FN1、LZTS2、ERBB3在甲狀腺癌演進(jìn)過程中表達(dá)水平變化分析*

孟午生，程 娜，馬曉紅，郭 晶

北京市門頭溝區(qū)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 102300

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤，根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)團(tuán)隊(duì)統(tǒng)計(jì)，2020年全球新發(fā)甲狀腺癌58.6萬例，我國(guó)新發(fā)22.1萬例，占全球新發(fā)甲狀腺癌的37.71%[1]。盡管甲狀腺癌病死率低，絕大多數(shù)患者經(jīng)手術(shù)切除或術(shù)后接受131I治療可達(dá)到臨床治愈，但仍有部分患者會(huì)發(fā)生復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，影響其預(yù)后[2-3]。目前，甲狀腺癌發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，探索相關(guān)分子機(jī)制仍然是研究的熱點(diǎn)。纖連蛋白1(FN1)是組織和體液中廣泛存在的一種高分子糖蛋白，參與細(xì)胞遷移、黏附、增殖和組織修復(fù)等過程，近年有研究報(bào)道顯示，F(xiàn)N1與宮頸癌、乳腺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[4-5]。亮氨酸拉鏈腫瘤抑制因子2(LZTS2)是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，近年有研究報(bào)道顯示，LZTS2參與調(diào)控鼻咽癌、肝癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[6-7]。Erb-B2受體酪氨酸激酶3(ERBB3)是表皮生長(zhǎng)因子受體家族成員，參與腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，與卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲有關(guān)[8-9]。目前，關(guān)于FN1、LZTS2、ERBB3在甲狀腺癌演進(jìn)過程中的表達(dá)水平變化報(bào)道較少，本研究通過觀察FN1、LZTS2、ERBB3在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平變化情況，并分析其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2017年1月本院收治的110例甲狀腺癌患者作為研究對(duì)象，收集術(shù)中切除的部分癌組織和癌旁組織，液氮冷凍后采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA的表達(dá)水平。男43例，女67例；年齡35～78歲，平均(45.77±7.18)歲；病理類型：分化型88例，未分化型22例；腫瘤最大徑：≥1 cm 48例，<1 cm 62例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期64例，Ⅲ～Ⅳ期46例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有轉(zhuǎn)移41例，無轉(zhuǎn)移69例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后經(jīng)病理檢查確診；(2)年齡≥18歲；(3)初診，未接受任何抗腫瘤治療；(4)接受根治性切除或姑息性切除；(5)可接受隨訪且資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他部位惡性腫瘤；(2)合并重要器官器質(zhì)性病變；(3)全身感染性疾病。本研究所有患者及家屬均知情同意并簽署知情同意書，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法 將液氮冷凍組織研磨成末，采用TRIzol試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司，批號(hào)：15596-018)提取組織中總RNA,采用Takara試劑盒(北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：RR047A)轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系共20 μL：RNA 1 μL、OligoDT 1 μL、5×RT Buffer 4 μL、dNTP 2 μL、M-MLV 1 μL、DEPC水11 μL；反應(yīng)條件：42 ℃反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)60 min、70 ℃反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)10 min。Narodrop 2000分光光度計(jì)驗(yàn)證cDNA濃度及純度，濃度及純度合格(A260/A280為1.8～2.0)通過美國(guó)伯樂CFX qRT-PCR儀和qRT-PCR試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，批號(hào)：JN0052)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)和合成。FN1上游引物：5′-TCAGTCGGTGGTCATCTTTGG-3′；下游引物：5′-CCTCCAGGTATCTTTTCCACTCT-3′。LZTS2上游引物：5′-TACCATCTGAGTTGCTGATTGC-3′；下游引物：5′-AGAGAGGAAGGAATGGGAGATC-3′；ERBB3上游引物：5′-TCCCAGAGTTCATACCAGGA-3′；下游引物：5′-AATCTGTGCATGAAGGGAAC-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3′；下游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3′。反應(yīng)體系共25.0 μL：Green?Premix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL、上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、cDNA模板 2.0 μL、ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s，循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管Ct值，F(xiàn)N1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3隨訪 患者出院后通過門診或電話方式隨訪5年，統(tǒng)計(jì)術(shù)后5年的總生存率。

2 結(jié) 果

2.1甲狀腺癌組織與癌旁組織中FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平比較 與癌旁組織比較，甲狀腺癌組織中FN1 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平均升高，LZTS2 mRNA表達(dá)水平降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 甲狀腺癌組織與癌旁組織中FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平比較

2.2不同病理特征甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平比較 不同性別、年齡、病理類型、腫瘤最大徑甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同病理特征甲狀腺癌患者FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平比較

2.3不同F(xiàn)N1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平甲狀腺癌患者總生存率比較 中位隨訪40個(gè)月，110例甲狀腺癌患者總生存率為81.82%(90/110)，根據(jù)甲狀腺癌組織中FN1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示，F(xiàn)N1 mRNA、ERBB3 mRNA高表達(dá)組總生存率低于FN1 mRNA、ERBB3 mRNA低表達(dá)組，LZTS2 mRNA高表達(dá)組總生存率高于LZTS2 mRNA低表達(dá)組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表3。

注：A為FN1 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組甲狀腺癌患者生存曲線；B為L(zhǎng)ZTS2 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組甲狀腺癌患者生存曲線；C為ERBB3 mRNA高表達(dá)組和低表達(dá)組甲狀腺癌患者生存曲線。

表3 不同F(xiàn)N1 mRNA、LZTS2 mRNA、ERBB3 mRNA表達(dá)水平甲狀腺癌患者總生存率比較[n(%)]

3 討 論

甲狀腺癌是起源于甲狀腺濾泡上皮或?yàn)V泡旁上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，作為一種惰性腫瘤，其發(fā)病較慢，惡性程度較低，近年來隨著診療水平的提高和131I的應(yīng)用，甲狀腺癌5年生存率已高達(dá)84.3%[10]。但是部分甲狀腺癌患者細(xì)胞形態(tài)和功能會(huì)在自然病程或治療過程中發(fā)生退行性改變，易出現(xiàn)腺外侵犯、血管侵襲、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差[11]。甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展是多階段和多因素共同參與的過程，目前各類靶向藥物相對(duì)缺乏，急需進(jìn)一步了解甲狀腺癌的分子機(jī)制，以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)治療和判斷不良預(yù)后。

細(xì)胞外基質(zhì)是為周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)和蛋白及多糖纖維支持的膠狀結(jié)構(gòu)，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程中，癌細(xì)胞先從原發(fā)部位脫落侵入細(xì)胞外基質(zhì)，再與細(xì)胞間質(zhì)和基底膜中分子黏附，協(xié)助癌細(xì)胞穿過細(xì)胞外基質(zhì)和侵入其他部位[12]。FN1作為細(xì)胞外基質(zhì)中主要的非膠原性糖蛋白，能幫助維持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)細(xì)胞間黏附。基于FN1與細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)系，ZHAI等[13]研究報(bào)道，F(xiàn)N1能上調(diào)GATA結(jié)合蛋白6表達(dá)水平，促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌增殖、集落形成、侵襲和遷移。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中FN1 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，且不同TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者FN1 mRNA水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示FN1在甲狀腺癌中發(fā)揮促癌基因作用，其機(jī)制可能與FN1參與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)有關(guān)。EMT是一種正常的生理現(xiàn)象，是指上皮細(xì)胞在EMT過程中失去細(xì)胞間連接，使上皮細(xì)胞間結(jié)構(gòu)松散，以促進(jìn)配體發(fā)育和組織再生，若腫瘤細(xì)胞異常激活EMT，會(huì)賦予腫瘤細(xì)胞更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。有研究表明，F(xiàn)N1是一種新型的EMT標(biāo)志物，F(xiàn)N1高表達(dá)能夠促進(jìn)甲狀腺癌發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞黏附、遷移和侵襲[15]。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)N1 mRNA高表達(dá)組總生存率明顯降低，說明甲狀腺癌組織中FN1 mRNA高表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，可成為甲狀腺癌預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與基因異常轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)[16]。LZTS是一個(gè)在基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮重要作用的家族，LZTS2是LZTS家族的第2個(gè)成員，能通過結(jié)合DNA的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子或通過蛋白間相互作用影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。近年有研究發(fā)現(xiàn)，LZTS2在染色體的定位與抑癌基因“人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因”相鄰，并且在鼻咽癌、肝癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)水平下調(diào)或缺失，在正常組織中表達(dá)水平升高[6-7]。然而，關(guān)于LZTS2與甲狀腺癌的關(guān)系報(bào)道較少。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中LZTS2 mRNA表達(dá)水平下調(diào)，并且與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示LZTS2在甲狀腺癌中發(fā)揮抑癌基因作用，其機(jī)制可能與LZTS2參與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin有關(guān)。Wnt/β-catenin是目前公認(rèn)的腫瘤相關(guān)信號(hào)通路之一，該通路異常活化與癌細(xì)胞多種惡性行為密切相關(guān)[17]。有研究表明，LZTS2的C-末端447-669氨基酸序列能與β-catenin的armadillo序列結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin通路活化，同時(shí)LZTS2還能結(jié)合核因子-κB，抑制核因子-κB介導(dǎo)的β-catenin核內(nèi)聚集過程，進(jìn)而使Wnt/β-catenin通路激活[18-19]。本研究結(jié)果顯示，LZTS2 mRNA高表達(dá)組總生存率明顯升高，說明甲狀腺癌組織中LZTS2 mRNA高表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，可成為甲狀腺癌預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

腫瘤進(jìn)展中伴有多條信號(hào)通路異常激活或失活，Wnt/β-catenin、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是經(jīng)典癌癥信號(hào)通路，已被證實(shí)參與甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展[17，20-21]。ERBB3是EGFR家族的一員，當(dāng)ERBB3過表達(dá)或基因擴(kuò)增時(shí)，能激活下游Wnt/β-catenin、EGFR、PI3K/Akt等信號(hào)通路，充當(dāng)多種惡性腫瘤的促癌基因而促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展[22-23]。本研究結(jié)果顯示，甲狀腺癌組織中ERBB3 mRNA表達(dá)水平上調(diào)，且不同TNM分期和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移甲狀腺癌患者ERBB3 mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示ERBB3在甲狀腺癌中發(fā)揮促癌基因作用，考慮與ERBB3能激活Wnt/β-catenin、PI3K/Akt等信號(hào)通路有關(guān)。有研究顯示，甲狀腺癌患者PI3K、EGFR基因明顯富集于ERBB3高表達(dá)患者中[24]。本研究結(jié)果顯示，ERBB3 mRNA高表達(dá)組總生存率明顯降低，說明甲狀腺癌組織中ERBB3 mRNA高表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，可成為甲狀腺癌預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

綜上所述，甲狀腺癌組織中FN1 mRNA、ERBB3 mRNA呈高表達(dá)，LZTS2 mRNA呈低表達(dá)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為甲狀腺癌預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。但本研究樣本量較少，有關(guān)FN1、LZTS2、ERBB3參與甲狀腺癌的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。