• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    葛根芩連湯抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷配伍規(guī)律研究

    2022-10-21 07:58:52董文敏張倩蕓劉王振祖王新宏
    中草藥 2022年20期
    關(guān)鍵詞:連湯葛根芩葛根

    林 川,董文敏,張倩蕓,劉王振祖,梁 琨,王新宏,安 叡*

    葛根芩連湯抑制TNF-α誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷配伍規(guī)律研究

    林 川1,董文敏2,張倩蕓1,劉王振祖1,梁 琨1,王新宏1,安 叡1*

    1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,上海 201203 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院,上海 201200

    探討葛根芩連湯緩解腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用及其配伍規(guī)律。將Caco-2細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、TNF-α(80 μg/L)組、小檗堿(6.73 μg/mL)組及葛根芩連湯配伍組(全方組、去甘草組、去葛根組、葛根甘草組和黃芩黃連組,18.75 μg/mL)。除對(duì)照組外,其余各組細(xì)胞給予TNF-α預(yù)處理2 h,再給予相應(yīng)藥物處理24 h。MTT檢測(cè)Caco-2細(xì)胞活力;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;比色法檢測(cè)細(xì)胞中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde,MDA)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平;qRT-PCR和Western blotting分別檢測(cè)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,)、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1,]和血紅素氧合酶-1(heme oxygenase 1,)mRNA和蛋白表達(dá);熒光顯微鏡觀察Nrf2蛋白入核情況。5.0~25.0 μg/mL的含藥培養(yǎng)基和10~80 μg/L的TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞活性無明顯影響。與TNF-α組比較,各給藥組Caco-2細(xì)胞ROS水平顯著降低(<0.01);除去葛根組和黃芩黃連組外,其余各組MDA水平顯著降低(<0.01),GSH水平明顯升高(<0.01);除去葛根組外,其余各給藥組基因表達(dá)明顯升高(<0.01),全方組和去甘草組基因表達(dá)明顯升高(<0.05、0.01),全方組和葛根甘草組基因表達(dá)明顯升高(<0.05、0.01);除黃芩黃連組外,其余各組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(<0.01);除去葛根組和黃芩黃連組外,其余各組NQO1蛋白水平顯著升高(<0.05、0.01),Nrf2蛋白入核明顯增加(<0.05、0.01)。缺少葛根對(duì)葛根芩連湯抑制Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有較大影響。

    葛根芩連湯;葛根;配伍規(guī)律;氧化應(yīng)激;結(jié)腸癌細(xì)胞

    氧化應(yīng)激是體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態(tài),傾向于氧化,中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn),蛋白酶分泌增加,產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用,是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。葛根芩連湯出自《傷寒論》,為醫(yī)圣張仲景的名方之一。方中葛根為君,以其甘辛而涼,主入陽明經(jīng),外解肌表之邪、內(nèi)清陽明之熱,使表解里和;臣以黃芩、黃連苦寒清熱,堅(jiān)陰止利;佐使以甘草甘緩和中,調(diào)和諸藥;四藥合用,外疏內(nèi)清,表里同治。研究表明,葛根芩連湯對(duì)氧化應(yīng)激損傷有一定的緩解作用[1-2]。本課題組前期從化學(xué)成分[3]、入血成分[4]、在人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞模型中的吸收特征[5]、對(duì)肝臟細(xì)胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)具體亞型酶活性的影響[6]、腸外翻吸收[7-9]、在體腸道灌流吸收及對(duì)急性腸炎大鼠腸道菌群多樣性的影響[10-11]等方面對(duì)葛根芩連湯的配伍機(jī)制進(jìn)行了大量研究。本研究以人腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)為刺激因素[12-13],激活Caco-2細(xì)胞炎癥反應(yīng),觀察葛根芩連湯及不同配伍組對(duì)Caco-2細(xì)胞的影響,以及對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)細(xì)胞因子和通路的作用,以闡釋葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制及其配伍的合理性,為更全面地揭示該復(fù)方配伍規(guī)律的研究奠定基礎(chǔ)。

    1 材料

    1.1 細(xì)胞

    Caco-2細(xì)胞購(gòu)自賽百慷生物技術(shù)股份有限公司。

    1.2 藥材

    葛根、黃芩、黃連和炙甘草飲片均購(gòu)自上??禈蛑兴庯嬈邢薰?,批號(hào)分別為201016、201103、201118、201109,經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)倪梁紅副教授鑒定分別為豆科植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根、唇形科植物黃芩Georgi的干燥根、毛茛科植物黃連Franch的干燥根莖和豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖,符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

    1.3 藥品與試劑

    小檗堿(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,批號(hào)Y18N8S48598)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;MEM培養(yǎng)基(批號(hào)20210706)、青鏈霉素混合液(批號(hào)20211119)、0.25%胰蛋白酶(批號(hào)2021060105)均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS,批號(hào)2217479CP)購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;MTT(批號(hào)CR2107085)、β-actin抗體(批號(hào)AC2102050A)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(批號(hào)CR2104079)購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司;TNF-α(批號(hào)021825)購(gòu)自PeproTech公司;總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase,T-SOD)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20201231)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20210106)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)測(cè)定試劑盒(批號(hào)20210105)購(gòu)自南京建成生物工程研究所;活性氧(reactive oxygen species,ROS)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)01152120319)、總RNA抽提試劑Trizol(批號(hào)030221211216)、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)031519190503)、Triton X-100(批號(hào)120921220118)、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI,批號(hào)091720210121)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司;ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(批號(hào)027E1280LB)、HiScript?II Q RT SuperMix for qPCR(批號(hào)017E2232BA)購(gòu)自諾唯贊公司;RIPA裂解液(批號(hào)R1001221)、BCA蛋白定量試劑盒(批號(hào)B1001231)購(gòu)自上海翊圣生物公司;核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)抗體(批號(hào)00102781)、還原型輔酶I/II醌氧化還原酶1[NAD(P)H quinine oxidoreductase 1,NQO1]抗體(批號(hào)10017852)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)抗體(批號(hào)00083458)購(gòu)自Proteintech公司;濃縮型正常山羊血清(批號(hào)17G04A09)、熒光(Cy3)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(批號(hào)BST16L31C17G32)購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

    1.4 儀器

    SW-CJ-1FD型超凈工作臺(tái)(蘇州集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司);FlexStation3型多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司);cytoFLEX型流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司);BioPhotometer D30型核酸蛋白檢測(cè)儀,Mastercycler pro型梯度PCR儀(德國(guó)Eppendorf公司);StepOnePlus型qRT-PCR儀(美國(guó)ABI公司);PowerPac Basic型電泳儀及Mini Transblot型濕轉(zhuǎn)印槽(美國(guó)Bio-Rad公司);AI 600型超靈敏多功能成像儀(美國(guó)GE公司);BX53型生物顯微鏡(日本Olympus公司)。

    2 方法

    2.1 葛根芩連湯的制備

    設(shè)置全方(GQ)組、去甘草(WGC)組(葛根、黃芩、黃連)、去葛根(WG)組(黃芩、黃連、甘草)、葛根甘草(GG)組、黃芩黃連(QL)組,將葛根、黃芩、黃連、甘草按照5∶3∶2∶2的比例混合(各組中缺味藥材按0計(jì)算),分別加10倍量水,葛根先煎20 min,余藥共煎30 min,煎煮2次,濾過,合并濾液,采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測(cè)定成分及含量[1,3],GQ組、WGC組和GG組葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.86、3.78和3.14 mg/g,GQ組、WGC組、WG組和QL組小檗堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6.76、0.73、6.91和1.79 mg/g。濾液于60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮,放至室溫后于?20 ℃冰箱預(yù)凍,轉(zhuǎn)入凍干機(jī),真空冷凍干燥,取出并碾壓得到凍干粉。以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解凍干粉[14],經(jīng)微孔濾膜濾過,使用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋。

    2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    Caco-2細(xì)胞用含20% FBS和1%青鏈霉素混合液的MEM培養(yǎng)基[15-16],于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.3 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種至96孔板,培養(yǎng)過夜。設(shè)置對(duì)照組、GQ組、WGC組、WG組、GG組和QL組,各給藥組分別以5.0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的相應(yīng)藥物處理24 h,對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μL MTT,37 ℃培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)基,加入150 μL DMSO振蕩10 min,采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處的吸光度()值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

    細(xì)胞存活率=給藥/對(duì)照

    2.4 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,以5×103個(gè)/孔接種至96孔板,培養(yǎng)過夜。設(shè)置對(duì)照組和TNF-α組,TNF-α組分別以10、20、40、80、100 μg/L的TNF-α處理26 h,對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)26 h。按“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定各組值,計(jì)算細(xì)胞存活率。

    2.5 細(xì)胞內(nèi)ROS含量的測(cè)定

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔接種至6孔板,培養(yǎng)過夜。設(shè)置對(duì)照組、TNF-α組、小檗堿組和葛根芩連湯及其配伍組,TNF-α組給予80 μg/L TNF-α處理26 h,各給藥組給予80 μg/L TNF-α預(yù)處理2 h后,BBR組給予6.73 μg/mL小檗堿[2,17],葛根芩連湯及其配伍組分別給予18.75 μg/mL藥液[2],與TNF-α共同作用24 h,對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)基培養(yǎng)26 h,按照試劑盒說明書檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平。

    2.6 細(xì)胞T-SOD活性和MDA、GSH水平的檢測(cè)

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,收集細(xì)胞,按照試劑盒說明書檢測(cè)T-SOD活性和MDA、GSH水平。

    2.7 qRT-PCR檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌。按照試劑盒說明書提取總RNA并合成cDNA,進(jìn)行qRT-PCR分析[17]。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)合成,引物序列見表1。

    2.8 Western blotting檢測(cè)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,收集細(xì)胞,用預(yù)冷的PBS洗滌。加入100 μL含1%磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度,加入Loading buffer混勻,95 ℃加熱使蛋白變性,分裝后于?80 ℃保存。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)至PVDF膜,封閉后,分別加入Nrf2(1∶2000)、NQO1(1∶10 000)、HO-1(1∶1000)和β-actin(1∶3000)抗體,4 ℃孵育過夜;加入相應(yīng)二抗(1∶3000),室溫孵育2 h,顯影后,用Image J軟件分析目的條帶灰度值[18]。

    表1 引物序列

    Table 1 Primer sequences

    基因序列 (5’-3’) Nrf2F: GACAATGAGGTTTCTTCGGCTACG R: GGAGAGGATGCTGCTGAAGGAATC NQO1F: CGCAGACCTTGTGATATTCCAG R: CGTTTCTTCCATCCTTCCAGG HO-1F: CAGCATGCCCCAGGATTTG R: AGCTGGATGTTGAGCAGGA β-actinF: CCTGACTGACTACCTCATGAAG R: GACGTAGCACAGCTTCTCCTTA

    2.9 免疫熒光染色檢測(cè)Caco-2細(xì)胞Nrf2入核作用

    取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco-2細(xì)胞,接種于細(xì)胞爬片上,按“2.5”項(xiàng)下方法分組并給藥,24 h后吸棄培養(yǎng)板中液體,加入PBS洗滌,于4%多聚甲醛中固定,加入0.5% Triton X-100室溫通透,滴加正常山羊血清,室溫封閉。吸干封閉液,滴加Nrf2抗體(1∶50),放入濕盒,4 ℃孵育過夜。浸洗,吸干,滴加熒光(Cy3)標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(1∶100),于37 ℃濕盒中孵育1 h。滴加DAPI,避光孵育染核。洗滌,吸干液體,加入含抗熒光淬滅劑的封片液封片,于熒光顯微鏡下觀察,采集圖像,使用IPP 6.0軟件對(duì)免疫熒光照片進(jìn)行分析。

    2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    3 結(jié)果

    3.1 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    如表2所示,葛根芩連湯及其配伍在5.0~25.0 μg/mL時(shí),Caco-2細(xì)胞存活率基本在80%及以上,說明Caco-2細(xì)胞未受到明顯影響。根據(jù)前期研究,GQ為18.75 μg/mL時(shí)[2],對(duì)Caco-2細(xì)胞損傷緩解作用較好,因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中葛根芩連湯及其配伍組的質(zhì)量濃度設(shè)定為18.75 μg/mL。

    3.2 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響

    如表3所示,Caco-2細(xì)胞給予10~80 μg/L的TNF-α處理時(shí),細(xì)胞存活率均大于80%,活性基本未見明顯影響。根據(jù)前期研究[2],80 μg/L TNF-α顯著誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,)mRNA的表達(dá),因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇80 μg/L TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。

    3.3 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響

    如表4所示,與對(duì)照組比較,TNF-α誘導(dǎo)后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高(<0.01);經(jīng)藥物干預(yù)后,Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平均顯著降低(<0.01);與GQ組比較,WG組和QL組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高(<0.01)。

    組別劑量/(μg·mL?1)細(xì)胞存活率/%組別劑量/(μg·mL?1)細(xì)胞存活率/% GQ5.091.29±1.49GG5.0110.36±1.07 12.592.65±0.85 12.5103.39±0.82 25.079.76±0.53 25.090.46±1.22 50.060.08±0.51 50.074.03±1.74 100.048.23±0.53 100.043.23±0.48 200.09.62±0.03 200.013.20±1.09 WGC5.094.79±0.33QL5.095.21±1.17 12.597.92±1.04 12.595.83±1.06 25.080.59±1.36 25.079.74±1.43 50.067.43±0.55 50.058.20±0.30 100.048.02±0.71 100.033.20±0.43 200.08.41±0.05 200.09.37±0.03 WG5.094.65±2.28 12.583.99±1.71 25.080.42±0.32 50.064.47±0.44 100.048.34±0.82 200.09.46±0.17

    表3 TNF-α對(duì)Caco-2細(xì)胞存活率的影響(, n = 3)

    表4 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響(, n = 3)

    與對(duì)照組比較:**<0.01;與TNF-α組比較:#<0.05##<0.01;與GQ組比較:&<0.05&&<0.01,下表同

    **< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01TNF-α group;&< 0.05&&< 0.01GQ group, same as below tables

    3.4 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響

    如表5所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組細(xì)胞中MDA水平顯著升高(<0.01),T-SOD活性和GSH水平顯著降低(<0.01);與對(duì)照組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組MDA水平顯著降低(<0.01),GSH水平顯著升高(<0.01);與GQ組比較,WG組和QL組MDA水平顯著升高(<0.01),GSH水平顯著降低(<0.01)。

    3.5 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)的影響

    如表6所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組mRNA表達(dá)呈下降趨勢(shì),和mRNA表達(dá)水平均明顯降低(<0.01);與TNF-α組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組、GG組和QL組mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05、0.01),GQ組和WGC組mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05、0.01),GQ組和GG組mRNA表達(dá)水平均顯著升高(<0.05、0.01);與GQ組比較,WGC組、WG組、GG組和QL組和mRNA表達(dá)水平均明顯降低(<0.01),WGC組、WG組和QL組mRNA表達(dá)水平均明顯降低(<0.01)。

    表5 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞中T-SOD活性和MDA、GSH水平的影響(, n = 3)

    表6 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞Nrf2、NQO1和HO-1 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

    3.6 葛根芩連湯及配伍對(duì)細(xì)胞內(nèi)Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響

    如圖1和表7所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組NQO1蛋白表達(dá)呈下降趨勢(shì),Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(<0.01);與TNF-α組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組、WG組和GG組Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平均顯著升高(<0.01),小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組NQO1蛋白表達(dá)水平顯著升高(<0.05、0.01);與GQ組比較,QL組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低(<0.05、0.01)。

    圖1 各組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)情況

    3.7 葛根芩連湯及配伍對(duì)Nrf2蛋白入核影響

    如圖2和表8所示,與對(duì)照組比較,TNF-α組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白陽性表達(dá)呈下降趨勢(shì);與TNF-α組比較,小檗堿組、GQ組、WGC組和GG組細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白陽性表達(dá)明顯增加(<0.05、0.01)。

    表7 葛根芩連湯及配伍對(duì)Caco-2細(xì)胞Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

    圖2 各組Caco-2細(xì)胞中Nrf2蛋白入核情況 (×400)

    表8 各組Caco-2細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá) (, n = 3)

    4 討論

    研究發(fā)現(xiàn),葛根芩連湯可上調(diào)Nrf2信號(hào)通路緩解TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和潰瘍性結(jié)腸炎大鼠病理損傷[1-2]。本課題組在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中初步探討了葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用的配伍規(guī)律,發(fā)現(xiàn)組方中缺少君藥葛根或僅有臣藥黃芩和黃連對(duì)減輕氧化應(yīng)激損傷作用有較大影響[1]。因此,本研究以TNF-α誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞氧化損傷,進(jìn)一步探討葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激作用的配伍規(guī)律。

    TNF-α可以激活炎癥反應(yīng),引起氧化應(yīng)激損傷,導(dǎo)致ROS產(chǎn)生大量增加[19-20]。ROS的增加會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸氧化,進(jìn)而造成細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷,甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞毒性。MDA為ROS與細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物[21],其含量可以間接反映脂質(zhì)過氧化程度。本研究結(jié)果顯示,葛根芩連湯及不同配伍組均可以顯著降低TNF-α引起的ROS含量增加,但去葛根組和黃芩黃連組降低ROS含量的作用比全方組弱且有顯著性差異。去葛根組和黃芩黃連組對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的MDA含量增加無明顯降低作用。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]中,去葛根組對(duì)大鼠血清中MDA含量的降低明顯弱于全方組。表明全方中君藥葛根對(duì)于降低過氧化物含量起重要作用。

    SOD可以清除機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的超氧化陰離子和自由基[22],GSH可以保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能免受過氧化氫的氧化損傷[23]。SOD活性和GSH水平降低會(huì)導(dǎo)致自由基堆積[24]。本研究結(jié)構(gòu)顯示,給予藥物干預(yù)后,TNF-α引起的T-SOD活性和GSH水平下降得到了改善,但去甘草組和去葛根組T-SOD活性與對(duì)照組相比具有顯著性差異,去葛根組和黃芩黃連組對(duì)GSH的作用明顯低于全方組。前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]中,去葛根組大鼠血清中T-SOD活性明顯低于對(duì)照組,黃芩黃連組GSH活性與全方組相比具有顯著性差異,與本研究結(jié)果基本一致。提示葛根芩連湯能夠促進(jìn)抗氧化酶活性,其中君藥葛根的作用較大。

    Nrf2是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)控因子,Nrf2的激活可以抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),減少細(xì)胞凋亡[12,23-24]。NQO1同時(shí)也是輔酶Q(泛醌)和維生素E的還原酶,可通過維持輔酶Q和維生素E的還原狀態(tài)來發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用[1-2]。HO-1是血紅素生成膽綠素、一氧化碳和鐵離子的限速酶[22-23]。NQO1和HO-1是體內(nèi)重要的II相解毒酶和抗氧化劑,在體內(nèi)發(fā)揮著重要的抗氧化作用。本研究結(jié)果顯示,葛根芩連湯及配伍對(duì)TNF-α引起的、和mRNA和蛋白表達(dá)降低均有一定的恢復(fù)作用。其中對(duì)mRNA的促進(jìn)作用,其他配伍組均弱于全方組,黃芩黃連組Nrf2、NQO1和HO-1蛋白表達(dá)明顯低于全方組,與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致[1]。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究藥物對(duì)Nrf2蛋白入核的影響,發(fā)現(xiàn)去葛根組和黃芩黃連組對(duì)TNF-α導(dǎo)致的Nrf2蛋白入核減少?zèng)]有明顯改變。上述結(jié)果證實(shí)缺少葛根的配伍組激活Nrf2信號(hào)通路作用較弱。

    本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),對(duì)于TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷,葛根素、黃芩苷、小檗堿和甘草苷均具有一定的抑制作用,其中葛根素和小檗堿的抗氧化應(yīng)激作用相對(duì)較好[2]。本研究以小檗堿為陽性對(duì)照藥物,質(zhì)量濃度為6.73 μg/mL,但去葛根組和黃芩黃連組中所含小檗堿僅有0.13和0.03 μg/mL,因此去葛根組和黃芩黃連組盡管含小檗堿成分,由于含量低導(dǎo)致其抗氧化應(yīng)激作用與全方組相比有明顯差異,同時(shí)這2個(gè)配伍組又不含有葛根素,這也是抗氧化應(yīng)激作用弱的又一原因。

    以上研究結(jié)果表明,葛根芩連湯及不同配伍對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷均有一定的抑制作用。綜合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[1]結(jié)果,方中缺少君藥葛根對(duì)抗氧化應(yīng)激作用有明顯影響。然而葛根芩連湯抑制氧化應(yīng)激損傷的配伍規(guī)律及其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)還有待通過在體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。本課題組將進(jìn)一步展開葛根芩連湯抗氧化應(yīng)激損傷的有效成分研究,深入探討葛根芩連湯配伍規(guī)律的物質(zhì)基礎(chǔ)。

    利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

    [1] 林川, 王菲, 王鴻卿, 等. 葛根芩連湯及配伍調(diào)控Nrf2/NQO1信號(hào)通路抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠氧化應(yīng)激損傷 [J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志, 2022, 28(13): 19-27.

    [2] Lin C, Zhou Z H, Zhang L J,. Gegen Qinlian Decoction relieves ulcerative colitis via adjusting dysregulated Nrf2/ARE signaling [J]., 2022, 2022: 2934552.

    [3] 王婷婷, 安叡, 梁琨, 等. 基于UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨質(zhì)譜的葛根芩連湯的化學(xué)成分分析 [J]. 中草藥, 2020, 51(6): 1498-1507.

    [4] 張藝竹, 安叡, 袁瑾, 等. 基于藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)分析比較葛根芩連湯的不同配伍腸吸收特性 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 48(10): 1611-1617.

    [5] 顧青青, 邵以諾, 安叡, 等. 葛根芩連湯有效成分對(duì)黃芩苷在Caco-2細(xì)胞模型中吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 [J]. 中成藥, 2015, 37(4): 694-699.

    [6] 陳燁, 袁瑾, 王新宏, 等. 葛根芩連湯及不同配伍對(duì)肝細(xì)胞色素P450酶的影響 [J]. 中成藥, 2013, 35(8): 1593-1598.

    [7] 張華, 安叡, 徐冉馳, 等. 葛根芩連湯及不同配伍組中生物堿類成分的腸外翻吸收研究 [J]. 中成藥, 2012, 34(4): 620-625.

    [8] 張華, 安叡, 徐冉馳, 等. UPLC快速測(cè)定葛根芩連湯腸外翻囊樣品中6個(gè)黃酮類成分含量 [J]. 藥物分析雜志, 2012, 32(1): 15-19.

    [9] 張華, 安叡, 徐冉馳, 等. 葛根芩連湯及不同配伍組中黃酮類成分的腸外翻吸收研究 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2011, 36(23): 3332-3337.

    [10] 陳陽, 陸杰, 朱思敏, 等. 基于高通量測(cè)序技術(shù)研究葛根芩連湯及其配伍對(duì)急性腸炎大鼠腸道菌群多樣性的影響 [J]. 中國(guó)中藥雜志, 2020, 45(6): 1406-1417.

    [11] 安叡, 張華, 張藝竹, 等. 采用在體單向腸灌流模型研究葛根芩連湯不同配伍組主要指標(biāo)成分的腸吸收特性 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 47(12): 1696-1702.

    [12] 秦劭晨, 王愛梅, 李若瑜. 茯苓酸對(duì)TNF-α誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞炎癥氧化應(yīng)激反應(yīng)和凋亡的拮抗作用研究 [J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技, 2019, 26(6): 854-858.

    [13] 鄭曉珂, 劉彩霞, 翟英英, 等. 卷柏中穗花杉雙黃酮對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 [J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2013, 48(9): 1503-1509.

    [14] 王雪純, 陳麗, 曹旭梅, 等. 落地生根凍干粉對(duì)HepG2細(xì)胞增殖及凋亡的影響 [J]. 中藥材, 2022, 45(3): 726-731.

    [15] 陳曉雷, 陳思如, 修光輝, 等. 高遷移率族蛋白B1在脂多糖誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞上皮屏障損傷中的作用 [J]. 中華急診醫(yī)學(xué)雜志, 2021, 30(3): 287-292.

    [16] 何萍萍, 鄭雅君, 鄭明靜, 等. 紅毛藻多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的Caco-2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用 [J]. 食品科學(xué), 2021, 42(17): 113-120.

    [17] Lu J Z, Ye D, Ma B L. Constituents, pharmacokinetics, and pharmacology of Gegen-Qinlian Decoction [J]., 2021, 12: 668418.

    [18] Chen Y R, Zhang P, Chen W R,. Ferroptosis mediated DSS-induced ulcerative colitis associated with Nrf2/HO-1 signaling pathway [J]., 2020, 225: 9-15.

    [19] Wang X H, Dai C, Wang J,. Therapeutic effect of neohesperidin on TNF-α-stimulated human rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes [J]., 2021, 19(10): 741-749.

    [20] 賀佳林, 胡瑞成, 戴愛國(guó). COPD大鼠肺組織和骨骼肌中ROS、MDA、IL-6和TNF-α含量變化 [J]. 國(guó)際呼吸雜志, 2020, 40(20): 1537-1542.

    [21] He M H, Pan H, Chang R C C,. Activation of the Nrf2/HO-1 antioxidant pathway contributes to the protective effects ofpolysaccharides in the rodentafter ischemia-reperfusion-induced damage [J]., 2014, 9(1): e84800.

    [22] Weerachayaphorn J, Mennone A, Soroka C J,. Nuclear factor-E2-related factor 2 is a major determinant of bile acid homeostasis in the liver and intestine [J]., 2012, 302(9): G925-G936.

    [23] Hu T X, Wei G, Xi M M,. Synergistic cardioprotective effects of Danshensu and hydroxysafflor yellow A against myocardial ischemia-reperfusion injury are mediated through the Akt/Nrf2/HO-1 pathway [J]., 2016, 38(1): 83-94.

    [24] Li J Q, Ichikawa T, Janicki J S,. Targeting the Nrf2 pathway against cardiovascular disease [J]., 2009, 13(7): 785-794.

    Combination rule of Gegen Qinlian Decoction on inhibiting oxidative damage stimulated by TNF-α in Caco-2 cells

    LIN Chuan1, DONG Wen-min2, ZHANG Qian-yun1, LIU Wang-zhenzu1, LIANG Kun1, WANG Xin-hong1, AN Rui1

    1. School of Pharmacy, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China 2. Pudong Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 201200, China

    To investigate the effect of Gegen Qinlian Decoction (葛根芩連湯) on relieving tumor necrosis factor-α (TNF-α)-induced oxidative stress injury in human colon cancer Caco-2 cells and its compatibility.Caco-2 cells were randomly divided into control group, TNF-α (80 μg/L) group, berberine (6.73 μg/mL) group and Gegen Qinlian Decoction compatibility group [Gegen Qinlian group (GD), Gancao (et) absent group (WGC), Gegen () absent group (WG),-etgroup (GG), Huangqin ()-Huanglian () group (QL), 18.75 μg/mL]. Except for the control group, cells in other groups were pretreated with TNF-α for 2 h, and then treated with corresponding drugs for 24 h. Caco-2 cell viability was detected by MTT; Intracellular reactive oxygen species (ROS) level were detected by flow cytometry; Total superoxide dismutase (T-SOD) activity and malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels were detected by colorimetry; qRT-PCR and Western blotting were used to detect nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), NAD(P)H quinine oxidoreductase 1 (NQO1) and heme oxygenase-1 (HO-1) mRNA and protein expressions; Fluorescence microscope was used to observe nuclear penetration of Nrf2 protein.5.0—25.0 μg/mL drug-containing medium and 10—80 μg/L TNF-α had no significant effect on the viability of Caco-2 cells. Compared with TNF-α group, ROS level in Caco-2 cells of each administration group were significantly decreased (< 0.01). Except for WG group and QL group, MDA level in the other groups were significantly decreased (< 0.01), and GSH level was significantly decreased (< 0.01).gene expression was significantly increased in all drug-administered groups except WG group (< 0.01), andgene expression was significantly increased in GD group and WGC group (< 0.05, 0.01),gene expression was significantly increased in GD group and GG group (< 0.05, 0.01). Except for QL group, protein expressions of Nrf2 and HO-1 in other groups were significantly increased (< 0.01); Except for WG group and QL group, NQO1 protein expression was significantly increased in the other groups (< 0.05, 0.01), and Nrf2 protein into the nucleus was significantly increased (< 0.05, 0.01).The lack ofhas a negative effect on the inhibition of oxidative stress injury of Caco-2 cells by Gegen Qinlian Decoction.

    Gegen Qinlian Decoction;; compatibility of medicines; oxidative stress; colon cancer cells

    R285.5

    A

    0253 - 2670(2022)20 - 6492 - 08

    10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.021

    2022-07-15

    上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(19ZR1451900)

    林 川,男,碩士研究生,從事藥物分析與體內(nèi)過程研究。Tel: 19821726781 E-mail: 3325892608@qq.com

    安 叡,女,博士,教授,從事藥物分析與體內(nèi)過程研究。Tel: (021)51322183 E-mail: anruimw@126.com

    [責(zé)任編輯 李亞楠]

    猜你喜歡
    連湯葛根芩葛根
    The role of intestinal flora on tumorigenesis, progression,and the efficacy of PD-1/PD-L1 antibodies in colorectal cancer
    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討葛根芩連湯治療放射性腸炎的作用機(jī)制
    藥食兩用話葛根
    頸椎病良方葛根湯
    葛根芩連丸UPLC指紋圖譜建立及7種成分測(cè)定
    中成藥(2018年5期)2018-06-06 03:11:53
    Self-Consistent Sources Extensions of Modified Differential-Difference KP Equation?
    葛根芩連湯治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展※
    葛根芩連湯治療腹瀉的相關(guān)研究
    父子吃貨
    葛根芩連湯及其加減方治療小兒腹瀉的統(tǒng)計(jì)分析
    欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲精品成人久久久久久| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 午夜福利18| 久久久久久伊人网av| 99国产极品粉嫩在线观看| 99热只有精品国产| 大型黄色视频在线免费观看| 无遮挡黄片免费观看| 精品人妻1区二区| 日韩欧美在线乱码| 国产综合懂色| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产精品一区www在线观看 | 精品久久久久久久久亚洲 | 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费观看在线日韩| 国产黄片美女视频| 国产黄片美女视频| 欧美精品啪啪一区二区三区| 亚洲无线观看免费| 国产av在哪里看| 国产精品三级大全| 国内精品久久久久久久电影| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 国产成人一区二区在线| 国产精品无大码| 国国产精品蜜臀av免费| 精品一区二区三区视频在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产视频一区二区在线看| 黄片wwwwww| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 久久久久久久久久久丰满 | 我要看日韩黄色一级片| 国产日本99.免费观看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产一区二区在线av高清观看| 国产亚洲精品久久久com| 国产综合懂色| 九九在线视频观看精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 国产淫片久久久久久久久| 男女那种视频在线观看| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 在线观看午夜福利视频| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产精品98久久久久久宅男小说| 99久久中文字幕三级久久日本| 嫩草影院入口| 最近最新中文字幕大全电影3| 白带黄色成豆腐渣| 久久久成人免费电影| 国产精品久久久久久av不卡| 中文在线观看免费www的网站| 精品福利观看| 99热网站在线观看| 一本一本综合久久| 免费观看精品视频网站| 亚洲专区中文字幕在线| 一个人免费在线观看电影| 美女高潮的动态| 中文资源天堂在线| 欧美bdsm另类| 亚洲va在线va天堂va国产| 欧美高清性xxxxhd video| 免费无遮挡裸体视频| 在线观看一区二区三区| 国产成人影院久久av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 又黄又爽又免费观看的视频| 久久精品国产清高在天天线| 成人av在线播放网站| 窝窝影院91人妻| 国产亚洲精品久久久久久毛片| www.色视频.com| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国内精品久久久久精免费| av.在线天堂| 亚州av有码| 禁无遮挡网站| 欧美潮喷喷水| 国产高清视频在线播放一区| 久久久久久国产a免费观看| 国产麻豆成人av免费视频| 99热精品在线国产| 久久人人精品亚洲av| 亚洲av一区综合| 两人在一起打扑克的视频| 国产精品亚洲美女久久久| 此物有八面人人有两片| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲av电影不卡..在线观看| 午夜久久久久精精品| 男人的好看免费观看在线视频| 毛片女人毛片| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美不卡视频在线免费观看| 一区二区三区激情视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 在线观看免费视频日本深夜| 全区人妻精品视频| 国产精品亚洲一级av第二区| 91久久精品电影网| 国产爱豆传媒在线观看| 精品久久久久久,| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 国产免费一级a男人的天堂| 国产精品福利在线免费观看| 天堂√8在线中文| 一个人免费在线观看电影| 乱人视频在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 少妇被粗大猛烈的视频| 久久久久久久精品吃奶| 午夜激情福利司机影院| 午夜爱爱视频在线播放| 午夜老司机福利剧场| 久久久久久久久久久丰满 | 在线观看66精品国产| 成人国产麻豆网| 我要搜黄色片| 国产成人av教育| 成人精品一区二区免费| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人国产一区最新在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美色视频一区免费| 色尼玛亚洲综合影院| 内射极品少妇av片p| 亚洲无线在线观看| 久久亚洲真实| 人妻夜夜爽99麻豆av| 中国美女看黄片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产伦在线观看视频一区| 欧美精品啪啪一区二区三区| av在线蜜桃| 99久久精品热视频| 亚洲最大成人av| 亚洲va在线va天堂va国产| 亚洲av电影不卡..在线观看| 韩国av一区二区三区四区| 欧美一区二区精品小视频在线| 久久久成人免费电影| 亚洲国产精品成人综合色| 韩国av在线不卡| 91在线观看av| 久久国产乱子免费精品| 欧美日韩乱码在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 99热这里只有是精品50| 熟女电影av网| 免费高清视频大片| 乱系列少妇在线播放| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 午夜福利在线在线| 日本免费a在线| 精品日产1卡2卡| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 亚洲精品亚洲一区二区| 淫秽高清视频在线观看| 国产成人av教育| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产高清视频在线播放一区| 深夜a级毛片| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产麻豆成人av免费视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久久久久免费精品人妻一区二区| 一区二区三区高清视频在线| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产三级中文精品| 精华霜和精华液先用哪个| 99在线人妻在线中文字幕| 精品久久久久久久久av| 国产高清有码在线观看视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产美女午夜福利| 久久久久性生活片| 亚洲在线自拍视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品福利观看| 我的老师免费观看完整版| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 五月玫瑰六月丁香| 久久久久久久午夜电影| 欧美一区二区国产精品久久精品| 男人的好看免费观看在线视频| 国产亚洲欧美98| 中国美白少妇内射xxxbb| 日本成人三级电影网站| 亚洲av.av天堂| 日本爱情动作片www.在线观看 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 听说在线观看完整版免费高清| 精品欧美国产一区二区三| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品国产高清国产av| 亚洲av中文av极速乱 | 国产v大片淫在线免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 国产成人一区二区在线| 久久热精品热| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产黄a三级三级三级人| 99在线人妻在线中文字幕| 听说在线观看完整版免费高清| 最新在线观看一区二区三区| 国产久久久一区二区三区| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲精品亚洲一区二区| 99在线人妻在线中文字幕| 亚洲四区av| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 一区二区三区激情视频| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲欧美日韩高清专用| 国产午夜精品论理片| 高清日韩中文字幕在线| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 国产人妻一区二区三区在| 白带黄色成豆腐渣| 天美传媒精品一区二区| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 免费观看的影片在线观看| 在线观看舔阴道视频| 在线免费观看的www视频| 女人被狂操c到高潮| 国产精品一区二区性色av| 日日干狠狠操夜夜爽| 国产探花在线观看一区二区| 国产精品一及| 校园春色视频在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 高清毛片免费观看视频网站| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 色综合站精品国产| 天堂网av新在线| 最新中文字幕久久久久| 成人鲁丝片一二三区免费| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美zozozo另类| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 精品一区二区免费观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产精品无大码| 精品久久久久久久末码| 精品久久久久久久久久久久久| 国产69精品久久久久777片| 国产成人影院久久av| 久久久久国内视频| 国产成人aa在线观看| 成人精品一区二区免费| av福利片在线观看| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产精品福利在线免费观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 中出人妻视频一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲无线观看免费| 热99在线观看视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 老女人水多毛片| 日本黄大片高清| 国产免费av片在线观看野外av| 桃红色精品国产亚洲av| 久久久精品大字幕| 国产黄片美女视频| 一进一出好大好爽视频| 毛片女人毛片| 亚洲av电影不卡..在线观看| 一本精品99久久精品77| 欧美日韩黄片免| 有码 亚洲区| 国内精品宾馆在线| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲真实伦在线观看| 欧美成人a在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 午夜福利高清视频| 国产亚洲91精品色在线| 男女下面进入的视频免费午夜| 男人和女人高潮做爰伦理| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产真实伦视频高清在线观看 | 成人精品一区二区免费| 日韩中字成人| 春色校园在线视频观看| 18+在线观看网站| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99久久精品国产国产毛片| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国国产精品蜜臀av免费| 欧美丝袜亚洲另类 | 欧美成人一区二区免费高清观看| 看片在线看免费视频| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 给我免费播放毛片高清在线观看| 在线观看舔阴道视频| 他把我摸到了高潮在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 日本熟妇午夜| 精品午夜福利在线看| 午夜爱爱视频在线播放| 国产毛片a区久久久久| 中出人妻视频一区二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 热99在线观看视频| 久99久视频精品免费| 国产毛片a区久久久久| 欧美精品国产亚洲| 无人区码免费观看不卡| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久久国产成人精品二区| 欧美三级亚洲精品| 深爱激情五月婷婷| 一本精品99久久精品77| 日日啪夜夜撸| 午夜福利在线观看吧| 又爽又黄a免费视频| 亚洲精品在线观看二区| 嫩草影院入口| 国产精品人妻久久久久久| 国产高清激情床上av| 午夜免费激情av| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品午夜福利在线看| 中出人妻视频一区二区| 日韩欧美 国产精品| 免费人成视频x8x8入口观看| 可以在线观看毛片的网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 人妻少妇偷人精品九色| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 成人特级av手机在线观看| 亚洲不卡免费看| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 日韩在线高清观看一区二区三区 | 简卡轻食公司| 国产黄片美女视频| 日韩强制内射视频| 国产av一区在线观看免费| 此物有八面人人有两片| 久久久久九九精品影院| 国产伦在线观看视频一区| 日韩欧美三级三区| 国产v大片淫在线免费观看| 1000部很黄的大片| 亚洲国产精品成人综合色| 真人做人爱边吃奶动态| 最新中文字幕久久久久| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品不卡国产一区二区三区| 最近视频中文字幕2019在线8| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲av免费高清在线观看| 看免费成人av毛片| 国产成人福利小说| 99久久成人亚洲精品观看| 人人妻人人澡欧美一区二区| 成人无遮挡网站| 欧美激情国产日韩精品一区| 深夜精品福利| 99热这里只有精品一区| 男人舔奶头视频| 国产亚洲精品久久久com| 免费无遮挡裸体视频| 黄色视频,在线免费观看| 中文字幕久久专区| 久久这里只有精品中国| xxxwww97欧美| 国产高潮美女av| 成人无遮挡网站| 日本熟妇午夜| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产在视频线在精品| 亚洲成人中文字幕在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 我要搜黄色片| 免费一级毛片在线播放高清视频| 亚洲综合色惰| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲 国产 在线| 春色校园在线视频观看| 伦理电影大哥的女人| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲三级黄色毛片| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲精品456在线播放app | 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产av一区在线观看免费| 久久国产乱子免费精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 内射极品少妇av片p| 综合色av麻豆| 国产成人a区在线观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 99热这里只有是精品在线观看| 日韩欧美 国产精品| 禁无遮挡网站| 欧美最新免费一区二区三区| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲无线观看免费| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 午夜精品一区二区三区免费看| 免费av毛片视频| 亚洲avbb在线观看| 国产一区二区三区av在线 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 91麻豆av在线| 亚洲自拍偷在线| aaaaa片日本免费| 国内精品美女久久久久久| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲最大成人中文| 我要搜黄色片| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久6这里有精品| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 免费在线观看日本一区| 国产精品人妻久久久影院| 国产大屁股一区二区在线视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美丝袜亚洲另类 | 干丝袜人妻中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 少妇人妻精品综合一区二区 | 最近最新免费中文字幕在线| 欧美日韩综合久久久久久 | 国产精品伦人一区二区| 亚洲专区中文字幕在线| 1024手机看黄色片| 在线天堂最新版资源| 毛片一级片免费看久久久久 | 国产精品av视频在线免费观看| 女人被狂操c到高潮| 国产三级在线视频| 三级毛片av免费| 久久热精品热| 亚洲国产色片| 国产免费一级a男人的天堂| 高清毛片免费观看视频网站| av福利片在线观看| 日本 欧美在线| 一个人看的www免费观看视频| 超碰av人人做人人爽久久| 国产伦一二天堂av在线观看| 黄色视频,在线免费观看| 国产精品不卡视频一区二区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 亚洲av免费在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久久久久伊人网av| 日本在线视频免费播放| 国产主播在线观看一区二区| 老司机福利观看| 欧美日韩精品成人综合77777| 中出人妻视频一区二区| av国产免费在线观看| 久久久国产成人精品二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 久久久国产成人精品二区| 国产精品无大码| 国产69精品久久久久777片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 99热这里只有是精品在线观看| av中文乱码字幕在线| 成年免费大片在线观看| 国产精品福利在线免费观看| 美女高潮的动态| 亚洲欧美日韩无卡精品| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人三级黄色视频| 欧美丝袜亚洲另类 | 久久草成人影院| 精品久久久久久,| 美女高潮的动态| 搡老岳熟女国产| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲美女视频黄频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 久久久精品大字幕| 99在线人妻在线中文字幕| 99久久精品一区二区三区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 成人精品一区二区免费| 日韩强制内射视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲av一区综合| 看免费成人av毛片| 一个人观看的视频www高清免费观看| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品久久国产高清桃花| 中文亚洲av片在线观看爽| 午夜精品在线福利| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日韩人妻高清精品专区| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| av中文乱码字幕在线| 欧美中文日本在线观看视频| 日韩中字成人| 国产av一区在线观看免费| 亚洲自偷自拍三级| 日韩一区二区视频免费看| 丰满乱子伦码专区| 国产成人一区二区在线| 成人午夜高清在线视频| 少妇高潮的动态图| 精品久久久久久久末码| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 亚洲av中文av极速乱 | 黄片wwwwww| 直男gayav资源| 精品国产三级普通话版| 最近最新中文字幕大全电影3| 十八禁网站免费在线| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 黄色视频,在线免费观看| 日本熟妇午夜| 一区二区三区免费毛片| 国产一区二区三区视频了| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲精品在线观看二区| 中出人妻视频一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲天堂国产精品一区在线| 五月玫瑰六月丁香| 看黄色毛片网站| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 少妇高潮的动态图| 男插女下体视频免费在线播放| 久久久久久九九精品二区国产| 久久99热6这里只有精品| 日韩精品有码人妻一区| 十八禁国产超污无遮挡网站| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 久久亚洲真实| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| bbb黄色大片| 亚洲国产精品sss在线观看| 九九爱精品视频在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产精品人妻久久久久久| 欧美激情在线99| 99视频精品全部免费 在线| 成人av在线播放网站| 国产精品福利在线免费观看| 亚洲美女搞黄在线观看 | 免费看美女性在线毛片视频| 免费无遮挡裸体视频| 国内精品宾馆在线| 午夜免费成人在线视频| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲自偷自拍三级| 国产亚洲精品av在线| 免费搜索国产男女视频| 永久网站在线| 亚洲欧美激情综合另类| 少妇丰满av| 黄色欧美视频在线观看| av在线天堂中文字幕| 免费av不卡在线播放| 最近在线观看免费完整版| 国产三级在线视频| 黄色丝袜av网址大全| 欧美性猛交黑人性爽| 婷婷亚洲欧美| 国产淫片久久久久久久久| 日韩欧美精品v在线| 国产在视频线在精品| 成人特级av手机在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 97热精品久久久久久| 亚洲 国产 在线| 亚洲avbb在线观看| 欧美精品国产亚洲| 免费看日本二区| 少妇丰满av| 国产探花在线观看一区二区| 制服丝袜大香蕉在线| 中文亚洲av片在线观看爽| 精品无人区乱码1区二区| 婷婷色综合大香蕉| 亚洲人成网站高清观看| 超碰av人人做人人爽久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲欧美激情综合另类| 久久久久久久久大av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美在线一区亚洲| 我的老师免费观看完整版|