水稻甲基轉移酶家族成員OsMT1 突變體的創(chuàng)建及功能分析

田 瑤，王馨翊，王 鑫，蘭志鵬，周詩晨，楊曉穎，胡又川，梁閃閃，張泗舉，欒維江

（1.天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.天津師范大學天津市動植物抗性重點實驗室，天津 300387）

甲基轉移酶是一類能夠催化甲基化反應的酶，通常以S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）為甲基供體，在調(diào)控動植物生長發(fā)育中具有重要作用.根據(jù)所選擇底物的不同，可將甲基轉移酶分為遺傳物質(zhì)甲基轉移酶和非遺傳物質(zhì)甲基轉移酶[1]. 遺傳物質(zhì)甲基轉移酶可以催化遺傳物質(zhì)DNA 的甲基化反應，以SAM 為甲基供體，將甲基轉移至靶序列的特定堿基上.非遺傳物質(zhì)甲基轉移酶主要以SAM 為甲基供體，以激素、蛋白質(zhì)殘基及芳香族化合物為底物[2]，將甲基轉移至這些底物上，參與染色體的形成和激素及激素衍生物的合成. 近年來，科學家們對以激素作為底物的甲基轉移酶家族進行了深入的研究，并以最早鑒定出的水楊酸甲基轉移酶（SAMT）[3]、苯甲酸甲基轉移酶（BAMT）[4]和可可堿合酶（TCS）[5]為基礎，將其命名為SABATH 家族. Seo等[6]、Qin 等[7]和Hippauf 等[8]發(fā)現(xiàn)SABATH 家族成員還可催化茉莉酸（JA）、吲哚-3-乙酸和苯甲酸/水楊酸（SA）等發(fā)生甲基化反應，使SABATH 家族進一步擴大.

模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa）中分別有24 和41 個SABATH 家族成員[9]，其中大多數(shù)成員的功能未知.在擬南芥中，AtJMT 是一個JA 甲基轉移酶基因，在不改變茉莉酸含量的情況下，過量表達AtJMT 可以使內(nèi)源茉莉酸甲酯的含量增加3 倍[6].水稻中OsJMT1 能甲基化JA，過量表達OsJMT1能夠提高水稻基礎和褐飛虱誘導的茉莉酸甲酯（MeJA）水平，從而調(diào)節(jié)植物的生長和防御[10].在水稻中過量表達OsJMT1 會影響水稻的小穗發(fā)育，使籽粒產(chǎn)量下降[11].本研究利用CRISPR-Cas9 基因編輯技術對水稻SABATH 家族中的OsMT1 基因進行編輯，獲得轉基因植株，對編輯植株進行測序分析，得到目的基因的突變體材料，并利用該突變體對OsMT1 基因的功能進行探究.

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻品種中花11（Oryza sativa L.ssp. Japonica cv.Zhonghua11）及其CRISPR-Cas9 基因編輯材料.

1.2 CRISPR-Cas9 載體的構建

首先從NCBI（www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫中獲得OsMT1 基因的序列，分析該基因的結構域，將靶點設計在結構域前或結構域中.之后利用E-CRISPR 在線設計平臺（http：//www.e-crisp.org）分析OsMT1 基因的編碼序列，按照（N）20NGG 的特點選擇合適的靶點，并對靶點序列進行比對，選擇特異性好的靶點.按此原則，最終在OsMT1 基因的第2 個外顯子上選擇了2 個靶點（TG1 和TG2），靶點TG1 的序列為5′-TCGAGGAAGCTCACGCGTCGC-3′，TG2 的 序 列 為5′-CCTACTGCCTCATGTGGCGC-3′.利用PCR 擴增出含有靶點的目的片段，與含有sgRNA 結構的載體進行連接，獲得U6a：：TG1-sgRNA 和U6b：：TG2-sgRNA 融合載體.用Bsa I 對U6a：：TG1-sgRNA、U6b：：TG2-sgRNA 以及CRISPR-Cas9 載體進行酶切后，再使用T4 DNA 連接酶進行連接，獲得最終的重組載體.

1.3 轉基因植株的分子檢測

利用鑒定正確的CRISPR-Cas9 重組載體，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化法獲得轉基因植株，用CTAB 法提取每個單株葉片的基因組DNA，再利用載體上特有的潮霉素標記基因進行PCR 分子檢測. 檢測引物Hyg-F 的序列為5′-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3′，Hyg-R 的序列為5′-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3′.擴增程序為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個循環(huán)，72 ℃終延伸7 min，4 ℃保存.

1.4 轉基因植株的突變類型分析

構建CRISPR-Cas9 重組載體時，設計了2 個靶點（TG1、TG2），由于2 個靶點之間的距離較遠，因此設計2 對特異性引物分別進行檢測. 檢測引物的序列如表1 所示.經(jīng)過PCR 擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，得到結果后，通過DSDecodeM 網(wǎng)站（http：//dsdecode.scgene.com/）對突變位點進行解碼，并將測序結果與野生型序列進行比對，分析突變類型.

表1 OsMT1 基因編輯位點的檢測引物及序列Tab.1 Primers for the detection of the OsMT1 editing sites

1.5 鹽脅迫處理及表型統(tǒng)計

選取成熟且飽滿的野生型種子和不同編輯類型的突變體種子進行消毒，在34 ℃恒溫箱中催芽.將催芽后的種子分別擺在含有50、100 及150 mmol/L NaCl的Agar 培養(yǎng)基上生長，以不含NaCl 的Agar 培養(yǎng)基作為空白對照.在28 ℃、12 h 光照、12 h 黑暗循環(huán)的條件下培養(yǎng)7 d 后，分別測量野生型和OsMT1-CRISPR編輯突變體的地上以及地下部分的長度，拍照記錄.

2 結果與分析

2.1 CRISPR-Cas9 載體的構建

OsMT1 基因序列的全長為2 180 bp，含有4 個外顯子和5 個內(nèi)含子，編碼序列總長為1 143 bp，共編碼380 個氨基酸，第2 至4 個外顯子上含有SAM 依賴性羧甲基轉移酶（Methyltransf_7）結構域，因此在第2 個外顯子上選擇TG1 和TG2 2 個靶點，如圖1（a）所示.將2 個靶點分別連接到含sgRNA 結構的表達載體中，獲得U6a：：TG1-sgRNA 和U6b：：TG2-sgRNA 中間融合載體. 之后用Bsa I 酶切U6a：：TG1-sgRNA、U6b：：TG2-sgRNA 和CRISPR-Cas9 空載體，并使用T4 DNA連接酶連接，獲得含有TG1 和TG2 2 個靶點的重組載體.對獲得的中間融合載體及最終重組載體進行菌落PCR鑒定，結果表明擴增出了預期的目的片段，如圖1（b）所示.對重組載體進行酶切鑒定，得到了預期的含有TG1 和TG2 2 個靶點的目的條帶，如圖1（c）所示，表明2 個靶點成功連入了CRISPR-Cas9 空載體中，載體構建成功.

圖1 OsMT1 基因CRISPR-Cas9 表達載體的構建Fig.1 Construction of CRISPR-Cas9 vetor for OsMT1

2.2 轉基因植株的獲得及編輯類型分析

重組載體構建成功后，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉化法，經(jīng)過誘導、繼代、侵染、篩選、分化、生根等過程，共獲得45 株轉基因植株.用載體中特異的潮霉素抗性基因進行鑒定，結果如圖2 所示.由圖2 可以看出，45 株植株中有32株為轉基因陽性植株.

圖2 轉基因植株的分子檢測Fig.2 Molecular detection of the transgenic plants

種植部分轉基因陽性植株，獲得T2代轉基因株系，利用靶點特異性檢測引物對T2代轉基因植株進行PCR測序分析，發(fā)現(xiàn)有5 種編輯類型，如圖3 所示.由圖3（a）可以看出，osmt1-1 編輯突變體是TG1 和TG2 2 個靶點都發(fā)生了編輯的純合突變體，在TG1 的PAM 序列前插入了1 個A 堿基，在TG2 的PAM 序列前10 bp 處插入了1 個A 堿基.由圖3（b）可以看出，osmt1-2 編輯突變體僅在TG1 靶點發(fā)生了編輯，該突變體在TG1 靶點處的2 條鏈分別發(fā)生插入和缺失，其中一條同源染色體在PAM序列處插入1個A 堿基，而另外一條染色體在PAM 序列處缺失3 個堿基，測序出現(xiàn)了連續(xù)的套峰.由圖3（c）可以看出，osmt1-3 編輯突變體是在2 個靶點都發(fā)生了編輯的純合突變體，在TG1 的PAM序列后缺失9bp，在TG2的PAM 序列前10 bp 處插入了1 個A 堿基.由圖3（d）可以看出，osmt1-4 編輯突變體也是在2 個靶點都發(fā)生了編輯的純合突變體，在TG1 的PAM 序列前1 bp 處插入1 個T 堿基，在TG2 靶點的PAM 序列前9 bp 處缺失3 bp.由圖3（e）可以看出，osmt1-5 編輯突變體在TG1靶點處發(fā)生了雜合編輯，在一條同源染色體上的PAM序列前插入了1 個A 堿基，在另一條同源染色體對應位置處插入了1 個T 堿基，未出現(xiàn)連續(xù)的套峰；在TG2靶點的PAM 序列前10 bp 處插入了1 個A 堿基.

圖3 編輯突變體的測序分析Fig.3 Sequencing analysis of editing mutants

2.3 突變植株的氨基酸類型分析

OsMT1 基因編碼序列總長為1 143 bp，共編碼380 個氨基酸. 利用DANMAN 軟件對3 種純合編輯類型的突變體植株進行氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，突變體都發(fā)生了移碼突變，產(chǎn)生了提前終止的密碼子，形成了截短的蛋白，如圖4 所示.由圖4 可以看出，由于osmt1-1 突變體在2 個靶點處各插入了1 個A 堿基，導致移碼突變，從第41 個氨基酸開始表現(xiàn)出與野生型的差異，并且在第174 個氨基酸處產(chǎn)生終止密碼子. osmt1-3 突變體在第1 個靶點處缺失了9 個堿基，導致在第38 個氨基酸后缺失了3 個氨基酸，未發(fā)生移碼，但由于在第2 個靶點處插入了1 個A 堿基，導致后面的氨基酸發(fā)生移碼，在第158 個氨基酸處產(chǎn)生終止密碼子. osmt1-4 突變體在第1 個靶點處插入了1 個A 堿基，并且在第2 個靶點處缺失了3個堿基，所以在第40 個氨基酸后所翻譯出的氨基酸序列與野生型不同，發(fā)生了移碼突變，并在第170 個氨基酸處產(chǎn)生終止密碼子. 這些編輯類型使OsMT1 基因成功發(fā)生了突變，產(chǎn)生截短產(chǎn)物.后續(xù)將利用這些純合編輯的突變體對OsMT1 基因的功能進行分析.

圖4 3 個純合編輯突變體的氨基酸序列分析Fig.4 Analysis of amino acid sequences in three homozygous mutants

2.4 敲除OsMT1 基因降低水稻對鹽脅迫的敏感性

SABATH 家族參與了植物的多個脅迫響應過程.為了研究OsMT1 的功能，對OsMT1 突變體和野生型中花11 進行了鹽脅迫處理實驗，結果如圖5 所示.

圖5 不同濃度鹽處理下野生型和突變型的表型Fig.5 Phenotypic analysis of wild type and mutant in different concentrations of salt

由圖5 可知，當沒有施加鹽脅迫時，突變體的生長狀態(tài)和野生型的沒有明顯差異. 在外源施加不同濃度的NaCl 后，與野生型相比，OsMT1 突變體對鹽脅迫的敏感性降低. 當NaCl 濃度為50 mmol/L 和100 mmol/L 時，突變體和野生型的生長均受到抑制，表現(xiàn)為苗長和根長縮短，但野生型受到抑制的程度更大，根長及苗長都明顯小于突變型的數(shù)值.當NaCl 濃度增加到150 mmol/L 時，野生型的根基本不能伸長，其生長點壞死，而突變體還可以伸長生長. 這些結果表明，OsMT1 突變降低了水稻對鹽脅迫的敏感性，增強了植株對鹽脅迫的抗性.

3 討論與結論

本研究利用CRISPR-Cas9 基因編輯技術對水稻SABATH 家族成員OsMT1 進行定點編輯，得到了5 種類型的編輯突變體，其中3 種為純合突變體，均由于堿基的插入或缺失造成移碼突變，最終使翻譯提前終止. 對獲得的OsMT1 基因的純合突變體進行不同濃度鹽脅迫處理，發(fā)現(xiàn)在50、100和150 mmol/L 的鹽濃度下，突變體的根長和苗長均明顯長于野生型的長度，即OsMT1 基因突變降低了水稻對鹽脅迫的敏感性，表明OsMT1 基因在水稻對抗鹽脅迫中發(fā)揮了重要作用. 這一生物學功能可能與其生化功能相適應，因為植物SABATH 甲基轉移酶家族是一類以植物激素為底物發(fā)生甲基化反應的基因家族，它可以使植物激素如JA、SA 及GA 等甲基化產(chǎn)生MeJA、MeSA、MeGA，這些甲基化的產(chǎn)物有助于植物對抗非生物脅迫[12-13].另外，植物SABATH 甲基轉移酶家族成員在植物對抗生物脅迫中也發(fā)揮了一定的作用，已有研究表明該家族成員在植物花器官中參與了揮發(fā)性物質(zhì)的合成，從而對抗植物所遇到的生物脅迫. 如金魚草（Antirrhinum majus）中分離得到的苯甲酸羧甲基轉移酶（BAMT），可將SAM 的甲基轉移到苯甲酸（BA）的羧基上，得到揮發(fā)性的苯甲酸甲酯（MeBA），使金魚草具有特殊香味[4]；擬南芥中鑒定的AtBSMT 能同時催化MeSA 和MeBA 的合成，產(chǎn)生具有揮發(fā)性氣味的物質(zhì)，在植物對病蟲的防御中發(fā)揮了重要作用[14]；SA 和MeSA 作為一種信號分子，也可能參與了局部和系統(tǒng)性的防御，在植物未受到感染的部位觸發(fā)防御反應[15].本研究創(chuàng)建的水稻SABATH 家族成員OsMT1 基因的突變體材料為詳細揭示該基因的功能奠定了實驗基礎，后續(xù)將進一步探究該基因在生物脅迫及非生物脅迫中的調(diào)控通路.