慢病毒介導(dǎo)KIF4A 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降MCF7 細(xì)胞株的建立

閆魯霞，程蓓蓓，周之春，朱長軍

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué)分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

KIF4A 是驅(qū)動(dòng)蛋白Kinesin-4 家族成員之一，是一類可以利用自身馬達(dá)結(jié)構(gòu)域水解ATP 獲取能量，并沿著微管向微管正極末端方向移動(dòng)的蛋白分子[1].KIF4A是一類高度保守的蛋白，基因定位于人類染色體Xq13.1，cDNA 共3 699 bp，編碼1 232 個(gè)氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量約為140×103[2].KIF4A 作為驅(qū)動(dòng)蛋白，可在細(xì)胞周期中穩(wěn)定表達(dá)，參與許多重要的生命活動(dòng)，在有絲分裂中發(fā)揮著必不可少的作用[3].慢病毒載體（lentiviralvector，LV）是以人類免疫缺陷型病毒（HIV）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體[4]，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒，它可將自身的病毒RNA 逆轉(zhuǎn)錄為DNA 并與宿主細(xì)胞染色體整合，具有感染效率高、轉(zhuǎn)移基因片段容量大、低免疫原性和低細(xì)胞毒性等優(yōu)點(diǎn)，是攜帶目的基因的理想載體[5-6].四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)（包括Teton 系統(tǒng)和Tet-off 系統(tǒng)）是迄今為止在體內(nèi)和體外應(yīng)用最為成功和廣泛的調(diào)控系統(tǒng)之一[7]，該系統(tǒng)利用大腸桿菌Tn10 轉(zhuǎn)座子中四環(huán)素阻遏操縱子的調(diào)控元件在真核細(xì)胞中定量并特異地控制外源基因的表達(dá).

本研究利用慢病毒表達(dá)載體，應(yīng)用Tet 系統(tǒng)誘導(dǎo)KIF4A shRNA 的表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)KIF4A 蛋白表達(dá)，成功構(gòu)建了KIF4A 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降的細(xì)胞株Tet-shKIF4A/MCF7，為研究KIF4A 在有絲分裂進(jìn)程中的作用提供了重要的研究材料.

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒和細(xì)胞

psPAX2 和pMD2.G 質(zhì)粒、293T 細(xì)胞和MCF7 細(xì)胞，均由本實(shí)驗(yàn)室保存；pTet-plko-puro-NC 質(zhì)粒、pTetplko-puro-shKIF4A 質(zhì)粒，由旭和（天津）醫(yī)藥科技有限公司合成.

1.2 主要試劑

Polyfectamine 轉(zhuǎn)染試劑、Superfectin 轉(zhuǎn)染試劑，日本Takara 公司；四環(huán)素、嘌呤霉素、山羊血清，北京索萊寶科技有限公司；HRP 標(biāo)記的Goat anti rabbit 和Goat anti mouse，武漢博士德生物工程有限公司；Opti-MEM培養(yǎng)基，美國Gibico 公司；抗熒光淬滅劑，美國Thermo Fisher 公司；Mouse anti KIF4A 抗體，美國Santa Cruz公司；Mouse anti Tubulin 抗體、Rat anti Tubulin 抗體，美國Sigma 公司；Goat anti Mouse488、Goat anti Rabbit546、Goat anti Rat568 抗體，美國Invitrongen 公司；KIF4A 抗體血清，由本實(shí)驗(yàn)室制備.

1.3 方法

1.3.1 嘌呤霉素工作濃度的確定

接種3×105個(gè)MCF7 細(xì)胞于6 孔板中，細(xì)胞密度達(dá)到90%時(shí)，分別添加嘌呤霉素質(zhì)量濃度為0、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 μg/mL 的細(xì)胞培養(yǎng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每天更換1 次培養(yǎng)液.觀察細(xì)胞存活狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在嘌呤霉素質(zhì)量濃度為0、0.50、0.75 μg/mL 的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3 d 后少量細(xì)胞死亡，培養(yǎng)5 d 后部分細(xì)胞存活；嘌呤霉素質(zhì)量濃度為1.00、1.25、1.50 μg/mL的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)3 d 后細(xì)胞大量死亡，培養(yǎng)5 d 后細(xì)胞全部死亡.因此確定1.00 μg/mL 為嘌呤霉素的最佳篩選濃度，后續(xù)研究選擇該質(zhì)量濃度的嘌呤霉素進(jìn)行抗藥篩選.

1.3.2 不同轉(zhuǎn)染方式轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞制備慢病毒

將293T 細(xì)胞接種至6 cm 培養(yǎng)皿，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱條件下進(jìn)行培養(yǎng)，分別使用碳酸鈣轉(zhuǎn)染試劑、Superfect 轉(zhuǎn)染試劑、Polyfectamine 轉(zhuǎn)染試劑，將pTetplko-puro-shKIF4A 重組質(zhì)粒、psPAX2 和pMD2.G 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染12、15、24 h 后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集富含慢病毒的培養(yǎng)液.向收集到的慢病毒培養(yǎng)液中按一定比例加入含100 μg/mL四環(huán)素的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)感染293T 細(xì)胞，48 h 后收集慢病毒感染的細(xì)胞進(jìn)行檢測，驗(yàn)證KIF4A 蛋白表達(dá)的敲降.

1.3.3 慢病毒感染及穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降Tet-shKIF4A 細(xì)胞株的篩選

MCF7 細(xì)胞密度達(dá)到80%左右時(shí)，用收集的含TetshKIF4A 慢病毒液和對照慢病毒液感染細(xì)胞48 h，未感染病毒的細(xì)胞作為空白對照.感染細(xì)胞48 h 后加入嘌呤霉素質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL 的新鮮培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每隔1 d 更換含嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基，連續(xù)篩選3 代，得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株.

1.3.4 四環(huán)素誘導(dǎo)加藥處理

接種3×105個(gè)穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降Tet-shKIF4A 細(xì)胞株于6 孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞約16h 后，分別按照0、50、75、100、150、200 μg/mL 的質(zhì)量濃度梯度加入四環(huán)素，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞.最終采用四環(huán)素質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的培養(yǎng)基，分別在12、24、36、48、60 h 時(shí)收集細(xì)胞.

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡雜交

加入適量含有溴酚藍(lán)的蛋白上樣緩沖液收集細(xì)胞，經(jīng)SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，通過半干型轉(zhuǎn)印電泳槽將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，脫脂奶粉封閉過夜.一抗室溫孵育2 h（Rabbit anti KIF4A 與Mouse anti Tubulin 的體積比為1∶1 000），TBST 洗3 次；二抗室溫孵育1 h（Goat anti rabbit 和Goat anti mouse 的體積比為1∶10 000），加入ECL 和過氧化氫后曝光.成像后用ImageJ 軟件分析各蛋白條帶的灰度值，用KIF4A 和Tubulin 條帶灰度值的比值大小表示細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)相對水平.

1.3.6 細(xì)胞免疫熒光染色

在免疫熒光染色35 mm2平皿中分別接種2×105個(gè)對照組細(xì)胞和誘導(dǎo)敲降KIF4A 細(xì)胞，培養(yǎng)12 h 后，用四環(huán)素質(zhì)量濃度為50 μg/mL 的培養(yǎng)基培養(yǎng)36 h，取出細(xì)胞爬片，PBS 洗3 次，用固定液固定5 min.再次用PBS 清洗3 次，在PBS 中4 ℃條件下浸泡過夜.用山羊血清配成的封閉液封閉50 min，用PBST 稀釋的Mouse anti KIF4A 抗體（體積比為1∶100）過夜孵育，用PBST 稀釋的二抗Goat anti Mouse488（體積比為1∶200）室溫孵育1 h，用小鼠血清配成的封閉液進(jìn)行二次封閉. 按照1∶200 的體積比稀釋二抗Goat anti Rat 568，室溫孵育1 h.PBST 洗3 次后加入抗熒光淬滅劑，指甲油封片，置于熒光顯微鏡下觀察.

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）.統(tǒng)計(jì)圖使用Graphpad Prism 9 繪制.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞制備慢病毒

分別使用碳酸鈣、Polyfectamine、Superfect 試劑盒共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pTet-plko-puro-shKIF4A、psPAX2 和pMD2.G 至293T 細(xì)胞，于不同時(shí)間點(diǎn)收集慢病毒液，用收集的慢病毒液感染293T 細(xì)胞，四環(huán)素質(zhì)量濃度為100 μg/mL 的條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集病毒液，加入適量含有溴酚藍(lán)的蛋白上樣緩沖液收集細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行KIF4A 蛋白檢測，結(jié)果如圖1 所示.由圖1 可以看出，Polyfectamine 轉(zhuǎn)染24 h 所得的慢病毒效果較好，且Polyfectamine 轉(zhuǎn)染試劑經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，因此后續(xù)使用Polyfectamine 共轉(zhuǎn)染Tet-plko-puro、psPAX2 和pMD2.G 至293T 細(xì)胞，24 h 后收集對照組慢病毒液.

圖1 不同轉(zhuǎn)染條件的比較Fig.1 Comparison of different transfection conditions

2.2 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降Tet-shKIF4A 的細(xì)胞株構(gòu)建以及篩選

分別用Tet-shKIF4A 慢病毒和對照慢病毒感染MCF7 細(xì)胞48 h 后，使用嘌呤霉素質(zhì)量濃度為1 μg/mL的培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行篩選，嘌呤霉素篩選3 代后細(xì)胞幾乎無死亡現(xiàn)象，表明存活的細(xì)胞含有嘌呤霉素抗性.通過3 輪有限稀釋法純化，將穩(wěn)定表達(dá)的單細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，結(jié)果如圖2 所示.由圖2 可以看出，與對照細(xì)胞相比，穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降KIF4A 細(xì)胞株的狀態(tài)沒有明顯的不良改變，因此確認(rèn)成功構(gòu)建了Tet-plko-puroshKIF4A 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降的MCF7 細(xì)胞株.

圖2 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降KIF4A 細(xì)胞株與對照細(xì)胞的比較Fig.2 Comparison between stable inducile knockdown KIF4A cells and control cells

2.3 誘導(dǎo)敲降KIF4A 的四環(huán)素藥物質(zhì)量濃度的優(yōu)化

分別用質(zhì)量濃度為50、75、100、150、200 μg/mL 的四環(huán)素處理Tet-shKIF4A 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降細(xì)胞株，檢測KIF4A 蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖3 所示.由圖3 可以看出，不同質(zhì)量濃度的四環(huán)素對Tet-shKIF4A 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降細(xì)胞株均呈現(xiàn)出一定的敲降效果.用Image J進(jìn)行定量分析的結(jié)果表明，同對照組細(xì)胞相比，四環(huán)素質(zhì)量濃度為50 μg/mL 和75 μg/mL 時(shí)，KIF4A 的蛋白表達(dá)下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；四環(huán)素質(zhì)量濃度為100、150、200 μg/mL 時(shí)，KIF4A 的蛋白表達(dá)下調(diào)，差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）.在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為100、150、200 μg/mL的四環(huán)素對細(xì)胞毒性較大，細(xì)胞狀態(tài)不佳，而50 μg/mL的四環(huán)素既能達(dá)到較好的敲降效果，同時(shí)細(xì)胞狀態(tài)較好，因此確定50 μg/mL 為四環(huán)素誘導(dǎo)敲降KIF4A 的最佳質(zhì)量濃度.

圖3 不同質(zhì)量濃度的四環(huán)素誘導(dǎo)敲降KIF4A 的效果Fig.3 Effect of tetracycline with different mass concentration on inducible-knockdown of KIF4A

2.4 誘導(dǎo)敲降KIF4A 時(shí)間的優(yōu)化

用50 μg/mL 的四環(huán)素加藥處理Tet-shKIF4A 細(xì)胞株，處理時(shí)間分別為12、24、36、48、60 h，通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行KIF4A 蛋白檢測，結(jié)果如圖4 所示.由圖4 可以看出，與未加四環(huán)素的對照組細(xì)胞相比，四環(huán)素穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降細(xì)胞株條帶的亮度明顯減弱，且隨著處理時(shí)間的延長，亮度逐漸減弱，KIF4A 與Tubulin灰度值的比值在36 h 時(shí)出現(xiàn)急劇下降，因此確定最優(yōu)的誘導(dǎo)敲降時(shí)間為36 h，此時(shí)效果較好.

圖4 不同時(shí)間四環(huán)素誘導(dǎo)敲降KIF4A 的效果Fig.4 Effect of tetracycline inducible knockdown of KIF4A at different time

2.5 免疫熒光染色

對KIF4A 穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降細(xì)胞株和對照組細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果如圖5 所示.同對照組細(xì)胞相比，穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降細(xì)胞株中KIF4A 特異性染色減少，細(xì)胞在有絲分裂早期染色體凝集程度降低，染色體整列出現(xiàn)障礙，后期紡錘體中央?yún)^(qū)變得松散，紡錘體拉長.因此確認(rèn)穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降細(xì)胞株中KIF4A 出現(xiàn)明顯的敲降效果.

圖5 Tet-shKIF4A/MCF7 細(xì)胞和對照組細(xì)胞免疫熒光染色Fig.5 Immunofluorescence staining of Tet-shKIF4A/MCF7 cells and control cells

3 討論與結(jié)論

染色體驅(qū)動(dòng)蛋白KIF4A 是一類高度保守的蛋白，在調(diào)控染色體凝集和分離機(jī)制、有絲分裂后期微管動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性和紡錘體的長度等方面扮演十分重要的角色，是一個(gè)重要的細(xì)胞周期調(diào)控蛋白[8-9].KIF4A 的缺失會(huì)導(dǎo)致染色體凝集程度降低，影響姐妹染色單體的分離，引起基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)致非整倍體基因組的產(chǎn)生，最終使細(xì)胞走向死亡[10].因此穩(wěn)定敲除KIF4A的細(xì)胞株幾乎無法構(gòu)建.利用Tet 誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)對KIF4A 的表達(dá)進(jìn)行誘導(dǎo)調(diào)節(jié)[11]，將慢病毒載體作為RNAi技術(shù)的載體，結(jié)合兩者的優(yōu)勢，能夠?qū)崿F(xiàn)對目的基因KIF4A 的高效特異性的抑制[12].

基因敲降慢病毒載體能產(chǎn)生表達(dá)shRNA 的高滴度病毒[13]，誘導(dǎo)基因表達(dá)的穩(wěn)定功能沉默，是目前最適合體內(nèi)基因轉(zhuǎn)化甚至基因治療的載體工具之一[14-15].本研究應(yīng)用四環(huán)素誘導(dǎo)基因敲降慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞從而得到具有感染力的重組病毒液，以此病毒液感染宿主細(xì)胞進(jìn)而將目的基因整合到宿主細(xì)胞內(nèi)使其穩(wěn)定表達(dá)，相比傳統(tǒng)方式，更具有高效性和特異性.一方面，該載體具有Tet 誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，可通過添加合適濃度的四環(huán)素并控制四環(huán)素誘導(dǎo)敲降的時(shí)間，以達(dá)到精確調(diào)控KIF4A 表達(dá)的目的；另一方面，該載體系統(tǒng)含有嘌呤霉素抗性基因，可對穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降細(xì)胞株進(jìn)行篩選.研究結(jié)果表明，應(yīng)用四環(huán)素誘導(dǎo)的基因敲降慢病毒系統(tǒng)，能夠成功構(gòu)建KIF4A 基因穩(wěn)定誘導(dǎo)敲降乳腺癌細(xì)胞株Tet-shKIF4A/MCF7，誘導(dǎo)敲降KIF4A 的四環(huán)素藥物最佳質(zhì)量濃度為50 μg/mL，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為36 h.通過細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，藥物誘導(dǎo)KIF4A 基因敲降后，有絲分裂細(xì)胞表現(xiàn)出染色體凝集、整列和后期紡錘體異常延長等典型KIF4A基因表達(dá)抑制的特征.本研究為深入探究KIF4A 在細(xì)胞生命活動(dòng)中的功能以及細(xì)胞周期的分子作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料.