胰淀素通過完整神經(jīng)支配上調(diào)CART和nNOS神經(jīng)元表達(dá)

劉昊東，李曉靜，潘 登，茍 格，李鵬輝，王 英，李海軍，郭永清，王 昆，杜晨光,*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝保護(hù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；4.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭 014109；5.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北 石家莊 050035)

胰淀粉樣蛋白沉積物中分離而來的胰淀素(Amylin)，是由37個(gè)氨基酸組成的肽類激素[1]。Amylin通過抑食、延緩胃排空速率、抑制胃酸、減少胰高血糖素分泌的方式調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝。其受體廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)延髓最后區(qū)(area postrema,AP)、孤束核(nucleus of the solitary tract,NTS)和背外側(cè)背蓋核(lateral dorsal tegmental nucleus,LDT)[2]。

可卡因苯丙胺調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄肽(cocaine-and amphetamine-regulated transcript,CART)是高表達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄物之一，可調(diào)節(jié)攝食、能量、溫度等生理指標(biāo)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，靜脈注射CART能減少食物攝入，減輕體質(zhì)量[5]，借助金硫代葡萄糖(goldthioglucose,GTG)破壞下丘腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus,VMH)葡萄糖相關(guān)神經(jīng)元后，小鼠表現(xiàn)食欲亢進(jìn)、肥胖和CART免疫反應(yīng)性降低[6]。CART敲除鼠也表現(xiàn)為采食量、體質(zhì)量顯著增加[7-8]，說明CART與機(jī)體能量代謝穩(wěn)態(tài)關(guān)系密切。

神經(jīng)型一氧化氮合成酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS)在能量調(diào)控相關(guān)神經(jīng)元的信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用[9]，食物剝奪可降低nNOS神經(jīng)元mRNA水平[10]，nNOS分泌的一氧化氮(NO)也可調(diào)節(jié)其他神經(jīng)遞質(zhì)釋放[11]，說明腦內(nèi)nNOS表達(dá)與能量調(diào)控存在功能相關(guān)性。

產(chǎn)熱是能量調(diào)控的重要方式，通過化學(xué)去背肩胛棕色脂肪組織(interscapular brown adipose tissue,IBAT)交感神經(jīng)系統(tǒng)(sympathetic nervous system,SNS)支配，可顯著影響動(dòng)物采食和體質(zhì)量[12]。此外，SNS也與Amylin抑食和調(diào)節(jié)IBAT產(chǎn)熱關(guān)系密切，但CART、nNOS神經(jīng)元信號(hào)是否也參與其中，尚不明確。有鑒于此，本研究擬確定能量相關(guān)神經(jīng)核團(tuán)中CART與nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元分布情況，再探究CART、nNOS與Amylin介導(dǎo)能量調(diào)控的相關(guān)性，進(jìn)而明晰能量調(diào)控是否依賴完整的IBAT產(chǎn)熱交感神經(jīng)系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)C57BL/6J 野生雄性小鼠21只(WT,8～9周齡)購(gòu)自北京維通利華公司。3只用于免疫熒光檢測(cè)CART、nNOS神經(jīng)元信號(hào)表達(dá)，18只小鼠分為野生型(WT)、假手術(shù)(Sham)、去神經(jīng)支配(Denervation)3組，每組6只。腹腔注射Amylin(Phoenix,017-11,50 ng/g)或等量生理鹽水(Saline)2 h后，免疫熒光檢測(cè)Amylin對(duì)腦內(nèi)特定核團(tuán)CART和nNOS神經(jīng)元表達(dá)水平的影響。

1.2 去IBAT交感神經(jīng)支配術(shù)如先前研究所述[13]進(jìn)行IBAT去交感神經(jīng)支配，即異氟烷麻醉后鈍性分離背肩胛脂肪墊，暴露并切斷IBAT交感神經(jīng)纖維(5根)，假手術(shù)組僅暴露和輕微觸碰，術(shù)后動(dòng)物單獨(dú)飼養(yǎng)，恢復(fù)5～7 d。

1.3 免疫熒光試驗(yàn)腹腔注射Amylin或生理鹽水(Saline)后，蠕動(dòng)泵心肺灌注取材。灌注Saline 2 min 后，轉(zhuǎn)為4%多聚甲醛(pH=7.4,Sigma-Aldrich,158127)繼續(xù)灌注20 min取全腦。4%多聚甲醛4℃后固定6 h，30%蔗糖脫水。冰凍切片機(jī)(Slee MNT,Mainz,Germany)將目標(biāo)區(qū)域切為若干張厚度30 μm 腦片，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌，4℃一抗孵育24 h；一抗為兔抗CART(1∶2 000,PHOENIX,H00362)和山羊抗nNOS(1∶1 000,Abcam,ab1376)。然后用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌腦片3次。二抗Alexa Fluor 647驢抗兔IgG(1∶1 000,Abcam,ab150075)和Alexa Fluor 555驢抗山羊IgG(1∶1 000,Abcam,ab150130)于25℃下孵育2 h。洗滌后，自然風(fēng)干。腦片在的舒適恒溫孵育儀4℃ 300 r/min(Eppendorf ThermoMixerTM C)孵育，以加強(qiáng)抗體效果[14]。同時(shí)以含0.4%TritonX-100(Sigma-Aldrich,T8787)的抗體稀釋液作為陰性對(duì)照。用4和10倍物鏡的激光共聚焦顯微鏡(Nikon,C2 Plus)對(duì)腦片進(jìn)行成像。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腦內(nèi)CART、nNOS神經(jīng)元分布CART的免疫陽(yáng)性信號(hào)已在ARC和PVN區(qū)域的絕大部分能量相關(guān)神經(jīng)元細(xì)胞中得到證實(shí)[15]。這與本試驗(yàn)觀察到的nNOS和CART免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的表達(dá)模式吻合。在LDT以及臂旁核(parabrachial nucleus,PBN)區(qū)域，同時(shí)觀察到了nNOS神經(jīng)元免疫陽(yáng)性信號(hào)的分布(圖1G～H)。值得注意的是，在前包欽格復(fù)合體(pre-botzinger complex,PrBO)區(qū)域中觀察到CART以及nNOS免疫陽(yáng)性信號(hào)的廣泛分布，但二者并不存在明顯共定位(圖1 J)。

CART與nNOS的陽(yáng)性共定位信號(hào)在下丘腦隔核(septohypothalamic nucleus,SHy)、杏仁核內(nèi)側(cè)(medial amygdaloid nucleus,anterior part,MeA)、下丘腦背內(nèi)側(cè)核(dorsomedial hypothalamic nucleus,DMH)、乳頭體前核(premammillary nucleus,PMV)、動(dòng)眼神經(jīng)副核(pre-edinger-westphal nucleus,PrEW)、中縫核(Raphe magnus nucleus,RMg)和巨細(xì)胞網(wǎng)狀核(gigantocellular reticular nucleus,Gi)中觀測(cè)到(圖1A,B,C,D,E,F,I)。矢狀面結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)DMH區(qū)域有CART、nNOS共表達(dá)信號(hào)，以及LDT區(qū)域有nNOS免疫陽(yáng)性神經(jīng)元(圖1K,L)。

A～L.不同核團(tuán)中 CART、nNOS 免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)(紅色.nNOS;綠色.CART;黃橙色.CART + nNOS);A,A1.Shy中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；B,B1.MeA中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；C,C1.DMH中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；D,D1.PMV中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；E,E1.PrEW中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；F,F1.RMg中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；G,G1.PBN中的 nNOS 神經(jīng)元；H,H1.LDT中的 nNOS 神經(jīng)元；I,I1.Gi中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；J,J1.PrBO中的 CART 神經(jīng)元；K,K1.矢狀面DMH中的 CART 和 nNOS 神經(jīng)元；L,L1.矢狀面LDT中 nNOS 神經(jīng)元。K,L.40 ×；A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K1,L1.100 ×；A1,B1,C1,D1,E1,F1,G1,H1,I1,J1.200×。比例尺:100 μm

2.2 Amylin激活下丘腦DMH區(qū)域CART、nNOS神經(jīng)元為觀察Amylin調(diào)控作用是否涉及下丘腦CART、nNOS神經(jīng)元激活，分析了外周注射Amylin后DMH區(qū)域CART和nNOS神經(jīng)元的表達(dá)數(shù)目。結(jié)果顯示，與Saline組相比腹腔注射Amylin(50 ng/g)顯著增加WT組與Sham組DMH區(qū)域CART(control:Saline對(duì)比Amylin,P=0.018 3;Sham:Saline 對(duì)比Amylin,P=0.021 1,圖2A～D,G)和nNOS(control:Saline對(duì)比Amylin,P=0.030 8;Sham:Saline對(duì)比Amylin,P=0.025 3,圖2A～D,H)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目。

去除IBAT交感神經(jīng)支配后，相比WT組和Sham組，Amylin對(duì)于下丘腦CART和nNOS表達(dá)數(shù)目的促進(jìn)作用被顯著逆轉(zhuǎn)(CART:Saline對(duì)比Amylin,P=0.989 5;nNOS:Saline對(duì)比Amylin,P>0.999 9,圖2E，F(xiàn),G,H)。

A～F.WT、Sham、Denervation 小鼠注射 Saline和 Amylin后在DMH中 CART 和 nNOS 的免疫陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá);G.Amylin(50 ng/g)對(duì)WT(P=0.018 3)，Sham(P=0.021 1)和denervation小鼠(P=0.989 5)CART表達(dá)的影響；H.Amylin對(duì)WT(P=0.030 8)、Sham(P=0.025 3)和Denervation小鼠(P>0.999 9)中nNOS表達(dá)的影響。A,B,C,D,E,F.40×；A1,B1,C1,D1,E1,F1.100×；A2,B2,C2,D2,E2,F2.200×。比例尺:100 μm

以上結(jié)果提示Amylin的能量調(diào)控作用可誘導(dǎo)下丘腦CART和nNOS神經(jīng)元表達(dá)數(shù)目顯著上升，這種誘導(dǎo)作用依賴于完整的IBAT交感神經(jīng)支配。

3 討論

Amylin可調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物采食和能量消耗，引發(fā)中樞能量調(diào)控進(jìn)程[16]。研究表明，Amylin對(duì)IBAT產(chǎn)熱具有顯著調(diào)控作用，LDT是Amylin信號(hào)傳導(dǎo)直接靶點(diǎn)[17]，提示LDT可發(fā)揮潛在的能量平衡作用。本研究發(fā)現(xiàn)DMH區(qū)域CART和nNOS神經(jīng)元參與了Amylin誘導(dǎo)的中樞能量調(diào)控，且Amylin對(duì)CART、nNOS表達(dá)調(diào)控依賴完整的SNS支配。

先期研究發(fā)現(xiàn)LDT區(qū)域nNOS參與了由SNS支配的Amylin對(duì)小鼠IBAT產(chǎn)熱的調(diào)控過程，且CART在SHy、MeA、PMV、Gi及其他細(xì)胞核中呈陽(yáng)性表達(dá)，nNOS陽(yáng)性細(xì)胞密集分布在LDT附近，說明后腦表達(dá)的nNOS及NO衍生氧化物質(zhì)可調(diào)節(jié)激酶和磷酸酶活性[18]。根據(jù)CART信號(hào)與nNOS神經(jīng)元在第三腦室(3V)附近DMH區(qū)域共定位情況，提示CART神經(jīng)元參與Amylin產(chǎn)熱調(diào)控。Gi區(qū)域nNOS神經(jīng)元與兒茶酚胺類表達(dá)神經(jīng)元存在共表達(dá)，說明nNOS神經(jīng)元可調(diào)控血管收縮[19]。全腦定位證實(shí)CART神經(jīng)元也存在于PrEW、PrBO區(qū)域，其功能尚不明晰。CART、nNOS神經(jīng)元多核團(tuán)分布，表明其參與了機(jī)體能量平衡、血管收縮等多種生理功能的調(diào)控。

作為治療肥胖癥的潛在藥物，Amylin可通過作用下丘腦調(diào)控動(dòng)物食欲和能量平衡。DMH主要由抑制體質(zhì)量和食欲的γ-氨基丁酸能(GABA)神經(jīng)元和nNOS神經(jīng)元組成[20]，這2種陽(yáng)性神經(jīng)元可整合哺乳動(dòng)物外周器官能量相關(guān)信號(hào)，調(diào)控機(jī)體能量代謝進(jìn)程。有研究報(bào)道稱，沉默DMH R-spondin 1(Rspo1)可降低ARC中CART表達(dá)，減弱胰島素對(duì)食物攝入的抑制作用[21]，表明CART可在Rspo1下游介導(dǎo)胰島素抑食作用。已知CART可被瘦素激活，進(jìn)而參與能量調(diào)控[22]，且注射Amylin后可顯著增強(qiáng)下丘腦CART表達(dá)水平，提示，除瘦素外Amylin的能量調(diào)控作用也涉及CART神經(jīng)元介導(dǎo)。盡管Amylin可增強(qiáng)同一區(qū)域nNOS神經(jīng)元表達(dá)，但CART與nNOS無共定位關(guān)系，說明兩者在下丘腦能量調(diào)控相對(duì)獨(dú)立。

依賴SNS支配的棕色脂肪組織(bown adipose tissue,BAT)是機(jī)體產(chǎn)熱的重要來源。RYU等[23]利用IBAT特定多突觸逆行追蹤技術(shù)證明DMH與BAT產(chǎn)熱密切相關(guān)[23]。LDT信號(hào)調(diào)節(jié)依賴于完整的SNS，這表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)關(guān)鍵核團(tuán)可向IBAT發(fā)送下行投射信號(hào)并與采食有關(guān)?？傊珻NS與交感神經(jīng)介導(dǎo)的功能調(diào)節(jié)存在解剖學(xué)聯(lián)系，說明CART、nNOS參與了Amylin介導(dǎo)的中樞能量調(diào)控過程。

綜上，CART與nNOS在小鼠DMH神經(jīng)核團(tuán)中存在共表達(dá)，Amylin可顯著促進(jìn)DMH區(qū)域CART以及nNOS神經(jīng)元表達(dá)，且該過程依賴完整IBAT交感神經(jīng)支配參與能量調(diào)控。