滋陰溫陽序貫方對卵巢功能減退動物模型的調節(jié)作用

顧仁艷，何 麗，張秋梅，宋國宏，龐保珍

（1.新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011；2.聊城市中醫(yī)醫(yī)院，山東 聊城 252000）

卵巢功能減退（diminished ovarian reserve，DOR）是指卵巢產(chǎn)生卵子的功能降低，卵細胞質量下降的一類常見的女性內(nèi)分泌臨床疾病[1]。臨床表現(xiàn)程度不一，可表現(xiàn)為無癥狀，月經(jīng)不調，高流產(chǎn)率，不孕等[2-3]。隨著病情發(fā)展可進一步發(fā)展為卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）與 卵 巢 早 衰（premature ovarian failure，POF）[4]。近年來卵巢功能減退的發(fā)生率呈現(xiàn)上升趨勢和年輕化[5]。卵巢功能減退的影響因素復雜，發(fā)病機制尚不清楚?；蜃兓⒚庖吡档?、外部損傷、傷口感染、放化療、心理因素、生活習慣等都可導致其發(fā)生發(fā)展[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學對于卵巢功能減退的治療手段缺乏，主要以心理輔導，生活方式改變和脫氫表雄酮、輔酶Q10、褪黑素等藥物使用為主[7]，僅能改善部分臨床癥狀，治療效果不佳，不良反應較大。中醫(yī)改善卵巢功能減退療效肯定且無明顯不良反應[8-10]。根據(jù)中醫(yī)學理論，可將“卵巢功能減退”歸類為“不孕”“月經(jīng)后期”“月經(jīng)過少”等范疇，主要病機為腎虛，多以補腎活血為主。本次研究所用滋陰溫陽序貫方在臨床治療中可顯著改善患者臨床癥狀，但其作用機制尚不清楚。本次課題擬通過研究滋陰溫陽序貫方治療卵巢功能減退模型大鼠，從動物水平探討滋陰溫陽序貫方在卵巢功能減退疾病中的調節(jié)作用，為研究滋陰溫陽序貫方的作用機制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 8～12 周齡SPF 級 SD 健康雌性大鼠，體質量（180±20）g，購自湖北省實驗動物研究中心（許可證號：SCXK-2020-0018），動物質量合格證編號：42000600041829，新疆醫(yī)科大學動物實驗管理中心倫理委員會倫理審批號：IACUC202101113-01。普通級別安靜環(huán)境中單籠飼養(yǎng)，相對濕度40%～70%，人工晝夜節(jié)律（白天夜晚各12 h），恒溫（20±2）℃，自由飲水，自由攝食條件下適應性喂養(yǎng)1 周。TIANScript反轉錄試劑盒、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）實時熒光定量PCR 試劑購自北京天根生化科技有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠抗繆勒管激素（AMH）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、大鼠雌二醇（E2）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、大鼠促卵泡激素（FSH）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒、大鼠促黃體生成激素（LH）酶聯(lián)免疫吸附檢測試劑盒購自武漢elabscience 公司；IGF1 Antibody、SCF Polyclonal Antibody 購自美國Abcam 公司；微量移液器，酶標儀，thermo 購自美國；倒置顯微鏡，OLYMPUS購自美國；低速離心機，Eppendorf 購自美國；電子天平，賽多利斯購自中國；病理切片機，Leica RM 購自德國；組織攤烤片機、包埋機均購自武漢。滋陰溫陽序貫方藥滋陰方：熟地黃10 g，山藥10 g，山茱萸10 g，女貞子10 g，旱蓮草10 g，當歸10 g，白芍10 g，麥冬10 g，沙參10 g，百合10 g。溫陽方：淫羊藿10 g，仙茅10 g，巴戟天10 g，山藥10 g，山茱萸10 g，菟絲子10 g，杜仲10 g，鹿角霜10 g，醋香附10 g，郁金10 g。上述中藥材，均購于新疆醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院免煎中藥房制備的配方顆粒，廠家：三九醫(yī)藥股份有限公司。臨用前使用雙蒸水配成混懸液備用。滋陰方濃縮顆粒日用藥量為17.651 g，相當于原生藥100 g。溫陽方濃縮顆粒日用藥量為11.151 g，相當于原生藥100 g。參考《中藥藥理研究方法學》中劑量換算方法“體表面積比”換算動物臨床等效劑量，根據(jù)公式所得大鼠給藥劑量，并以此設置為滋陰溫陽序貫方藥中藥組，以10 mL/kg 灌胃。戊酸雌二醇片（補佳樂）：每片1 mg，由拜耳醫(yī)藥廣州分公司提供，國藥準字號 J20150009。參考《中藥藥理研究方法學》中劑量換算方法“體表面積比”換算動物臨床等效劑量，大鼠用量為0.09 mg/kg。

1.2 實驗方法 適應性喂養(yǎng)7 d 后，每日11:00 起對大鼠進行陰道脫落細胞學檢測，連續(xù)10 d，光鏡下觀察，篩選出有規(guī)律動情周期為4～5 d 的健康雌性大鼠納入正式實驗。按照隨機數(shù)表法將大鼠隨機分為正常對照組、模型組、滋陰溫陽序貫方藥組（中藥）和戊酸雌二醇片組（西藥），共4 組，每組8 只。正常對照組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，予0.9% 氯化鈉溶液2 mL，每日灌胃1 次，連續(xù)14 d。除正常對照組大鼠外均予雷公藤多甙片75 mg/kg 混懸液2 mL，每日灌胃1 次，連續(xù)14 d，建立卵巢功能減退動物模型[11]。各組均于造模后灌胃給藥，正常對照組、模型組10 mL/kg灌胃0.9%NaCl；中藥組均以10 mL/kg 灌胃給予滋陰溫陽序貫方藥，根據(jù)大鼠動情周期檔案，按大鼠動情間期—動情前期—動情期—動情后期順序，模擬人的月經(jīng)周期循環(huán)用藥，以動情期為界限，滋陰溫陽序貫方藥在動情前期先給予滋陰方灌胃，每日灌胃1 次，然后在動情后期序貫給予溫陽方灌胃；西藥組給予戊酸雌二醇片按0.09 mg/kg 灌胃給藥。各組均每天灌胃給藥1次，連續(xù)2 周。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 一般情況觀察 開始給藥后，分別在第1 天、第7 天、第14 天觀察大鼠體質量，第14 天計算卵巢質量和卵巢系數(shù)。

1.3.2 病理檢測 用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定卵巢組織標本，進而石蠟包埋、切片，經(jīng)蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining,HE），染色后在光鏡下觀察組織病理變化。

1.3.3 ELISA 法檢測AMH、FSH、LH、E2的表達變化 實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。加樣：分別設正常對照孔、標準孔、待測樣品孔。正常對照孔加樣品稀釋液100 μL，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL。給酶標板覆膜，37 ℃孵育90 min。棄去液體，洗板5 次，每孔加生物素化抗體工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育60 min。棄去液體，洗板5 次，每孔加酶結合物工作液100 μL，加上覆膜，37 ℃溫育30 min，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次。每孔加顯色劑（TMB）100 μL，酶標板加上覆膜37 ℃避光孵育15 min。每孔加終止液100 μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。立即用酶標儀在450 nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。

1.3.4 免疫組織化學法檢測IGF-1 和SCF 的表達變化 切片常規(guī)脫蠟水化，加3% H2O2室溫處理10 min，在枸櫞酸鹽緩沖液（pH=6.0）中微波加熱10 min（92～98 ℃）進行抗原修復，冷卻后5%小牛血清室溫處理10 min，分別滴加1:100 稀釋的IGF-1 和SCF一抗抗體，4 ℃孵育過夜，再分別滴加1:200 稀釋的二抗，室溫處理30 min，再加SP（1:100）工作液室溫處理30 min，DAB 顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片后光鏡下觀察并攝片。

1.3.5 Western blot 法檢測不同分組中蛋白表達情況 將少量組織塊置于1～2 mL 勻漿器中球狀部位，加400 μL 裂解液（含PMSF）于勻漿器中進行勻漿，重復碾幾次使組織盡量碾碎，裂解30 min 后，在4 ℃，12 000 r/min 離心5 min，取適當稀釋的上清液用BCA 法來測定蛋白濃度，調整蛋白質濃度后采用免疫印跡法（Western blot）檢測組織內(nèi)IGF-1 和SCF 的表達，其步驟大致如下：經(jīng)過灌膠、加樣、電泳、轉膜后，將膜裝入 5% BSA 封閉液，制置室溫搖床 1 h，加5 mL 一抗稀釋液（1:1 000）于4 ℃冰箱過夜。然后加10 mL 二抗稀釋液（1:50 000）置于搖床上2 h，顯色，在暗室中壓片曝光顯影，結果用 Quantity-one 圖像軟件分析并進行光密度值掃描，分別計算目的蛋白條帶與GAPDH 強度比值（%）。

1.4 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 25.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（）表示，對計量資料進行單因素方差分析，采用LDS 法進行兩兩比較。

2 實驗結果

2.1 一般情況 本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠體質量在給藥第1天、第7 天、第14 天時間點上西藥組和中藥組間差異無統(tǒng)計學意義，但均較對照組顯著降低（P＜0.05），見表1。第14 天取卵巢組織，大鼠卵巢質量和卵巢系數(shù)變化比較，見表2。

表1 大鼠體質量變化（，n =8） g

表1 大鼠體質量變化（，n =8） g

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

表2 大鼠卵巢質量及卵巢系數(shù)變化（，n =8）

表2 大鼠卵巢質量及卵巢系數(shù)變化（，n =8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.2 病理變化 本次研究通過HE 檢測不同分組中卵巢組織中卵泡、黃體、顆粒細胞的病理變化情況。實驗結果顯示，對照組小鼠各級卵泡數(shù)量較多，竇卵泡形態(tài)飽滿，顆粒細胞完整。與對照組比較，模型組小鼠各級卵泡數(shù)量減少，顆粒細胞完整度破壞。與模型組比較，西藥組和中藥組小鼠卵巢內(nèi)可見新生卵泡，顆粒細胞層數(shù)增加，見圖1。

圖1 不同分組大鼠卵巢組織病理變化

2.3 滋陰溫陽序貫方調節(jié)E2、AMH、FSH 和LH 的表達水平 實驗結果顯示，在西藥和中藥干預后，E2與AMH的濃度含量較模型組顯著升高（P＜0.05）。FSH和LH的濃度含量較模型組顯著降低（P＜0.05）。見表3。該數(shù)據(jù)表明，中藥和西藥可以參與調控E2、AMH、FSH 和LH 的表達在卵巢退變過程中發(fā)揮作用。

表3 藥物調節(jié) E2、AMH、FSH 和 LH 的表達水平（，n =8）

表3 藥物調節(jié) E2、AMH、FSH 和 LH 的表達水平（，n =8）

注：與對照組比較，# P ＜0.05；與模型組比較，△P ＜0.05

2.4 免疫組織化學檢測IGF-1 和SCF 的表達變化 實驗數(shù)據(jù)顯示，西藥和中藥干預后，IGF-1 表達量顯著高于模型組（P＜0.05），見圖2；IGF-1 免疫組織化學原始圖，見圖3。SCF 表達量顯著低于模型組（P＜0.05），見圖4。SCF 免疫組織化學原始圖，見圖5。該數(shù)據(jù)表明，中藥和西藥可以通過調控大鼠卵巢中IGF-1 和SCF 表達在疾病中發(fā)揮作用。

圖2 免疫組織化學法檢測各組大鼠卵巢組織中IGF-1 蛋白表達情況比較

圖3 IGF-1 免疫組織化學原始圖

圖4 免疫組織化學法檢測各組大鼠卵巢組織中SCF 蛋白表達情況比較

圖5 SCF 免疫組織化原始圖

2.5 Western blot 檢測IGF-1 和SCF 的表達變化 實驗結果顯示，不同分組中IGF-1 在西藥和中藥干預后，IGF-1 蛋白表達量顯著高于模型組（P＜0.05），見圖6。SCF 蛋白表達量顯著低于模型組（P＜0.05），見圖7。該數(shù)據(jù)表明，中藥和西藥可以通過調控大鼠卵巢中IGF-1 和SCF 表達在疾病中發(fā)揮作用。

圖6 Western blot 檢測各組大鼠卵巢組織中IGF-1 表達變化的比較

圖7 Western blot 檢測各組大鼠卵巢組織中SCF 表達變化的比較

3 討論

卵巢功能減退主要表現(xiàn)為卵子數(shù)量和質量降低，卵巢功能減退[12]。相關研究表明，卵巢功能減退的發(fā)生伴隨著激素異常分泌，主要以E2和AMH 的分泌水平降低，F(xiàn)SH 和LH 的分泌水平升高。這些激素的分泌水平可以有效地反映卵巢功能是否正常[13]。本次實驗采用雷公藤多甙片造模，可以通過抑制卵泡顆粒細胞的活性來促使卵巢功能減退的發(fā)生。與對照組比較，模型組中E2、AMH 降低，F(xiàn)SH 和LH 升高，卵巢指數(shù)降低，卵泡細胞數(shù)量減少，顆粒細胞完整性破壞都證明了卵巢功能減退模型成功，與相關文獻報道一致[11,14-15]。

關于卵巢功能減退的治療一直是臨床的熱點和難點，現(xiàn)代醫(yī)學尚無有效的提高卵巢功能的治療手段，而中醫(yī)的治療效果斐然，相關研究報道表明可以提高卵子的數(shù)量和質量，改善卵巢功能減退的卵巢功能，但其作用機制尚不清楚[4,16]。中醫(yī)學認為腎虛血瘀是導致卵巢功能減退發(fā)生發(fā)展的最主要原因。因此，將補腎活血作為卵巢功能減退的主要治療手段[17]。萬凌屹等[18]研究表明補腎活血可以改善卵巢的血液循環(huán)、提高卵巢功能，從而改善卵巢功能減退的臨床癥狀。本次研究采用的滋陰溫陽序貫方以補腎活血為主，通過對模型鼠的干預治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠激素水平得到明顯改善，E2、AMH 升高，F(xiàn)SH 和LH 降低，卵巢指數(shù)升高，卵泡細胞數(shù)量增加，顆粒細胞層數(shù)較豐富，且與戊酸雌二醇片的治療效果相當，表明了滋陰溫陽序貫方能夠有效增加卵泡數(shù)量和質量，改善激素分泌和卵巢功能。

SCF 是一類由卵巢分泌的細胞因子，對卵巢的發(fā)育發(fā)揮調控作用[19]。SCF 表達水平的異常升高會刺激誘導顆粒細胞的增殖與分化，對卵泡的早期發(fā)育起到重要的調控作用[20]。有研究報道表明，SCF 的高表達促進顆粒細胞的調控作用，引發(fā)卵巢功能減退[19]。IGF-1 是一類干細胞分泌因子，在卵巢中起到促進卵泡生長的功能[21]。于佳等[22]研究表明，IGF-1 的高表達可以促進原始卵泡發(fā)育，從而改善卵巢功能。本次研究結果顯示，模型組的SCF 表達量升高，IGF-1 表達量降低，與上述報道一致。在滋陰溫陽序貫方干預治療后，SCF 的表達量降低，IGF-1 的表達量升高，且與戊酸雌二醇片的治療效果相當，表明了滋陰溫陽序貫方能夠有效調控卵巢分泌細胞因子的能力，改善卵巢功能。

本實驗所運用的“滋陰溫陽序貫方”是以國醫(yī)大師夏桂成教授的“調周法”[23]為理論指導，根據(jù)月經(jīng)周期不同階段的陰陽消長轉化和氣血盈虧變化規(guī)律，把握現(xiàn)代助孕手段的中醫(yī)藥治療靶點及時機的不同，同時結合新疆“燥邪”偏盛地域特點創(chuàng)新提出的，以中醫(yī)“金水相生”“肝腎同源”的基礎理論為指導，簡化用藥方案，肺、肝、腎三臟同治。本研究結果表明，滋陰溫陽序貫方可以通過增加卵巢系數(shù)、卵泡數(shù)量和質量，改善激素分泌和細胞因子表達，進而改善卵巢功能。