circ_ACAP2 對胃癌細(xì)胞BGC-823 增殖凋亡的影響及作用機制

鄭煒智 劉炳輝 楊繼洲 盛玲玲 付承林

1.臺州市第一人民醫(yī)院病理科，浙江臺州 318020；2.臺州市第一人民醫(yī)院檢驗科，浙江臺州 318020

胃癌在胃腸道惡性腫瘤中較為常見，具有較高發(fā)病率，且發(fā)病較為隱匿，早期檢出率較低，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期，臨床預(yù)后較差。采用放化療對患者治療，可使臨床治療效果得到改善，但因患者對化療藥物具有一定的耐藥性，可增加患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險。環(huán)狀RNA 結(jié)構(gòu)較為保守、穩(wěn)定，且特異性較高，表達(dá)于患者血液、唾液，可用于腫瘤的診斷、評估。環(huán)狀RNA–ACAP2（circular RNA–ACAP2，circ_ACAP2）在直腸癌、乳腺癌中高表達(dá)，且隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移逐漸升高。miRNA 為非編碼RNA，miR–488–3p 為腫瘤抑制因子，低表達(dá)于胃癌患者，其表達(dá)升高可抑制胃癌的發(fā)展。肌成束蛋白（fascin–1，F(xiàn)SCN1）高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，且參與腫瘤的預(yù)后、分期，可對多種腫瘤細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行調(diào)控，并參與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化。因此，本研究分析circ_ACAP2通過調(diào)控miR–488–3p/FSCN1通路對胃癌的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

人胃癌細(xì)胞株（BGC–823）、人胃上皮細(xì)胞（human gastric epithelial cells，GES–1）購自上海機純實業(yè)有限公司；DMEM 完全培養(yǎng)液購自上海西唐生物科技有限公司；四甲基聯(lián)苯胺（Tetramethyl benzidine，TMB）溶液購自上海古朵生物科技有限公司；pcDNA、pccirc_ACAP2、anti–miR–NC、anti–miR–488–3p、si–NC、si–circ_ACAP2、miR–NC、miR–488–3p均購自上海GenePharma 公司；細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、B 細(xì)胞淋巴瘤–2（B–cell lymphoma–2，Bcl–2）、p21、Bcl–2 相關(guān)性蛋白X（Bcl–2–correlation protein X，Bax）、GAPDH 抗體購自上海西唐生物科技有限公司。培養(yǎng)箱（型號：INA–32–8）購自北京乾明基因技術(shù)有限公司；電化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海邦景實業(yè)有限公司；全蛋白提取試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；四甲基偶氮唑鹽（tetramethylazo salt，MTT）試劑盒購自上海西格生物科技有限公司。本研究經(jīng)臺州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：2022–KY001–01）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將GES–1、BGC–823 細(xì)胞放入含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)箱，于37℃ 5%CO、95% N培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)密度達(dá)到80%左右重復(fù)傳代操作。

1.3 檢測方法

1.3.1 circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)水平檢測 提取GES–1、BGC–823 細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real–time polymerase chain reaction，qRT–PCR）法鑒定circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 相對表達(dá)量，采用Primer5.0 軟件設(shè)計引物序列，啟動PCR 儀，反應(yīng)體系：0.04ml 上下游引物、0.02mlcDNA 模板、0.01mlSYBGreen，加蒸餾水至0.02ml。反應(yīng)條件：95℃ 3min、95℃ 15s、60℃40s，72℃ 10min，共進(jìn)行40 個循環(huán)，采用2方法計算出circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 的表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)BGC–823 細(xì)胞，將其接種于6 孔板，細(xì)胞融合至80%時，將si–circ_ACAP2、miR–488–3p、pccirc_ACAP2、anti–miR–488–3p 與陰性對照轉(zhuǎn)染入BGC–823 細(xì)胞，對其進(jìn)行48h 培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞增殖檢測 采用MTT 法檢測細(xì)胞增殖情況，調(diào)整測定細(xì)胞濃度，將其接種于96 孔板中，并在孔板中加入0.2ml 細(xì)胞懸液，放入37℃、5%CO環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，24、48、72h 后加入0.01ml MTT試劑，孵育4h 后采用酶標(biāo)儀對細(xì)胞490nm 處OD 值進(jìn)行測定，并計算增殖率。試驗重復(fù)進(jìn)行5 次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。取各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，采用Annnexin V–FITC 凋亡試劑盒，37℃避光孵育0.5h，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡數(shù)，試驗重復(fù)進(jìn)行5 次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 CyclinD1、Bcl–2、p21、Bax檢測 采用Western blotting 法檢測CyclinD1、Bcl–2、p21、Bax 表達(dá)情況，對所培養(yǎng)的BGC–823 細(xì)胞做離心、蛋白提取，之后收集上清，使用BCA 試劑盒檢測CyclinD1、Bcl–2、p21、Bax 蛋白含量，提取等量蛋白質(zhì)，100℃變性5min，使用凝膠電泳分離，4℃條件下加入一抗孵育過夜，洗滌15min 3 次，加入稀釋好的二抗，孵育2h，洗滌15min 3 次，定量分析蛋白表達(dá)情況。以GAPDH 為內(nèi)參，試驗重復(fù)進(jìn)行5 次，結(jié)果取平均值。

1.3.6 雙螢光素酶報告試驗 采用starBase 網(wǎng)站對circ_ACAP2靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示，circ_ACAP2中含有與miR–488–3p 互補核苷酸序列，包括WT–circ_ACAP2、MUT–circ_ACAP2，將WT–circ_ACAP2、MUT–circ_ACAP2、miR–NC、miR–488–3p 轉(zhuǎn) 入BGC–823 細(xì)胞，進(jìn)行雙螢光素酶檢測。試驗重復(fù)進(jìn)行5 次，結(jié)果取平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)

與GES–1組相比，BGC–823組細(xì)胞中circ_ACAP、FSCN1 表達(dá)水平均升高，miR–488–3p 表達(dá)水平降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見表1。

表1 circ_ACAP2、miR–488–3p、FSCN1 在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)（）

2.2 抑制circ_ACAP2 表達(dá)對BGC–823 細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與si–NC 組相比，si–circ_ACAP2 組circ_ACAP2表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），表明抑制circ_ACAP2 表達(dá)的BGC–823 細(xì)胞株構(gòu)建成功。與si–NC 組相比，si–circ_ACAP2 組CyclinD1、OD值、Bcl–2 降低，p21、Bax 及凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見表2、圖1。

圖1 si–NC 組和si–circ_ACAP2 組相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表2 抑制circ_ACAP2 表達(dá)對BGC–823 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（）

2.3 miR–488–3p 過表達(dá)對BGC–823 細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與miR–NC 組相比，miR–488–3p 組miR–488–3p表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），表明miR–488–3p 過表達(dá)的BGC–823 細(xì)胞株構(gòu)建成功。與miR–NC 組相比，miR–488–3p 組CyclinD1、OD值、Bcl–2 降低，p21、Bax 及凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見表3、圖2。

表3 miR–488–3p 過表達(dá)對BGC–823 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（）

圖2 miR–NC 組和miR–488–3p 組相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 circ_ACAP2 靶向調(diào)控miR–488–3p 表達(dá)

雙螢光素酶報告試驗顯示，與miR–NC 組相比，過表達(dá)miR–488–3p 可使WT–circ_ACAP2 螢光素酶活性降低（＜0.05），對MUT–circ_ACAP2 螢光素酶活性影響較?。ǎ?.05），見表4。

表4 雙螢光素酶報告試驗（）

2.5 抑制miR–488–3p 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制circ_ACAP2對BGC–823 細(xì)胞增殖、凋亡的影響

與si–NC 組相比，抑制circ_ACAP2 表達(dá)可使BGC–823 細(xì)胞中miR–488–3p 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。與si–circ_ACAP2+anti–miR–NC 組相比，si–circ_ACAP2+anti–miR–488–3p 組的CyclinD1、OD 值、Bcl–2 升高，p21、Bax 及凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05），見表5、圖3。

圖3 各組相關(guān)蛋白表達(dá)情況

表5 抑制miR–488–3p 表達(dá)能逆轉(zhuǎn)抑制circ_ACAP2 對BGC–823 細(xì)胞增殖、凋亡的影響（）

3 討論

胃癌在惡性腫瘤中較為常見，可對人類健康、生存造成較大危害，具有較高發(fā)病率和病死率。研究顯示，原癌基因的激活、抑癌基因的失活可導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。放化療可改善早期胃癌患者的治療效果，但對晚期患者療效較差，故尋找新的治療靶點對改善患者治療效果較為重要。

circRNA 為閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性、保守性較高，存在于真核生物中。多項研究顯示，circRNA 在腫瘤中異常表達(dá)，circRNA 可參與腫瘤細(xì)胞的惡性表型，使腫瘤的發(fā)生、發(fā)展受到影響。circ_ACAP2 高表達(dá)于結(jié)直腸癌細(xì)胞株，且參與結(jié)直腸癌的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，隨著淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及分期的增加，腫瘤患者的circ_ACAP2 表達(dá)水平逐漸升高，表明circ_ACAP2可使結(jié)直腸癌的侵襲、轉(zhuǎn)移加快。研究顯示，circ_ACAP2高表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞，可介導(dǎo)miR–29a/b–3p 上調(diào)COL5A1 表達(dá)，在乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常GES–1 細(xì)胞相比較，circ_ACAP2 在胃癌細(xì)胞BGC–823 中表達(dá)升高，且抑制circ_ACAP2 表達(dá)，可減緩癌細(xì)胞增殖能力，并加快其凋亡，表明circ_ACAP2 可能成為胃癌治療的重要靶點。

胃癌的發(fā)生、發(fā)展與多種因素、基因相關(guān)，miRNA 為非編碼RNA，在胃癌的惡性進(jìn)展中作用較為重要，可對胃癌的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)行調(diào)控。研究表明，部分miRNA 高表達(dá)于胃癌細(xì)胞，可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，部分miRNA 低表達(dá)于胃癌細(xì)胞，可抑制腫瘤的發(fā)展。miR–488–3p 在膠質(zhì)瘤、食管鱗癌、肝癌等惡性腫瘤中具有抑癌作用，miR–488 可使真核翻譯起始因子3a 介導(dǎo)的核苷酸剪切修復(fù)信號通路激活，使非小細(xì)胞肺癌的增殖受到抑制，對化療的敏感性降低。本研究發(fā)現(xiàn)，miR–488–3p 低表達(dá)于胃癌細(xì)胞，上調(diào)miR–488–3p 表達(dá)，可使胃癌細(xì)胞增殖能力減弱，增加細(xì)胞的凋亡能力，降低細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移，抑制circ_ACAP2 表達(dá)，可促進(jìn)胃癌細(xì)胞中miR–488–3p 表達(dá)。相關(guān)學(xué)者研究顯示，miR–488低表達(dá)于胃癌細(xì)胞，miR–488–3p 可隨著胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、臨床分期的增高逐漸降低。本研究中miR–488–3p 在胃癌細(xì)胞株BGC–823 中表達(dá)高于正常胃上皮細(xì)胞，表明miR–488–3p 在胃癌發(fā)展中起抑癌基因作用，circ_ACAP2 可通過靶向結(jié)合miR–488–3p，對胃癌細(xì)胞的增殖凋亡造成影響。

miR–488–3p 具有較多靶基因，F(xiàn)SCN1 進(jìn)化較為保守，位于遷移細(xì)胞前緣突起，磷酸化后可調(diào)節(jié)FSCN1 活性，促進(jìn)細(xì)胞表面活性，提高癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)SCN1 高表達(dá)于腫瘤細(xì)胞，且可對腫瘤患者的預(yù)后、分期造成影響，并可影響結(jié)腸癌、卵巢癌的增殖能力。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SCN1 高表達(dá)于胃癌中，circ_ACAP2 可通過與miR–488–3p 結(jié)合，調(diào)控FSCN1 表達(dá)，使胃癌細(xì)胞的增殖受到影響，表明miR–488–3p 可通過靶向FSCN1 發(fā)揮抑癌作用。

綜上所述，circ_ACAP2 在胃癌細(xì)胞中表達(dá)升高，其表達(dá)降低可升高細(xì)胞凋亡率，通過調(diào)控miR–488–3p/FSCN1 通路實現(xiàn)；抑制circ_ACAP2 靶向調(diào)控miR–488–3p/FSCN1 通路，可減緩癌細(xì)胞增殖，加快其凋亡，具有較好的治療效果，有望成為胃癌治療靶點。