原發(fā)性干燥綜合征并發(fā)血小板減少的危險(xiǎn)因素分析*

代宛蓉，張 宇，馬 莉△

1.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心,貴州貴陽(yáng) 550004

原發(fā)性干燥綜合征(pSS)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要導(dǎo)致淚腺、唾液腺等外分泌腺受損及功能障礙，以眼、口干燥為主要臨床表現(xiàn)。pSS可伴有肝、腎、肺、血液及皮膚等其他器官系統(tǒng)損傷，其中以血液系統(tǒng)損傷最為常見(jiàn)，可表現(xiàn)為紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)(PLT)減少，三者可單獨(dú)或合并出現(xiàn)[1]。PLT減少是較常發(fā)生的血液系統(tǒng)損傷，輕者可有皮膚淤點(diǎn)淤斑、牙齦滲血、口腔黏膜血皰等癥狀，重者甚至可發(fā)生重要臟器出血而危及生命[2]。pSS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明，主要涉及遺傳、感染及免疫等多方面，其中外分泌腺淋巴細(xì)胞高度浸潤(rùn)是pSS的重要特征，提示淋巴細(xì)胞數(shù)量紊亂及功能障礙可能是pSS的發(fā)病機(jī)制之一[3-4]。淋巴細(xì)胞是構(gòu)成免疫系統(tǒng)的重要成分，是機(jī)體免疫功能的主要執(zhí)行者，不同的淋巴細(xì)胞具有不同表面標(biāo)志及功能特點(diǎn)，借此可將人體中淋巴細(xì)胞分為不同的亞群，其中包括CD3+T淋巴細(xì)胞、CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞和CD3-CD16+CD56+自然殺傷(NK)細(xì)胞，進(jìn)一步依據(jù)膜表面是否表達(dá)CD4和CD8將T淋巴細(xì)胞分為CD3+CD4+的輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)和CD3+CD8+的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)。正常情況下，各淋巴細(xì)胞亞群可維持一定數(shù)量和比例，相互協(xié)調(diào)和制約，當(dāng)淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量失衡及功能發(fā)生改變時(shí)，機(jī)體免疫功能就會(huì)出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致疾病發(fā)生。有研究表明，淋巴細(xì)胞亞群在pSS發(fā)病中有重要作用[5-6]，但在pSS合并PLT減少中的影響尚不清楚。本研究選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的pSS合并PLT減少患者作為研究對(duì)象，分析其外周血淋巴細(xì)胞亞群變化情況，以及與并發(fā)PLT減少之間的相關(guān)性，并結(jié)合免疫球蛋白、補(bǔ)體、自身抗體等免疫學(xué)相關(guān)指標(biāo)探討pSS并發(fā)PLT減少的危險(xiǎn)因素，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019年1月至2021年12月于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的43例pSS患者作為研究對(duì)象，其中男4例，女39例；年齡10～76歲，平均(49.26±14.31)歲。所有患者均按照《論2002年干燥綜合征分類(診斷)標(biāo)準(zhǔn)》[7]確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)同時(shí)患有pSS以外的自身免疫性疾病的患者；(2)合并感染的患者；(3)其他原因引起的PLT減少(原發(fā)性血液系統(tǒng)疾病、藥物影響等)的患者；(4)近1個(gè)月內(nèi)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療的患者；(5)近1個(gè)月內(nèi)輸注過(guò)血小板等血液制品的患者。收集所有pSS患者的性別、年齡、病程等臨床資料，對(duì)所有患者血常規(guī)、外周血淋巴細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)及血清IgG、IgA、IgM、補(bǔ)體(C3、C4)、抗干燥綜合征A(SSA)抗體、抗干燥綜合征B(SSB)抗體、類風(fēng)濕因子(RF)等免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)血常規(guī)中PLT檢測(cè)結(jié)果將43例pSS患者分為PLT減少組(PLT<100×109/L，16例)和PLT正常組(PLT≥100×109/L，27例)。兩組患者年齡、性別、病程等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。見(jiàn)表1。

表1 PLT減少組和PLT正常組一般資料比較[n(%)或M(P25,P75)]

1.2儀器與試劑 FACSCantoTMⅡ流式細(xì)胞儀、流式專用計(jì)數(shù)管及紅細(xì)胞裂解液均購(gòu)自美國(guó)BD公司;CD3 FITC/CD16 56 PE/CD45 PerCP Cy5.5/CD4 PE Cy7/CD19-APC/CD8 APC-Cy7六色組合熒光抗體購(gòu)自北京同生時(shí)代生物技術(shù)有限公司;Sysmex XN-9000全自動(dòng)血液分析儀及試劑購(gòu)自希森美康醫(yī)用電子有限公司;IMMAGE-800全自動(dòng)免疫比濁儀及配套檢測(cè)試劑盒(IgG、IgA、IgM、C3、C4、RF檢測(cè)試劑盒)均購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司;EURO-Blot Master-Ⅱ全自動(dòng)蛋白質(zhì)免疫印跡儀、EURO-Line Scan軟件掃描儀及配套的抗核抗體譜檢測(cè)試劑盒(蛋白質(zhì)免疫印跡法)均購(gòu)自德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司。

1.3方法 所有pSS患者均在晨起空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血3管，其中2管(每管2 mL)采用添加乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑的采血管，用于外周血淋巴細(xì)胞亞群和血常規(guī)檢測(cè)；另一管采用添加促凝劑的采血管采集3 mL血液，以3 000 r/min離心5 min分離出上層血清，用于血清免疫球蛋白、補(bǔ)體、自身抗體檢測(cè)。

1.3.1外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 用反向加樣的方式移取50 μL充分混勻的EDTA-K2抗凝全血，加到預(yù)先加入6 μL六色組合熒光抗體的流式計(jì)數(shù)管中，混勻后室溫避光孵育30 min，加入紅細(xì)胞裂解液充分溶解紅細(xì)胞，混勻后上流式細(xì)胞儀，嚴(yán)格按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作程序進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算各淋巴細(xì)胞亞群(CD3+T、CD3+CD4+T、CD3+CD8+T、CD3-CD19+B、CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞)絕對(duì)計(jì)數(shù)。

1.3.2血常規(guī)檢測(cè) 上述EDTA-K2抗凝全血充分混勻后上全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀，嚴(yán)格按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作程序要求進(jìn)行檢測(cè)，所有標(biāo)本檢測(cè)均在采血后2 h內(nèi)完成。結(jié)果判定以PLT<100×109/L為PLT減少，以PLT≥100×109/L為PLT正常。

1.3.3血清免疫球蛋白、補(bǔ)體、自身抗體檢測(cè) 吸取10 μL上述血清與90 μL標(biāo)本稀釋液(來(lái)自歐蒙抗核抗體檢測(cè)試劑盒)混合進(jìn)行1∶10稀釋，充分混勻后上蛋白質(zhì)免疫印跡儀，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)要求的檢測(cè)步驟進(jìn)行抗SSA、抗SSB抗體檢測(cè)，采用EURO-Line Scan軟件及配套掃描儀進(jìn)行結(jié)果掃描及判讀。剩余血清上全自動(dòng)免疫比濁儀，嚴(yán)格按照儀器標(biāo)準(zhǔn)操作程序檢測(cè)步驟對(duì)IgG、IgA、IgM、補(bǔ)體C3、補(bǔ)體C4、RF水平進(jìn)行檢測(cè)，RF結(jié)果判定以<20 IU/mL為陰性，≥20 IU/mL為陽(yáng)性。

2 結(jié) 果

2.1PLT減少組和PLT正常組外周血淋巴細(xì)胞亞群比較 與PLT正常組比較，PLT減少組患者外周血CD3+CD4+T、CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯增加，而CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PLT減少組和PLT正常組CD3+T和CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 PLT減少組和PLT正常組外周血淋巴細(xì)胞亞群比較個(gè)/微升)

2.2PLT減少組和PLT正常組外周血免疫學(xué)指標(biāo)水平比較 PLT減少組和PLT正常組患者血清IgM、補(bǔ)體C4表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而IgG、IgA、補(bǔ)體C3表達(dá)水平及抗SSA抗體、抗SSB抗體和RF陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 PLT減少組和PLT正常組外周血免疫學(xué)指標(biāo)水平比較或n(%)]

2.3pSS并發(fā)PLT減少的獨(dú)立危險(xiǎn)因素 以pSS并發(fā)PLT減少作為因變量，以外周血CD3+CD4+T、CD3-CD19+B、CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及血清IgM、補(bǔ)體C4表達(dá)水平作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)升高(OR=1.011，95%CI：1.001～1.020)、IgM表達(dá)水平升高(OR=5.693，95%CI：1.376～23.557)是pSS并發(fā)PLT減少的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；補(bǔ)體C4表達(dá)水平降低(OR=0.981，95%CI：0.965～0.998)是pSS并發(fā)PLT減少的保護(hù)因素。見(jiàn)表4。

表4 pSS并發(fā)PLT減少獨(dú)立危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

pSS是一種外分泌腺淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)的自身免疫性疾病，常伴有多系統(tǒng)損傷，尤其以血液系統(tǒng)多見(jiàn)，可累及紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板，其中PLT減少是較為嚴(yán)重的血液系統(tǒng)損傷表現(xiàn)。pSS女性發(fā)病率高于男性，本研究共納入43例pSS患者，女性患者與男性患者比例為9.75∶1.00，與以往研究報(bào)道結(jié)果一致[8]，其中出現(xiàn)PLT減少的pSS患者16例，占比37.2%，高于朱豐林等[9]報(bào)道的5.0%～13.0%，這可能與納入研究的樣本量差異有關(guān)。本研究PLT減少組和PLT正常組患者性別、年齡、病程等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示性別、年齡及病程長(zhǎng)短與pSS患者PLT減少的發(fā)生無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。

目前，pSS并發(fā)PLT減少的機(jī)制尚未完全明確，可能與患者自身免疫系統(tǒng)紊亂及淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量失衡有關(guān)。本研究分別對(duì)16例合并PLT減少和27例PLT正常的pSS患者外周血淋巴細(xì)胞亞群進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示,PLT減少組患者CD3+CD4+T、CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均升高，而CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)降低。Th細(xì)胞可分為Th1和Th2兩種，其中Th1具有輔助細(xì)胞免疫的功能，可通過(guò)分泌干擾素-γ、白細(xì)胞介素-2、腫瘤壞死因子-β等細(xì)胞因子，促進(jìn)CTL、NK細(xì)胞增殖并活化巨噬細(xì)胞，介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)，對(duì)機(jī)體抗感染免疫及清除胞內(nèi)病原體感染有重要作用；Th2細(xì)胞則可誘導(dǎo)B細(xì)胞轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞并產(chǎn)生抗體，在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。CTL是一類具有殺傷活性的效應(yīng)細(xì)胞，能夠通過(guò)分泌穿孔素、顆粒酶等方式對(duì)靶細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用，還能弱化CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的效應(yīng)，抑制細(xì)胞免疫和體液免疫，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[10]。B淋巴細(xì)胞主要執(zhí)行體液免疫，受抗原刺激后，活化增殖的B細(xì)胞可產(chǎn)生大量抗體而發(fā)揮免疫功能。正常情況下，各淋巴細(xì)胞亞群可維持一定數(shù)量和比例，相互協(xié)調(diào)和制約，既能夠清除外來(lái)抗原又不損傷自身組織，維持機(jī)體正常免疫功能。當(dāng)淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量失衡及功能發(fā)生改變時(shí)，機(jī)體會(huì)產(chǎn)生一系列病理變化和免疫功能異常，導(dǎo)致疾病發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，pSS合并PLT減少患者體內(nèi)Th細(xì)胞數(shù)量增多，其中可能存在Th1和Th2細(xì)胞比例失衡，Th1細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子下降，導(dǎo)致對(duì)NK細(xì)胞增殖的輔助作用減低，這也正好解釋了pSS合并PLT減少患者體內(nèi)NK細(xì)胞數(shù)量下降；而Th2細(xì)胞數(shù)量增多活性增強(qiáng)，導(dǎo)致B淋巴細(xì)胞活化、增殖，從而產(chǎn)生多種自身抗體，這些抗體與血小板表面抗原結(jié)合，激活補(bǔ)體和單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，破壞血小板膜的結(jié)構(gòu)和完整性，使外周血PLT減少。有研究表明，Th1/Th2細(xì)胞比例失衡參與了pSS的發(fā)生和發(fā)展[11]，對(duì)于其在pSS并發(fā)PLT減少中是否產(chǎn)生影響少有報(bào)道，Th1/Th2細(xì)胞比例失衡可能是pSS并發(fā)PLT減少的機(jī)制之一，但還需要未來(lái)進(jìn)一步研究。NK細(xì)胞是一類重要的淋巴細(xì)胞亞群，越來(lái)越多的研究表明，NK細(xì)胞不僅可參與抗病毒感染、抗腫瘤和移植物抗宿主反應(yīng)等過(guò)程，還具有免疫調(diào)節(jié)作用，可減少自身反應(yīng)性B淋巴細(xì)胞的增殖及分化，殺傷抗原活化特異性T細(xì)胞，并且可參與調(diào)節(jié)抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性及吞噬作用，抑制自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生，介導(dǎo)機(jī)體免疫耐受形成[12-14]。此外，CTL對(duì)血小板有殺傷作用，而NK細(xì)胞則可通過(guò)殺傷CTL來(lái)減少對(duì)血小板的破壞[13-14]。有研究表明，免疫性血小板減少癥患者脾臟NK細(xì)胞殺傷功能下降[15]，外周血NK細(xì)胞數(shù)量減低，且減低程度與PLT減少程度呈正相關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn),PLT減少組患者外周血NK細(xì)胞絕對(duì)值較PLT正常組降低，而B(niǎo)細(xì)胞絕對(duì)值增高，提示PLT減少患者體內(nèi)可能存在NK細(xì)胞數(shù)量和功能減低，對(duì)B細(xì)胞的抑制作用下降，從而使B細(xì)胞異常增殖產(chǎn)生大量抗體，同時(shí)對(duì)CTL介導(dǎo)的血小板破壞抑制作用減低，以上因素共同導(dǎo)致PLT減少。

pSS患者可出現(xiàn)多種自身抗體陽(yáng)性，本研究記錄了43例pSS患者自身抗體結(jié)果，其中抗SSA抗體、抗SSB抗體及RF陽(yáng)性率分別為88.37%、48.84%和48.84%。有研究發(fā)現(xiàn)，自身抗體與pSS并發(fā)血液系統(tǒng)損傷有關(guān)[17]。有研究報(bào)道顯示，合并PLT減少的pSS患者抗SSA抗體、抗SSB抗體及RF陽(yáng)性率較無(wú)血液系統(tǒng)受累的pSS患者更高[18-19]。但本研究中PLT減少組和PLT正常組患者血清抗SSA抗體、抗SSB抗體及RF陽(yáng)性率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與本研究的樣本量較小有關(guān)，需擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步討論。黃翠平等[20]研究顯示，pSS合并PLT減少患者骨髓檢查表現(xiàn)出產(chǎn)板型巨核細(xì)胞成熟障礙，提示巨核細(xì)胞產(chǎn)血小板功能異常可能是導(dǎo)致其PLT減少的機(jī)制之一。血小板相關(guān)抗體是致使血小板破壞的重要抗體，一方面可通過(guò)與血小板膜表面的糖蛋白相結(jié)合，暴露抗體Fc段，導(dǎo)致單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)血小板過(guò)度破壞;另一方面可通過(guò)與骨髓中的巨核細(xì)胞直接結(jié)合，影響其發(fā)育，致使骨髓巨核細(xì)胞無(wú)法正常成熟，從而抑制血小板生成，提示血小板相關(guān)抗體可能也是導(dǎo)致pSS患者PLT減少的重要原因，未來(lái)還需要更多的研究證實(shí)。除自身抗體外，血清免疫球蛋白和補(bǔ)體水平也常作為反映自身免疫狀態(tài)的指標(biāo)[21]。補(bǔ)體是一組存在于人和脊椎動(dòng)物血清及體液中的可溶性蛋白質(zhì)，活化后具有酶活性，參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，介導(dǎo)免疫復(fù)合物的清除。本研究表明，相對(duì)于PLT正常組患者，PLT減少組患者血清中免疫球蛋白表達(dá)水平均升高，以IgM表達(dá)水平升高最為明顯，且為pSS并發(fā)PLT減少的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而補(bǔ)體C4水平降低，與以往報(bào)道結(jié)果一致[20]。提示pSS并發(fā)PLT減少患者體內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群失衡，免疫功能亢進(jìn)，B細(xì)胞增殖活化，產(chǎn)生更多血小板相關(guān)的自身抗體并形成免疫復(fù)合物，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，通過(guò)補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用導(dǎo)致血小板破壞，而補(bǔ)體因消耗增多而下降，進(jìn)一步說(shuō)明免疫功能紊亂參與了pSS患者并發(fā)PLT減少的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示,CD3+CD4+T、CD3-CD19+B、CD3-CD16+CD56+NK細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)及血清IgM、補(bǔ)體C4表達(dá)水平與pSS并發(fā)PLT減少有關(guān)，其中CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)升高、IgM表達(dá)水平升高是其發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示pSS并發(fā)PLT減少患者體內(nèi)存在明顯的免疫功能紊亂，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)對(duì)于評(píng)估pSS患者機(jī)體免疫功能狀態(tài)及預(yù)測(cè)并發(fā)PLT減少的風(fēng)險(xiǎn)有重要價(jià)值。