣發(fā)生劇烈變化時，養(yǎng)殖水體的環(huán)境條件 (如溫度、鹽度等) 會發(fā)生較大變化，嚴重抑制海參的生長，可能出現(xiàn)排臟反應(yīng)或化皮現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致海參大面積死亡[7-8]。通過調(diào)控養(yǎng)殖環(huán)境 (如溫度) 可以減少或消除海參因強烈應(yīng)激所帶來的不利影響，縮短休眠周期[9]。有研究指出，海參在休眠狀態(tài)下，除形態(tài)學(xué)發(fā)生變化外，其體內(nèi)消化和免疫相關(guān)酶活性也會發(fā)生顯著變化，如淀粉酶、脂肪酶、纖維素酶、超氧化物歧化酶 (SOD) 和過氧化氫酶(CAT) 等，進而對消化道功能產(chǎn)生影響[10-11]。

中國的紅腹海參 (H. edulis) 主要分布在海南島和東、中、西、南沙群島，棲息于岸礁沙底，為沉積食性海參，以珊瑚沙為食，偏好生境存在季節(jié)變化[12]。紅腹海參的生境也受水深的影響，如9月在水深6～10 m水域種群密度較大(2.65 頭·m-2)，相比水深3～6 m水域顯著增加[13]。斯里蘭卡海域的紅腹海參主要分布在10 m以淺水域，在水深12～15 m處減少，超過25 m又顯著增加[14]。紅腹海參在珊瑚礁中具有擾動底質(zhì)生物、加速營養(yǎng)鹽再生和保護、清潔珊瑚礁以及為其他生物提供棲息場所等作用[12]。然而，過度捕撈已導(dǎo)致熱帶海參的數(shù)量急劇下降，人工養(yǎng)殖迫在眉睫。為了揭示熱帶海參消化道應(yīng)對不同季節(jié)的響應(yīng)特性，本文探究了紅腹海參的攝食和生理狀況隨時間的變化，通過監(jiān)測不同季節(jié)海參的消化道指標(biāo) (活動、飲食、濕質(zhì)量和消化道內(nèi)容物)、消化道組織學(xué)特征和相關(guān)酶活性的變化，為研究其環(huán)境適應(yīng)調(diào)節(jié)機制及人工增養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究所用紅腹海參于2019年7月采捕自三亞西島，采捕時水溫為25 ℃。采捕后暫養(yǎng)于海南省陵水縣新村熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心。紅腹海參養(yǎng)殖過程中水質(zhì)參數(shù)：鹽度33±0.8，溶解氧質(zhì)量濃度大于 6.5 mg·L-1，pH 8.0±0.2，亞硝酸鹽質(zhì)量濃度小于 0.03 mg·L-1，氨氮質(zhì)量濃度小于 0.01 mg·L-1。暫養(yǎng)期間每天按時定量投喂由鼠尾藻粉、馬尾藻粉、海泥、細沙和海參配合餌料按等比例配制而成的人工配合飼料，定期換水并及時清理糞便及殘餌，定時檢查水溫和海參的生長狀況。測定各種酶活性所用的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

分別在春 (3月)、夏 (6月)、秋 (9月)、冬 (12月) 4個季節(jié)對紅腹海參的消化道組織進行取樣。

1.2.1 消化道指標(biāo)

定期稱取海參的濕質(zhì)量 (用毛巾吸干體表水分后稱質(zhì)量)、檢測消化道形態(tài)學(xué)變化 (消化道長度、消化道和內(nèi)含物質(zhì)量)，并根據(jù)公式 (1) 計算消化道相對濕質(zhì)量。平均濕質(zhì)量、消化道相對濕質(zhì)量和消化道與體長比均是當(dāng)季度所取海參的平均值 (N≥30)。

式中：R為消化道相對濕質(zhì)量；M1為去內(nèi)容物的消化道質(zhì)量；M2為消化道濕質(zhì)量。

1.2.2 組織學(xué)分析

對消化道組織取樣進行切片，HE染色觀察：依次將切片放入二甲苯 (C8H10)Ⅰ 20 min、C8H10Ⅱ20 min、無水乙醇Ⅰ 10 min、無水乙醇Ⅱ 10 min，再用95%、90%、80%、70%乙醇清洗5 min，最后蒸餾水洗；將切片入Harris蘇木素 (C16H14O6)染3～8 min，自來水沖洗，1%的鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗；切片入伊紅 (C20H6Br4Na2O5) 染液中染色1～3 min后，將切片依次放入95% 乙醇Ⅰ、95% 乙醇 Ⅱ、無水乙醇Ⅰ和無水乙醇Ⅱ 5 min，而后放入C8H10Ⅰ和C8H10Ⅱ中各5 min脫水透明，將切片拿出來稍晾干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.2.3 酶活性測定

取紅腹海參腸道組織，用0.2 mol·L-1生理鹽水將樣品按質(zhì)量體積為1∶3的比例進行研磨，研磨液于 4 ℃、5 000 r·min-1離心 10 min，取上清液1 mL 于潔凈EP管中，置于—80 ℃冰箱待測。利用相應(yīng)試劑盒測定淀粉酶、胃蛋白酶、纖維素酶、溶菌酶、CAT、堿性磷酸酶(ALP)、總超氧化物歧化酶 (T-SOD) 和過氧化物酶 (POX) 活性，各組均設(shè)3個平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，通過單因素方差分析 (One-way ANOVA) 判斷處理組之間是否具有顯著差異，均值間的差異顯著性 (P＜0.05) 采用Duncan's法進行比較。

2 結(jié)果

2.1 紅腹海參濕質(zhì)量與消化道等質(zhì)量的季節(jié)變化

紅腹海參在春、夏、秋季 (3、6和9月) 的濕質(zhì)量均有所上升，冬季 (12月) 可能因水溫影響了攝食而呈現(xiàn)輕微下降的趨勢 (圖1-a)。從濕質(zhì)量看，其生長極其緩慢；紅腹海參消化道相對濕質(zhì)量在夏、秋季分別為0.62和0.29，而在冬季上升至0.73 (圖1-b)。說明夏、秋季紅腹海參攝食比較旺盛，未出現(xiàn)像刺參一樣的夏季休眠現(xiàn)象；不同季節(jié)紅腹海參消化道與體長比呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(圖1-c)，說明不同季節(jié)溫度下熱帶海參腸道會發(fā)生變化，但未出現(xiàn)嚴重萎縮等退化現(xiàn)象。

圖1 不同季節(jié)熱帶紅腹海參消化道指標(biāo)變化Fig. 1 Change of digestive tract indexes of H. edulis in different seasons

2.2 不同季節(jié)紅腹海參的消化道組織學(xué)特征

紅腹海參消化道前腸橫切組織HE染色切片顯示了不同季節(jié)下海參腸壁的形態(tài)學(xué)變化過程 (圖2)。腸壁結(jié)構(gòu)中的柱狀上皮 (Columnar epithelium,CE)、橫行皺襞 (Circular fold, CF)、紋狀緣 (Striated border, SB)、漿膜層 (Serosa, SE)、黏膜上皮層(Mucosa, MU)、肌層 (Muscular layer, ML)、體腔上皮層 (Coelomic lining, CL) 和凋亡空腔 (Apoptosis antrum, AA) 等結(jié)構(gòu)清晰可見。不同季節(jié)實驗組紅腹海參消化道組織結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，春季實驗組消化道腸壁結(jié)構(gòu)的橫行皺襞中出現(xiàn)部分凋亡空腔(圖2-a)；而夏季空腔減少 (圖2-b)；秋季時，凋亡空腔增加、橫行皺襞厚度和柱狀上皮密集程度也較夏季減弱 (圖2-c)；而到冬季時，橫行皺襞中出現(xiàn)較多凋亡空腔 (圖2-d)，腸壁細胞出現(xiàn)嚴重凋亡，柱狀上皮和漿膜層變薄。

圖2 紅腹海參消化道在不同季節(jié)下前腸橫切組織HE染色切片光學(xué)顯微照片注：a、b、c、d 分別為實驗組 3、6、9、12 月取樣，-1 和-2 分別為組織縱切面和橫切面。Fig. 2 Micrographs of HE-stained sections of transected tissues of foregut of digestive tract of H. edulis in different seasonsNote: The a, b, c and d represent the samples in March, June, September and December, respectively.The -1 and -2 represent the ongitudinal and transverse sections of the tissue, respectively.

2.3 不同季節(jié)紅腹海參消化道組織消化酶活性變化

紅腹海參消化道溶菌酶活性在6月最高，全年呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢 (圖3-a)。消化道胃蛋白酶和纖維素酶均在3月表現(xiàn)出最高活性，分別為15.55和12.64 U·mg-1，分別在9和12月降至最低 (圖3-b、圖3-d)，這可能與3月海參攝食逐漸恢復(fù)有關(guān)。而淀粉酶卻在9月表現(xiàn)出最高活性，這可能由海參的攝食狀態(tài)發(fā)生改變所致。

圖3 不同季節(jié)紅腹海參腸道組織消化酶活性變化Fig. 3 Change of digestive enzyme activity in intestinal tissues of H. edulis in different seasons

2.4 不同季節(jié)紅腹海參消化道組織免疫酶活性變化

紅腹海參消化道CAT活性由春季至冬季呈下降的變化趨勢 (圖4-a)；而ALP活性卻呈現(xiàn)波動性上升趨勢 (圖4-b)。另外，T-SOD (圖4-c) 和POX(圖4-d) 活性呈現(xiàn)一致的變化趨勢，均在6月活性最高，但T-SOD活性在春季 (3月) 最低，而POX活性卻在冬季 (12月) 最低。

圖4 不同季節(jié)熱帶紅腹海參腸道組織免疫酶活性變化Fig. 4 Change of immune enzyme activity in intestinal tissues of H. edulis in different seasons

3 討論

海參為適應(yīng)不同季節(jié)水溫和食物的變化會做出相應(yīng)的生理生化反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)，紅腹海參在春、夏、秋三季濕質(zhì)量均有所上升，而冬季可能因水溫降低影響了攝食而略有下降。紅腹海參消化道相對濕質(zhì)量在夏、秋季有所下降，冬季再次上升，這可能是春、冬季溫度較低影響了攝食，導(dǎo)致消化道內(nèi)容物較少。消化道相對濕質(zhì)量的變化進一步印證了冬季低溫會影響海參的攝食和狀態(tài)。陳世波[9]研究指出，刺參在夏季休眠狀態(tài)下體質(zhì)量顯著下降。而本研究中夏季紅腹海參攝食比較旺盛，并未像刺參一樣出現(xiàn)夏眠現(xiàn)象?？梢娂t腹海參不存在夏眠，可能存在冬眠現(xiàn)象，但目前并無研究佐證。為了進一步探明熱帶海參的休眠期，本研究對紅腹海參消化道前腸形態(tài)學(xué)變化過程進行觀察，發(fā)現(xiàn)夏季凋亡空腔最少，而冬季海參消化道腸壁結(jié)構(gòu)的橫行皺襞中出現(xiàn)較多凋亡空腔，腸壁細胞出現(xiàn)嚴重的凋亡，柱狀上皮和漿膜層變薄。這種變化特征與刺參夏眠時候極其相似，因此初步判斷熱海紅腹海參可能存在冬眠現(xiàn)象。

研究表明，外部環(huán)境的改變會影響水生動物的生長狀態(tài)和機體酶活變化，進而影響其攝食、生長和健康[15-17]。因此，海參在休眠狀態(tài)下，除了形態(tài)學(xué)發(fā)生變化外，其體內(nèi)消化和免疫相關(guān)的酶活性也會發(fā)生顯著變化，如淀粉酶、纖維素酶、SOD和CAT等[10-11]。水生動物在缺少食物時，主要通過改變機體各種酶的活性來調(diào)節(jié)代謝水平、能量分配和能源物質(zhì)消耗，以適應(yīng)食物缺乏造成的脅迫，維持機體生理活動[18-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，紅腹海參消化道組織在6月具有較高的溶菌酶活性，全年呈現(xiàn)“先升后降”的變化趨勢，進一步說明紅腹海參在夏季生長依然良好，其消化道組織通過分泌大量溶菌酶來消化攝食過程中所帶入的微生物等致病因子。楊寧等[22]研究顯示，當(dāng)水溫較高時，環(huán)境中的致病因子相對活力上升，促使海參機體溶菌酶活性上升以保證其生長良好。這也解釋了紅腹海參在夏季具有較高溶菌酶活性的原因。然而，消化道組織中的胃蛋白酶和纖維素酶均在3月表現(xiàn)出最高活性，這可能是由于3月海參從冬季的休眠萎縮逐漸恢復(fù)攝食所致。研究指出，消化酶活性與機體的攝食量和所處的狀態(tài)有關(guān)[23-24]。任慶印[25]在研究海參夏眠過程中的生理代謝調(diào)控時發(fā)現(xiàn)，溫度變化對蛋白酶活性影響顯著，并在基因的調(diào)控下與溫度呈一定的正相關(guān)。春季水溫逐漸上升，紅腹海參的生理活動逐漸恢復(fù)并受到外界食物刺激，但此時的食物仍無法滿足其生長需求，從而刺激機體胃蛋白酶和纖維素酶活性顯著上升[10]。饑餓脅迫可促進腸道胃蛋白酶的分泌及其活性[26]。然而，夏季食物充足，其機體的應(yīng)激反應(yīng)下降，導(dǎo)致胃蛋白酶和纖維素酶活性有所降低。這可能是因為機體盡可能將代謝保持在一定水平，以保證在重新獲取食物或面臨其他環(huán)境脅迫時能承受相應(yīng)的應(yīng)激反應(yīng)[27]。消化道中淀粉酶活性發(fā)生了與機體生長相適應(yīng)的變化，前3個月緩慢上升，冬季時受環(huán)境溫度影響而呈下降趨勢。Bao等[28]指出，在休眠狀態(tài)下，海參主要通過消耗體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪來獲取代謝底物或能量。Chen等[29]對休眠狀態(tài)下的刺參進行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，同樣表明蛋白質(zhì)和磷脂可能是低代謝期間的主要能量來源。而且在休眠狀態(tài)下，海參腸道組織的糖酵解發(fā)生抑制，進而影響其生長和代謝[30]。紅腹海參濕質(zhì)量的下降和消化酶活性的降低均表明其在冬季處于休眠狀態(tài)。

另外，本研究還測定了不同時期紅腹海參消化道組織免疫酶活性的變化。其中，CAT可以將機體產(chǎn)生的過氧化氫 (H2O2) 分解成無毒、無害的水(H2O) 和氧氣 (O2)[31]。紅腹海參消化道組織中的CAT活性變化規(guī)律表明，春季 (3月) 細胞內(nèi)CAT的底物H2O2濃度顯著增加，進而刺激CAT活性被誘導(dǎo)。而夏季 (6月) CAT活性顯著降低，可能與SOD濃度有關(guān)。有研究指出，饑餓脅迫下機體CAT活性隨著時間的延長而逐漸降低，這可能是機體超氧陰離子自由基在SOD的作用下被還原為H2O2的含量下降，致使相應(yīng)CAT活性降低[32]。這與本研究中夏季高SOD活性的結(jié)果相吻合。ALP是機體對新陳代謝進行調(diào)節(jié)以保護自身的另一重要調(diào)節(jié)酶，通過寡糖磷脂酰肌醇錨定在細胞膜上的結(jié)合蛋白，使生物體可以直接參與磷酸基團的轉(zhuǎn)移和代謝，且參與體內(nèi)的鈣 (Ca)、磷 (P) 代謝[17,33]。本研究中，ALP呈現(xiàn)波動上升趨勢，表明代謝較旺盛或較弱均會導(dǎo)致機體ALP活性上升，以調(diào)節(jié)機體代謝的平衡。另外，POX和T-SOD活性表現(xiàn)出一致的變化規(guī)律，均在6月最高。而POX以H2O2為電子受體，直接催化酚類或胺類化合物氧化的酶。隨著水溫的上升，機體的耗氧率也增加，進而促使活性氧類物質(zhì)的生成，導(dǎo)致抗氧化酶活性的上升[22,34]。腸道內(nèi)POX活性在冬季最低，可能是機體抗氧化體系不能及時清除自由基，使其氧化與抗氧化平衡被破壞所致[35]。

中國東南沿海是經(jīng)濟海參養(yǎng)殖開發(fā)的物種資源庫。中國熱帶海參資源開發(fā)利用的當(dāng)務(wù)之急是大力開展熱帶刺參等高值種類的資源恢復(fù)，發(fā)展玉足海參 (H. leucospilota) 和紅腹海參等中低值海參的人工增養(yǎng)殖，發(fā)展熱帶海參人工增養(yǎng)殖新產(chǎn)業(yè)。然而，紅腹海參的養(yǎng)殖、培育卻受到各種環(huán)境因子影響，闡明其應(yīng)對不同環(huán)境因子的響應(yīng)及調(diào)控機制具有重要意義。本研究中紅腹海參應(yīng)對不同季節(jié)的生理生化反應(yīng)有所不同，夏季其生長、攝食較為旺盛，而冬季出現(xiàn)冬眠跡象，體質(zhì)量下降、消化道萎縮、細胞凋亡，相應(yīng)的消化酶和免疫酶活性在冬季均處在低值，這種性狀與刺參的夏眠特性相一致。因此，判斷熱帶紅腹海參具有冬眠現(xiàn)象，但是其對季節(jié)的適應(yīng)機制和休眠機理仍需要進一步研究。