RaeX蛋白在鴨疫里默桿菌耐受重金屬離子中的作用分析

秦明星，宮曉煒，陳啟偉，王燕萍，權(quán) 衡，朱雨佳，鄭福英，藺國珍

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730046)

許多重金屬離子(Fe、Mn、Zn、Co、Ni等)是細(xì)菌的必需營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)于細(xì)菌的生命活動(dòng)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，比如參與細(xì)菌的生長、多種酶類的功能等[1-2]。細(xì)菌可通過各種途徑和機(jī)制獲得重金屬離子，以維持自身的生存；另一方面，過量的重金屬離子累積在細(xì)胞內(nèi)會(huì)對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性[3-4]。細(xì)菌進(jìn)化出了復(fù)雜的機(jī)制來維持自身體內(nèi)外重金屬離子的平衡，其中金屬離子外排泵發(fā)揮了重要作用[5-6]。

鴨疫里默桿菌是一種革蘭陰性菌，導(dǎo)致雛鴨的漿膜炎，是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn)的一種細(xì)菌病原。該菌的基因組中標(biāo)注多種類型的外排泵，目前的研究已經(jīng)鑒定一種主要易化子超家族(major facilitator super family，MFS)Rant蛋白[7]，耐藥結(jié)節(jié)細(xì)胞分化家族(resistance nodulation and cell division，RND)RaeC-RaeA-RaeB和RaeE-RaeF-RopN外排泵[8-9]，以及一種ATP結(jié)合盒家族(ATP binding cassette，ABC)外排泵[10]，這些外排泵具有不同的底物譜，均與菌株的耐藥性相關(guān)。RND外排泵是3種蛋白組成的復(fù)合物，包括內(nèi)膜蛋白(inner membrane protein，IMP)外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)和周質(zhì)膜融合蛋白(membrane fusion protein，MFP)[11]。這3種蛋白可以位于同一個(gè)操縱子內(nèi)，或者內(nèi)膜蛋白和周質(zhì)蛋白位于同一個(gè)操縱子內(nèi)，而外膜蛋白位于其他位置。

鴨疫里默桿菌RA-LZ01株的基因組中注明，GE296_RS01445-GE296_RS01450-GE296_RS01-455編碼一個(gè)3組分蛋白的RND外排泵，將其命名為RaeX-RaeY-RopM，其中GE296_RS01445、GE296_RS01450和GE296_RS01455分別對(duì)應(yīng)于內(nèi)膜蛋白R(shí)aeY、外膜蛋白R(shí)opM和周質(zhì)蛋白R(shí)aeX。本課題組在前期研究中構(gòu)建了RA-LZ01菌株的GE296_RS01450基因編碼的RopM蛋白缺失株，首次發(fā)現(xiàn)該蛋白滅活后菌株對(duì)重金屬離子Ni、Mn和Co的敏感性顯著上升，但菌株的耐藥表型無任何改變，說明RaeX-RaeY-RopM外排泵與鴨疫里默桿菌的重金屬離子耐受相關(guān)，而與其耐藥性無關(guān)[7]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證GE296_RS01455基因編碼的RaeX蛋白是否在RA-LZ01菌株耐受重金屬離子中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒鴨疫里默桿菌RA-LZ01(GenBank登錄號(hào)：NZ_CP045564.1)和LJW-2菌株保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所草食動(dòng)物細(xì)菌病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)；大腸桿菌X7213和自殺質(zhì)粒pRE112購自NTCC國家典型培養(yǎng)物保藏中心；穿梭質(zhì)粒pCPRA由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；大腸桿菌Trans-1感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金公司。

1.2 培養(yǎng)基和試劑胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)、胰蛋白酶大豆瓊脂(TSA)購自美國 BD difcoTM公司；LB肉湯購自英國Oxoid 公司；瓊脂粉和抗生素購自北京索萊寶科技有限公司；2,6-二氨基庚二酸(DPA)購自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；重金屬試劑購自上海麥克林生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶 SacⅠ、SphⅠ、PstⅠ、T4連接酶，質(zhì)粒提取試劑盒，膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；細(xì)菌RNA提取試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)公司；0.22 μm 無菌硝酸纖維素膜和過濾器購自美國 Millipore公司；SYBR qPCR Master Mix和HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)本研究中所用的引物及擴(kuò)增的目的DNA片段見表1，引物由西安擎科生物有限公司合成。

1.4 構(gòu)建GE296_RS01455基因缺失株Δ1455如表1中所列，以親本株RA-LZ01株的基因組為模板，以1455-U-F/1455-U-R和1455-D-F/1455-D-R為引物，擴(kuò)增GE296_RS01455基因的上游同源臂(UP-HA)和下游同源臂(DO-HA)；以菌株LJW-2基因組為模板，以Erm-F/Erm-R為引物擴(kuò)增ermF抗性基因；通過重疊PCR將UP-HA、ermF基因和DO-HA依次進(jìn)行融合，構(gòu)建打靶片段(該片段包括GE296_RS01455基因上游同源臂620 bp，ermF抗性基因801 bp以及下游同源臂601 bp)；用SacⅠ和SphⅠ酶將打靶片段克隆進(jìn)自殺質(zhì)粒pRE112，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌X7213化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，利用含50 mg/L DPA、25 mg/L氯霉素的LB固體培養(yǎng)板進(jìn)行篩選，隨后用引物1455-U-F/1455-D-R進(jìn)行PCR鑒定，并將擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的陽性菌株即為供體菌，命名為X7213-pRE112-1455。

表1 PCR引物名稱、序列及擴(kuò)增DNA片段

參照文獻(xiàn)[7-8]，通過結(jié)合轉(zhuǎn)移和同源重組的方法構(gòu)建GE296_RS01455基因缺失株。利用含2 mg/L 紅霉素和5 mg/L多黏菌素B的TSA平板進(jìn)行篩選，得到的單菌落增菌后，用引物OmpA-F/OmpA-R、1455-U-F/1455-D-R、1455-F/1455-R和Erm-F/Erm-R進(jìn)行PCR鑒定，并將引物1455-U-F/1455-D-R擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，得到的缺失株命名為Δ1455。

1.5 構(gòu)建GE296_RS01455基因回復(fù)株cΔ1455以親本株RA-LZ01株的基因組為模板，以引物1455-F/1455-R擴(kuò)增GE296_RS01455基因，用PstⅠ和SphⅠ酶將目的DNA片段克隆進(jìn)穿梭質(zhì)粒pCPRA，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)X7213，用含有50 mg/L 氨芐青霉素的TSA平板進(jìn)行篩選，并用OmpA-F/OmpA-R和1455-F/1455-R引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，得到的供體菌命名為X7213-pCPRA-1455。將供體菌與GE296_RS01455基因缺失株Δ1455共培養(yǎng)，利用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將重組穿梭質(zhì)粒導(dǎo)入Δ1455中，用含有1 mg/L孢西丁的TSA平板進(jìn)行篩選，并用OmpA-F/OmpA-R和1455-F/1455-R引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，恢復(fù)株命名為cΔ1455。具體操作方法見文獻(xiàn)[7-8]。

1.6 生長曲線測(cè)定分別將RA-LZ01和Δ1455菌株接種至5 mL TSB液體培養(yǎng)基中，37℃ 200 r/min培養(yǎng)至D600值約1.0，并測(cè)定每個(gè)菌株的CFU，調(diào)整每個(gè)菌株的起始濃度均為109CFU/mL。分別取0.1 mL 菌液接種至10 mL TSB液體培養(yǎng)基中，即每個(gè)菌株的接種量均為108CFU。37℃ 200 r/min培養(yǎng)，每隔1 h取130 μL菌液用紫外分光光度計(jì)測(cè)量其D600值，共測(cè)定12 h。每個(gè)菌株做3組平行試驗(yàn)[12]。

1.7 重金屬離子耐受性試驗(yàn)將經(jīng)121℃，20 min高壓的TSA培養(yǎng)基冷卻至40℃左右，分別加入AgCl、ZnSO4、BaSO4、FeSO4、MnCl2、CuSO4、NiCl2、CoCl2、CaCl2、MgSO4共10種重金屬試劑，分別配置成含不同濃度金屬離子的培養(yǎng)板，各金屬離子的濃度如下：AgCl(0.21×10-3～1.46×10-3mol/L)；ZnSO4(0.11×10-3～0.70×10-3mol/L)；BaSO4(0.13×10-3～0.86×10-3mol/L)；FeSO4(0.16×10-3～1.32×10-3mol/L)；MnCl2(0.24×10-3～1.59×10-3mol/L)；CuSO4(0.12×10-3～0.80×10-3mol/L)；NiCl2(0.23×10-3～1.54×10-3mol/L)；CoCl2(0.13×10-3～0.84×10-3mol/L)；CaCl2(0.18×10-3～1.80×10-3mol/L)；MgSO4(0.17×10-3～1.66×10-3mol/L)。將新鮮菌液以1∶100比例重新轉(zhuǎn)接后，增菌至D600值約1.0，以10倍系列稀釋，測(cè)定每株菌每個(gè)稀釋度的CFU，并調(diào)整每株菌的菌液濃度為10～106CFU/mL，依次取10～106CFU/mL的菌液，每個(gè)菌液樣本取5 μL進(jìn)行點(diǎn)板，將TSA平板在CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長狀況。

1.8 實(shí)時(shí)定量RT-PCR為了確定在不同重金屬離子的刺激下，GE296_RS01455基因的轉(zhuǎn)錄水平，將親本株分別在含CoCl2(0.42×10-3mol/L)，NiCl2(1.54×10-3mol/L)和MnCl2(1.59×10-3mol/L)的TSB中培養(yǎng)至D600值約為1.0，用細(xì)菌RNA提取試劑盒提取總RNA,然后用gDNA wiper 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，作為模板備用。qRT-PCR 反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40次循環(huán)。以特異性引物GAPDH-F/GADPH-R，q1455-F/q1455-R分別擴(kuò)增GAPDH和GE296_RS01455基因，其中GADPH基因作為內(nèi)參。通過2-△△Ct方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量，并進(jìn)行差異性分析[13]。

2 結(jié)果

2.1 缺失株△1455和回復(fù)株c△1455的構(gòu)建結(jié)果用引物OmpA-F/OmpA-R、1455-U-F/1455-D-R、Erm-F/Erm-R和1455-F/1455-R對(duì)缺失株進(jìn)行PCR鑒定，前3對(duì)引物擴(kuò)增出目的條帶，同時(shí)第4對(duì)引物擴(kuò)增不出目的條帶即為缺失株(圖1A)。將1455-U-F/1455-D-R引物擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序，證實(shí)GE296_RS01455基因缺失株△1455構(gòu)建成功。

以引物OmpA-F/OmpA-R，1455-F/1455-R對(duì)回復(fù)株進(jìn)行PCR鑒定，2對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增出目的片段即為回復(fù)株(圖1B)。將1455-F/1455-R引物擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)一步測(cè)序，證實(shí)基因回復(fù)株c△1455構(gòu)建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.OmpA基因(1 119 bp);2.ErmF 基因(801 bp);3.包含UP-HA、ermF、DO-HA 的GE296_RS01455(2 022 bp)基因片段;4.GE296_RS01455(1 137 bp)

2.2 生長曲線為證明GE296_RS01455基因的缺失是否影響菌株的生長速率，測(cè)定了親本株RA-LZ01和缺失株△1455在生長12 h內(nèi)的D600值，并制定生長曲線。結(jié)果顯示，與親本株RA-LZ01相比，缺失株△1455在2～4 h內(nèi)生長速率降低，但4～12 h內(nèi)的生長速率無明顯變化(圖2)。

圖2 親本株RA-LZ01和缺失株△1455的生長曲線

2.3 菌株對(duì)重金屬離子的耐受性重金屬離子點(diǎn)板試驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同重金屬離子濃度下，與親本株RA-LZ01相比，缺失株Δ1455對(duì)CuSO4、ZnSO4、AgCl、BaSO4、FeSO4、CaCl2、MgSO4的耐受性均沒有發(fā)生改變，但對(duì)1.59×10-3mol/LMnCl2、1.54×10-3mol/LNiCl2和0.42×10-3mol/L CoCl2的敏感性顯著升高；回復(fù)株cΔ1455部分恢復(fù)了對(duì)MnCl2、NiCl2和CoCl2的耐受。該結(jié)果說明GE296_RS01455基因介導(dǎo)菌株RA-LZ01對(duì)重金屬M(fèi)n、Ni和Co的耐受(圖3)。

圖3 菌株對(duì)重金屬離子的耐受性

2.4 實(shí)時(shí)定量RT-PCR通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR結(jié)果分析，在MnCl2的作用下，親本株RA-LZ01中GE296_RS01455基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平無顯著變化；在NiCl2和CoCl2的作用下，GE296_RS01455基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平分別提高了24和20倍(圖4A)。然而，在MnCl2、NiCl2和CoCl2作用下，回復(fù)株c△1455中GE296_RS01455基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平均無明顯變化(圖4B)。

注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；NS差異不顯著

3 討論

鴨疫里默桿菌是一種桿狀或橢圓狀、可形成莢膜的革蘭陰性菌，屬于黃桿菌科，里默菌屬[14]。該菌主要感染0～5周齡的雛鴨，可通過呼吸道、皮膚傷口和消化道等多種途徑導(dǎo)致雛鴨的漿膜炎和腦膜炎，發(fā)病鴨具有較高的死亡率，給養(yǎng)鴨業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[15]。鴨疫里默桿菌具有多種血清型，各血清型之間無交叉保護(hù)，給疫苗防控策略帶來很大障礙。目前養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用的是血清1和2型二價(jià)滅活苗，以及血清1，2和7型三價(jià)滅活苗。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，目前我國流行的鴨疫里默桿菌除了以上血清型，還有其他血清型菌株，導(dǎo)致疫苗免疫效果較差[16]。因此，實(shí)際養(yǎng)殖中主要以抗生素防治為主，但在抗生素的壓力下，耐藥菌株不斷出現(xiàn)，需要對(duì)鴨疫里默桿菌的耐藥機(jī)制開展研究，以提高抗生素的應(yīng)用效果，并為開發(fā)新型藥物提供靶標(biāo)[17]。

外排泵是介導(dǎo)細(xì)菌耐藥的重要機(jī)制，尤其是RND外排泵廣泛存在于革蘭陰性菌中，并且該種外排泵的底物譜非常寬泛，包括抗生素、去污劑、有機(jī)溶劑、消毒劑、重金屬等[18-19]。本課題組前期對(duì)鴨疫里默桿菌的外排泵進(jìn)行鑒定時(shí)，發(fā)現(xiàn)RA-LZ01株的1個(gè)RND外排泵RaeX-RaeY-RopM，將其外膜蛋白R(shí)opM(GE296_RS01450基因編碼)缺失后，菌株對(duì)9類共22種抗生素、去污劑、有機(jī)溶劑以及消毒劑的敏感性均無改變，并且菌株的生長速率也無明顯改變，說明該外排泵與菌株的耐藥性和生長能力無關(guān)[7]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RopM蛋白滅活導(dǎo)致菌株對(duì)MnCl2、NiCl2和CoCl2的敏感性顯著升高，首次發(fā)現(xiàn)鴨疫里默桿菌中存在與重金屬離子耐受相關(guān)的外排泵。

RND外排泵的每一個(gè)組分都是必需的，每一個(gè)蛋白的缺失都會(huì)導(dǎo)致RND外排泵失去功能，但外膜蛋白滅活后可能會(huì)有其他外膜蛋白進(jìn)行代替[20]。基于上述發(fā)現(xiàn)，本課題組進(jìn)一步對(duì)編碼內(nèi)膜蛋白R(shí)aeY的GE296_RS01445基因進(jìn)行定向缺失，但經(jīng)過多次試驗(yàn)，始終無法得到該蛋白的全部或部分缺失株，說明RaeY是鴨疫里默桿菌的必需蛋白，滅活后將導(dǎo)致菌株死亡[7]。

本研究對(duì)編碼周質(zhì)蛋白R(shí)aeX的GE296_RS01455基因進(jìn)行定向缺失，對(duì)菌株的生長速率，菌株對(duì)MnCl2、NiCl2和CoCl2的耐受性，以及GE296_RS01455基因在MnCl2、NiCl2和CoCl2壓力下的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)RaeX蛋白滅活后菌株也表現(xiàn)出與RopM蛋白滅活株相同的性狀，說明RaeX與RopM蛋白在RaeX-RaeY-RopM外排泵中均發(fā)揮功能。另外，恢復(fù)株中的GE296_RS01455基因在MnCl2、NiCl2和CoCl2壓力下轉(zhuǎn)錄水平無明顯變化，可能與該基因位于穿梭質(zhì)粒上有關(guān)，所用的啟動(dòng)子與親本株不同，也無法提供與親本株一致的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

目前發(fā)現(xiàn)的能外排重金屬離子的細(xì)菌RND外排泵較少，主要有大腸桿菌中能夠有效的排出細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中的Cu和Ag離子的CusCBA外排泵[21]，外排Ni和Co離子的RcnB外排泵[6]；耐重金屬根瘤菌中能夠有效排出Zn離子的ZneA外排泵[22]；銅綠假單胞菌中能夠排出細(xì)胞周質(zhì)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Zn、Cd和Co離子的CzcCBA外排泵[23]；豬鏈球菌中外排Fe和Co離子的PmtA[5]以及外排Mn離子的MntE等[24]。本研究發(fā)現(xiàn)鴨疫里默桿菌中外排Mn、Ni和Co離子的RND外排泵，豐富了對(duì)細(xì)菌外排重金屬離子的理解。