罕見類抗-A1抗體引起ABO血型正反定型不符多因素分析*

楊紅梅，鄒 昕#，虞 茜，許 飛，徐 立△

1.江蘇省常州市中心血站,江蘇常州 213000,2.江蘇省常州市臨床輸血重點(diǎn)?？茖?shí)驗(yàn)室,江蘇常州 213000

ABO血型系統(tǒng)是最早被發(fā)現(xiàn)的人類血型系統(tǒng)，其基因位于第9號(hào)染色體，同時(shí)也是最重要的一個(gè)血型系統(tǒng)，在臨床輸血、移植醫(yī)學(xué)和產(chǎn)前診斷中具有重要意義。在日常ABO血型鑒定工作中，常常會(huì)碰到正反定型不一致，在排除人為操作因素外，不規(guī)則抗體和亞型往往是研究者考慮的方向[1-3]。本實(shí)驗(yàn)室在ABO血型鑒定過程中發(fā)現(xiàn)1例正反定型不符標(biāo)本，該標(biāo)本血型血清學(xué)無法判斷其血型，借助不規(guī)則抗體篩查、吸收放散試驗(yàn)、凝集抑制試驗(yàn)、酶處理試驗(yàn)、不同溫度效價(jià)試驗(yàn)、溶血率監(jiān)測(cè)等檢測(cè)手段，并結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物(PCR-SSP)基因分型和ABO基因第6、7外顯子擴(kuò)增產(chǎn)物基因測(cè)序，最后確定其血型為A101型。該病例為A型罕見的產(chǎn)生了類抗-A1抗體，目前國內(nèi)少見其相關(guān)報(bào)道。

1 資料與方法

1.1一般資料 常某某，男，74歲，江蘇常州人，漢族，2021年3月3日因肩骨疼痛入住常州市中醫(yī)醫(yī)院，術(shù)前常規(guī)備血過程中發(fā)現(xiàn)其鑒定正定型為A型，反定型為O型，正反定型不符，于當(dāng)天送常州市中心血站輸血研究室進(jìn)行血型鑒定。

1.2儀器與試劑 抗-A/B單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20200609)、抗-D(IgM)單克隆抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20200301101)、抗-H抗體(德國CE公司，批號(hào)：OHM142)、抗-AB抗體(德國CE公司，批號(hào)：OABM083)、抗-A1抗體(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20200522)、ABO血型反定型紅細(xì)胞(北京金豪制藥股份有限公司，批號(hào)：2021101001)、人源抗-A/B單克隆抗體(自制)、血型分析液(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，批號(hào)：20216201)、血型試劑質(zhì)控試劑盒(上海申型醫(yī)學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20227202)、抗-Lea和抗-Leb抗體(德國CE公司，批號(hào)：OLeaM121-1和OLebM110-1)、抗體篩選細(xì)胞(匈牙利REAGENS公司,批號(hào)：702013)、微量游離血紅蛋白(FHb)檢測(cè)試劑盒(QuantiChrom公司，批號(hào)：210114)、ABO-PCR-SSP基因分型試劑盒(天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司，批號(hào)：K202008006)、DNA提取試劑(美國Invitrogen公司，批號(hào)：15101)、瓊脂糖(北京沃森生物科技有限公司，批號(hào)：181650)、溴化乙錠(10 mg/mL，青島捷世康生物科技有限公司)。美國AB公司9700型PCR擴(kuò)增儀、DNA濃度測(cè)定儀、凝膠成像系統(tǒng)、美國貝克曼庫爾特的高速離心機(jī)、日本久保田的KA-2200型血清學(xué)專用離心機(jī)。37 ℃恒溫水浴箱、湖南盧湘儀的TD4低速自動(dòng)平衡離心機(jī)、北京瑞爾達(dá)生物科技有限公司的F4040半自動(dòng)生化分析儀。

1.3血清學(xué)檢測(cè) 采用試管法進(jìn)行ABO正反定型試驗(yàn)。取B型獻(xiàn)血者、O型獻(xiàn)血者和患者紅細(xì)胞少許，生理鹽水洗滌3次，配制成2%紅細(xì)胞懸液進(jìn)行抗-H、抗-A1和抗-AB試驗(yàn)，離心判讀凝集強(qiáng)度；同時(shí)對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行抗體篩查。所有試驗(yàn)均嚴(yán)格按照《AABB技術(shù)手冊(cè)(第18版)》[4]和文獻(xiàn)[5]的方法及試劑操作說明書進(jìn)行。

1.4PCR-SSP基因組DNA提取及ABO基因擴(kuò)增、圖譜比對(duì)分析 采用Invitrogen公司DNA提取試劑盒提取患者外周血基因組DNA，調(diào)整DNA模板濃度為30～35 ng/μL，A260/A280為1.60～1.80，根據(jù)人類ABO血型基因檢測(cè)試劑盒說明書設(shè)置參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；取擴(kuò)增產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，并與天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司提供的圖譜比對(duì)分析結(jié)果。

1.5ABO基因測(cè)序分析和序列比對(duì) ABO基因第6、7外顯子擴(kuò)增片段大小約為2 019 bp，擴(kuò)增反應(yīng)體系根據(jù)天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司試劑盒說明書進(jìn)行，采用引物：上游5′-CCTGCCAGCTCCATGTGAC-3′；下游：5′-CAGGACGGACAAAGGA-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后并測(cè)序，該試驗(yàn)部分在天津市秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司完成。第6外顯子測(cè)序引物為上游：5′-CATGTGGGTGGCACCCTGCC-3′；下游：5′-ATGTCCACAGTCACTCGCCA-3′。第7外顯子測(cè)序引物為上游：5′-GCTCCCCCAGCCCCCGTCCG-3′；下游：5′-GTTTACCCGTTCTGCTAA-3′。

2 結(jié) 果

2.1血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 采用試管法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行ABO血型血清學(xué)檢測(cè)，正定型與抗-A凝集強(qiáng)度可達(dá)4+，與抗-B不反應(yīng)。反定型患者血漿與A細(xì)胞(Ac)、B細(xì)胞(Bc)呈強(qiáng)凝集，與O細(xì)胞(Oc)和自身細(xì)胞(自身c)均不反應(yīng)。進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H抗原表達(dá)強(qiáng)度很弱，與正常Bc幾乎一致(正常O型抗-H凝集強(qiáng)度3+，正常B型抗-H凝集強(qiáng)度1+w/±)，與抗-A1、抗-AB呈4+凝集，排除A2亞型。為排除冷性不規(guī)則抗-A抗體，將反定型試管離心于37 ℃孵育15 min后再看結(jié)果，與Ac和Bc仍有凝集。為進(jìn)一步鑒定是否存在同種抗體干擾血型，進(jìn)行了抗篩試驗(yàn)，結(jié)果在鹽水、凝聚胺、抗人球蛋白3種介質(zhì)中均無凝聚、無溶血。以上試驗(yàn)排除了亞型、冷抗體及同種抗體等多因素干擾。

2.2試劑抗體或抗保養(yǎng)液抗體判斷 將反定型試劑細(xì)胞經(jīng)生理鹽水洗滌3次后配成2%左右紅細(xì)胞懸液(此時(shí)無保養(yǎng)液)進(jìn)行血型血清學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)反定型Ac呈陰性，但換成血型稀釋液即保養(yǎng)液后反定型Ac呈陽性(有無添加保養(yǎng)液對(duì)Oc和自身c均無影響)，見表1。

表1 患者血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.3多細(xì)胞凝集判斷 多凝集紅細(xì)胞抗原是由于各種原因產(chǎn)生膜抗原暴露，從而導(dǎo)致多細(xì)胞凝集現(xiàn)象，這與臨床疾病、人體免疫機(jī)制及紅細(xì)胞免疫有關(guān)。為驗(yàn)證是否為多細(xì)胞凝集，整個(gè)試驗(yàn)過程參考《AABB技術(shù)手冊(cè)(第18版)》進(jìn)行，結(jié)果見表2。如果為多細(xì)胞凝集，則用酶處理患者細(xì)胞A抗原強(qiáng)度大大減弱，而正常A型紅細(xì)胞A抗原強(qiáng)度不會(huì)減弱，患者紅細(xì)胞經(jīng)木瓜酶處理后A抗原強(qiáng)度并沒有減弱，排除Tn多細(xì)胞凝集現(xiàn)象，說明正定型為A型。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，排除多細(xì)胞凝集干擾。

表2 Tn多細(xì)胞凝集試驗(yàn)結(jié)果

2.4吸收放散試驗(yàn) 第1組取0.3 mL患者壓積紅細(xì)胞(Pc)與0.3 mL等量生理鹽水56 ℃放散10 min；第2組取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清4 ℃吸收1 h即刻離心，冷鹽水洗滌6次，加等量生理鹽水56 ℃放散10 min；第3組取0.3 mL A型混合Pc加0.3 mL患者血清及2滴血型稀釋液(保養(yǎng)液)4 ℃吸收1 h即刻離心，冷鹽水洗滌6次，加等量生理鹽水56 ℃放散10 min。試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，第2組吸收后血漿呈溶血狀態(tài)，即促發(fā)溶血反應(yīng)并且A型紅細(xì)胞在無保養(yǎng)液的情況下未能吸收抗-A抗體，所以吸收后血漿抗-A呈陽性而放散試驗(yàn)呈陰性。而第3組加血型稀釋液(保養(yǎng)液)后抗-A能很好地被A細(xì)胞吸附，經(jīng)56 ℃也能很好地放散下來，見表3。

表3 吸收放散試驗(yàn)結(jié)果

2.5不同抗凝劑的溶血率監(jiān)測(cè)分析 在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同顏色的標(biāo)本管溶血程度完全不同，紫管第2天出現(xiàn)了肉眼可見的溶血現(xiàn)象。連續(xù)10 d監(jiān)測(cè)3種試管中血漿或血清FHb水平，結(jié)果見表4、圖1。其中紫管抗凝劑為乙二胺四乙酸，綠管抗凝劑為枸櫞酸鈉，紅管無抗凝劑。紫管與紅管、綠管FHb水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖1 3種試管連續(xù)監(jiān)測(cè)10 d FHb水平比較

注：與紫管比較，*P<0.05。

表4 3種試管中FHb水平比較(g/L)

2.6不同介質(zhì)中Ac重懸液的抗體效價(jià)測(cè)定 取380 μL血清加20 μL質(zhì)控液，加400 μL 2-Me混合于37 ℃水浴箱中破壞30 min，離心后取4滴破壞液和1滴Ac混合離心結(jié)果為陰性，說明破壞完全且該抗體為IgM型抗體。采用倍比稀釋測(cè)定IgM抗體效價(jià)，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，未加保養(yǎng)液的Ac和該抗體無凝集反應(yīng)，加保養(yǎng)液后效價(jià)達(dá)到16，至少增強(qiáng)4管。

表5 不同介質(zhì)中Ac重懸液的抗體效價(jià)測(cè)定

2.7唾液試驗(yàn) 收集患者唾液離心后用玻璃管煮沸10 min再次離心，取上清液備用。同時(shí)將抗-A、抗-B、抗-H稀釋調(diào)整到2+的凝集強(qiáng)度，標(biāo)好試管，先加抗-A、抗-B、抗-H 100 μL到試管中，陰性對(duì)照管加100 μL生理鹽水，測(cè)試管加100 μL唾液，離心混勻置4 ℃ 1 h后加0.8%Ac、Bc和Oc，置4 ℃ 30 min，結(jié)果唾液中檢測(cè)到A物質(zhì)和H物質(zhì)。進(jìn)一步對(duì)患者紅細(xì)胞Lewis系統(tǒng)抗原進(jìn)行測(cè)定，表現(xiàn)型為Le(a-b+)，結(jié)合結(jié)果該患者為A型分泌型，說明該患者反定型抗體并非抗-ALeb抗體。

2.8ABO-PCR-SSP及基因測(cè)序 經(jīng)ABO-PCR-SSP及第6、7外顯子測(cè)序，以A101作為測(cè)序標(biāo)準(zhǔn)序列，患者第6、7外顯子未見堿基替換和氨基酸替換，表現(xiàn)型為A1，基因測(cè)序?yàn)锳BO*A1.01，見表6。

表6 患者ABO血型第6、7外顯子核苷酸序列結(jié)果

3 討 論

類同種抗體指類似于同種抗體性質(zhì)的自身抗體，但不同于自身抗體。比如RhD(+)患者血漿中有類同種抗-D，該患者血漿中抗-D與其他所有人的RhD(+)紅細(xì)胞均反應(yīng)，但與自身紅細(xì)胞不反應(yīng)，這應(yīng)該是同種抗體，但又和同種抗體不一樣，所以將這樣的抗體定義為“類同種抗體”?？?A1有類同種抗-A1抗體，這種抗體除了不與自身紅細(xì)胞反應(yīng)外，能凝集所有A1細(xì)胞，與疾病、免疫應(yīng)答和抗體三維結(jié)構(gòu)改變有關(guān)[6]?？?A1還可能受Rh相關(guān)糖蛋白的影響，有文獻(xiàn)報(bào)道了1例很獨(dú)特的抗-A1，它只凝集A型RhD+細(xì)胞，而且這例抗-A1與A1D+細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)于A2D+細(xì)胞，同時(shí)這例抗-A1不與A1D-細(xì)胞反應(yīng)，也不與O型D+細(xì)胞反應(yīng)[6-7]。被認(rèn)為是Rh相關(guān)蛋白影響了A1細(xì)胞在不同RhD(+/-)時(shí)與抗-A1的反應(yīng)情況，可能是因?yàn)槟ね饪乖S構(gòu)象改變所致[8]。而抗-A1有類同種抗體，類同種抗-A1抗體可存在于A1型人血漿中，但與自身A1型紅細(xì)胞不反應(yīng)，可與其他人A1型紅細(xì)胞反應(yīng)，這種類同種抗-A1抗體在理論上屬于自身抗體，但其分子生物學(xué)結(jié)構(gòu)目前還缺少研究報(bào)道。

本病例在鑒定其血型過程中，排除了亞型、冷抗體及同種抗體等多因素的干擾，進(jìn)一步考慮是否為試劑抗體或者抗保養(yǎng)液抗體導(dǎo)致血型不一致，或存在Tn多細(xì)胞凝集或異體抗-A抗體還是抗-ALeb抗體或抗-HA抗體或類抗-A1抗體等多因素，并通過相關(guān)血型血清學(xué)技術(shù)手段一一驗(yàn)證。在試劑抗體或者抗保養(yǎng)液抗體試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，患者血漿中存在一種和A抗原特異性反應(yīng)的抗-A抗體，該抗體可以被紅細(xì)胞保養(yǎng)液增強(qiáng)，但也很容易被生理鹽水洗脫，且親和力不強(qiáng)。而抗保養(yǎng)液抗體一般反定型Ac、Bc、Oc都凝集(室溫鹽水弱凝集)、與自身c不反應(yīng)、直接抗人球蛋白試驗(yàn)陰性、無冷抗體特性及能排除類同種抗體等特點(diǎn)，排除了并非為抗保養(yǎng)液抗體引起的正反定型血型不一致。同時(shí)，隨機(jī)挑取3位健康A(chǔ)型獻(xiàn)血者和3位健康O型獻(xiàn)血者與本研究的患者進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)，本研究的患者血清與3位健康A(chǔ)型獻(xiàn)血者用生理鹽水配置的2%紅細(xì)胞懸液在鹽水和抗人球蛋白卡中均為陰性，而凝聚胺為陽性，這種情況通常發(fā)生在弱冷抗體情況下，但弱冷抗體被保養(yǎng)液明顯增強(qiáng)的案例少見報(bào)道。本研究的患者血清與3位健康O型獻(xiàn)血者用生理鹽水配置的2%紅細(xì)胞懸液配血在3種介質(zhì)中均無凝集、無溶血。

總之，ABO血型鑒定極其重要，若存在正反定型不一致時(shí)，非常有必要采用血型血清學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)，以確保臨床輸血安全。