HPLC法同時(shí)測(cè)定雙葛止瀉口服液中綠原酸和葛根素的含量

周 冰，李煥娟，陳帥韜，安卓睿，程嬋嬋，姚路路，張 聰

(國(guó)家獸用藥品工程技術(shù)研究中心/洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，河南洛陽(yáng) 471000)

雙葛止瀉口服液是由金銀花、葛根、黃芩、黃連等6味中藥采用提取、純化等工藝制成的復(fù)方口服液體制劑，并獲得國(guó)家三類(lèi)新獸藥證書(shū)(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第186號(hào))[1]。該產(chǎn)品具有清熱燥濕，解毒止瀉的功能，臨床上主要用于仔豬濕熱泄瀉，證見(jiàn)黃色糊狀或稀粥樣糞便、或挾有粘液，鼻盤(pán)微干等。方中金銀花清熱解毒，散熱疏風(fēng)[2]，同時(shí)具有較強(qiáng)抗菌活性[3]，葛根解肌退熱，升陽(yáng)止瀉，二者共為君藥，綠原酸和葛根素則分別為兩者的特征性有效成分[4-6]?，F(xiàn)有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]中綠原酸和葛根素分別采用單獨(dú)的液相條件進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。為進(jìn)一步提升檢驗(yàn)效率，并減少有機(jī)試劑的用量，本文建立了同時(shí)測(cè)定雙葛止瀉口服液中綠原酸和葛根素含量的方法，并對(duì)該方法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于雙葛止瀉口服液的質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 U3000型高效液相色譜儀，配VWD-3400RS型紫外檢測(cè)器，Thermo公司；XSR205型電子分析天平，瑞士梅特勒托利多公司。

1.1.2 試藥與試劑 綠原酸對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-202018，含量：96.1%)、葛根素對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110752-201816，含量：95.4%)、雙葛止瀉口服液(洛陽(yáng)惠中獸藥有限公司，批號(hào)：20200905，20201002，20210301)；乙腈，Thermo Fisher Scientific公司，HPLC級(jí)；磷酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，HPLC級(jí)；水為實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：Waters XBridge C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；梯度洗脫，流動(dòng)相：乙腈-0.4%磷酸溶液(0～14 min，乙腈11%；14～15 min，乙腈由11%上升到70%；15～20 min，乙腈70%；20～21 min，乙腈由70%下降到11%；21～25 min，乙腈11%)，流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：315 nm；進(jìn)樣量：10 μL。理論板數(shù)按綠原酸峰計(jì)算應(yīng)不低于10000；按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不低于10000。

1.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取綠原酸、葛根素對(duì)照品適量，加30%乙醇制成每1 mL約含綠原酸40 μg、葛根素120 μg的溶液，即得。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取本品2 mL，置50 mL量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方制備缺金銀花的陰性樣品和缺葛根的陰性樣品，分別按照“1.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液，即得。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 專(zhuān)屬性試驗(yàn) 分別取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，考察主峰位置是否有干擾。

1.3.2 線性試驗(yàn) 精密稱(chēng)取綠原酸對(duì)照品10.72 mg，置25 ml量瓶中，作為綠原酸線性貯備液；精密稱(chēng)取葛根素對(duì)照品30.09 mg，置50 ml量瓶中，作為葛根素線性貯備液。分別精密量取上述貯備液按照一定比例稀釋成一系列梯度濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，綠原酸濃度分別為0.008242 mg/mL、0.02060 mg/mL、0.04121 mg/mL、0.08242 mg/mL、0.1030 mg/mL，葛根素濃度分別為0.02296 mg/mL、0.05741 mg/mL、0.1148 mg/mL、0.2296 mg/mL、0.2871 mg/mL。依次吸取上述線性溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度為(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 精密度試驗(yàn) 取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。

1.3.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取本品2 mL(批號(hào)：20200905)，按照“1.2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，取對(duì)照品溶液和供試品溶液分別于第0、2、4、8、12小時(shí)進(jìn)樣，測(cè)定峰面積并計(jì)算RSD。

1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：20200905)，按照“1.2.3”項(xiàng)下制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算含量及RSD。

1.3.6 中間精密度 取同一批樣品(批號(hào)：20200905)，由兩名人員在不同日期、使用不同的高效液相色譜儀，依法測(cè)定，每人平行測(cè)定6份。計(jì)算兩人12個(gè)含量結(jié)果的RSD。

1.3.7 加樣回收率 精密量取本品1 mL，共9份，分別置于50 mL量瓶中。分別精密加入相當(dāng)于測(cè)定量50%水平(0.1126 mg/mL，5 mL)、100%水平(0.1126 mg/mL，10 mL)、150%水平(0.1126 mg/mL，15 mL)的綠原酸對(duì)照品溶液和相當(dāng)于測(cè)定量50%水平(0.3462 mg/mL，5 mL)、100%水平(0.3462 mg/mL，10 mL)、150%水平(0.3462 mg/mL，15 mL)的葛根素對(duì)照品溶液，分別加10%乙醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為回收率供試品溶液，每個(gè)水平制備3份。精密吸取對(duì)照品溶液、回收率供試品溶液各10 μL，依法測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD。

1.3.8 耐用性 分別考察柱溫、流速、磷酸比例、流動(dòng)相比例及色譜柱批號(hào)變化對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。待系統(tǒng)穩(wěn)定后，依次精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定。以含量及RSD為指標(biāo)，考察色譜條件的耐用性。

1.4 樣品測(cè)定 分別采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第186號(hào))和新建立的方法對(duì)市售3批雙葛止瀉口服液進(jìn)行含量測(cè)定，考察本文所建立方法與標(biāo)準(zhǔn)方法檢測(cè)結(jié)果的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

2.1.1 專(zhuān)屬性考察結(jié)果 專(zhuān)屬性結(jié)果表明，在缺金銀花的陰性對(duì)照和缺葛根的陰性對(duì)照色譜圖中，綠原酸和葛根素主峰位置均沒(méi)有干擾，表明本方法專(zhuān)屬性良好。見(jiàn)圖1。

a. 對(duì)照品 b. 供試品 c. 陰性對(duì)照(缺葛根) d. 陰性對(duì)照(缺金銀花)a. Reference Substance b. Test sample c. negative control(lack of Puerariae lobatae radix)d. negative control(lack of Lonicerae japonicae flos)圖1 專(zhuān)屬性考察色譜圖Fig 1 The chromatogram of specific inspection

2.1.2 線性試驗(yàn) 以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，濃度為(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。綠原酸回歸方程為：Y=473.8194X+0.0536(r=1.0000)；葛根素回歸方程為：Y= 214.6356X+ 0.1281(r= 1.0000)。表明綠原酸進(jìn)樣濃度在0.008242～0.1030 mg/mL范圍內(nèi)和葛根素進(jìn)樣濃度在0.02296～0.2871 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣濃度線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度試驗(yàn) 取“1.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸峰面積的RSD為0.1%(n=6)，葛根素峰面積的RSD為0.1%(n=6)，表明儀器精密度良好。

圖2 線性關(guān)系圖Fig 2 The chromatogram of linear relationship results

2.1.4 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液和供試品溶液，分別于第0、2、4、8、12小時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果對(duì)照品溶液中綠原酸峰面積的RSD為0.3%，葛根素峰面積的RSD為0.1%；供試品溶液中綠原酸峰面積的RSD為0.4%，葛根素峰面積的RSD為0.2%，表明對(duì)照品溶液和供試品溶液在12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批樣品，制備6份供試品溶液，依法測(cè)定，綠原酸平均含量為1.2 mg/mL(n= 6)，RSD為1.7%，葛根素平均含量為3.3 mg/mL(n=6)，RSD為1.9%，表明本方法重復(fù)性良好。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab 1 The results of repeatable test results (n=6)

2.1.6 中間精密度 兩名人員在不同日期、使用不同儀器測(cè)得綠原酸的平均含量為1.2 mg/mL(n=12)，RSD為1.4%，葛根素平均含量為3.3 mg/mL(n=12)，RSD為1.5%，表明本方法的中間精密度良好。

表2 中間精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab 2 The results of intermediate precision test

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn) 通過(guò)設(shè)計(jì)3個(gè)加入水平，9份回收率結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果綠原酸回收率在96.35% ～ 101.24%之間，平均值為99.1%(n=9)，RSD為1.8%，葛根素回收率在96.40%～101.77%之間，平均值為98.7%(n = 9)，RSD為1.6%，表明本方法準(zhǔn)確度良好。

表3 綠原酸回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 The results of Chlorogenic Acid recovery test

表4 葛根素回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 4 The results of Puerarin recovery test

2.1.8 耐用性試驗(yàn) 當(dāng)流動(dòng)相比例、柱溫、流速、磷酸含量及色譜柱批號(hào)發(fā)生變化時(shí)，各因素下含量測(cè)定結(jié)果的RSD均≤ 2.0%。色譜條件的微小變化對(duì)含量測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著影響，表明本方法耐用性良好。

表5 耐用性試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 The results of durability test

2.2 樣品含量測(cè)定 取雙葛止瀉口服液樣品(批號(hào)：20200905，20201002，20210301)，分別采用現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法及新建立的方法測(cè)定綠原酸和葛根素的含量，兩種方法檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab 6 The results of sample content determination

3 討論與結(jié)論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用紫外全波長(zhǎng)掃描，綠原酸在327 nm處有最大吸收，葛根素在250 nm處有最大吸收，見(jiàn)圖3?？紤]到本品中葛根素含量高于綠原酸含量，為了使色譜圖中綠原酸和葛根素峰面積大小一致，綜合考慮，選擇315 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖3 綠原酸和葛根素光譜圖Fig 3 The spectrogram of Chlorogenic Acid and Puerarin

3.2 流動(dòng)相的考察 參考相關(guān)文獻(xiàn)方法[9]，以乙腈- 0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(pH 3.0)為流動(dòng)相梯度洗脫，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相洗脫條件，葛根素主峰位置始終有陰性干擾。參考相關(guān)文獻(xiàn)[10]，改變流動(dòng)相為乙腈-0.4%磷酸溶液，采用等度洗脫40 min后仍有色譜峰，為縮短運(yùn)行時(shí)間，最終采用梯度洗脫方法。該方法可提高檢測(cè)效率，減少溶劑用量。

3.3 前處理方法的考察與優(yōu)化 對(duì)照品溶液采用甲醇為稀釋溶劑，經(jīng)重復(fù)性驗(yàn)證，綠原酸的主峰良好，但葛根素主峰前始終有一色譜峰干擾。參考《中國(guó)獸藥典》2020版二部葛根項(xiàng)下，以30%乙醇為稀釋溶劑，該條件下基線平穩(wěn)，綠原酸和葛根素主峰無(wú)干擾。曾分別采用10%乙醇、30%乙醇、50%甲醇、甲醇為提取溶劑制備供試品溶液，結(jié)果50%甲醇和甲醇提取的樣品容量瓶底部產(chǎn)生較多絮狀沉淀，影響體積的準(zhǔn)確性，10%乙醇和30%乙醇提取的樣品比較澄清，綜合考慮，選擇和對(duì)照品溶液一致，以30%乙醇為提取溶劑。進(jìn)而比較了直接搖勻提取和超聲提取法，結(jié)果二者含量無(wú)明顯差異，因此選擇更為簡(jiǎn)便的直接搖勻提取。

本文建立了一個(gè)同時(shí)測(cè)定雙葛止瀉口服液中綠原酸和葛根素含量的方法，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)，可用于雙葛止瀉口服液的質(zhì)量控制。