營養(yǎng)條件對水虻油脂積累的影響

喬紅皓，王秋晨，武傳良，蔡珉敏，黃 鳳，張吉斌，喻子牛，鄭龍玉

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北 武漢 430070)

亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.,black soldier fly,BSFL)，屬于雙翅目(Diptera)、水虻科(Stratiomyidae)、扁角水虻屬昆蟲[1]。其幼蟲營腐食，具有食量大、抗逆性強(qiáng)、生物轉(zhuǎn)化效率高等特點(diǎn)[1]，能夠?qū)⑿笄菁S便進(jìn)行無害化處理[2]，并資源化形成高質(zhì)量昆蟲蛋白飼料和油脂原料用于開發(fā)生物柴油，為構(gòu)筑新型的綠色、循環(huán)、可持續(xù)產(chǎn)業(yè)體系提供了新思路，具有重要的現(xiàn)實意義[3]。水虻可回收利用廢棄營養(yǎng)，在短時間內(nèi)就能快速合成占生物質(zhì)干重至少35%的油脂[4-6]；前期研究利用水虻油脂開發(fā)了生物柴油，其密度、黏度、閃點(diǎn)和十六烷值等各項指標(biāo)都滿足國際柴油標(biāo)準(zhǔn)(EN14214)[6]。由于水虻具有脂肪含量高、油脂積累快、轉(zhuǎn)化效率高、生長周期短等優(yōu)點(diǎn)，所以從營養(yǎng)層面揭示水虻油脂積累的影響機(jī)制有助于優(yōu)化水虻的生產(chǎn)性能，是實現(xiàn)水虻油脂大量定向積累的重要基礎(chǔ)。

對昆蟲營養(yǎng)條件的研究一般集中在單個營養(yǎng)物質(zhì)(如碳水化合物或蛋白質(zhì))上[7]，也有利用幾何框架(GF)來研究營養(yǎng)物質(zhì)相互作用的影響[8]。對于那些成蟲是非攝食的昆蟲，碳水化合物和蛋白質(zhì)是影響它們生存、生長和繁殖的最重要的營養(yǎng)物質(zhì)[9-10]，因此，碳水化合物和蛋白質(zhì)的比例(C∶P值)是影響這些昆蟲營養(yǎng)條件的一個重要因素。目前，大多數(shù)關(guān)于可消化碳水化合物和蛋白質(zhì)之間的平衡及其對昆蟲性能的影響研究主要集中在蚱蜢、毛蟲、甲蟲幼蟲、蚜蟲和螳螂[11-12]。不同物種由于生活史、發(fā)育甚至性別的不同，其最佳C∶P值也有所不同[11]。具有氮代謝共生菌的昆蟲(如蚜蟲和蟑螂等)對C∶P值的需求最低[13]；繁殖階段的最佳C∶P值不一定適用于生長階段[14]；田間蟋蟀成蟲在高蛋白(C∶P=1∶3)條件下的體重和卵產(chǎn)量達(dá)到最大，雄性和雌性成蟲的壽命分別在C∶P值為3∶1和8∶1時最長[15]；雄性和雌性黑腹果蠅在壽命達(dá)到最長和繁殖最佳時所需的C∶P值也存在很大差異[16]。

營養(yǎng)條件對水虻生長發(fā)育有一定影響[17]，目前，對亮斑扁角水虻營養(yǎng)條件的研究多針對已知成分的天然飲食。2017年，Cammack等[18]研究了人工飼料(C+P=42%)不同C∶P值(1∶5、1∶1、5∶1)對水虻生長特性的影響，發(fā)現(xiàn)在C∶P值為1∶1時存活率最高。飼料中營養(yǎng)物質(zhì)對水虻生長非常重要，即使C∶P值相差很小也會顯著影響水虻的生長特性[19-20]?；诖耍髡咄ㄟ^改變?nèi)斯づ囵B(yǎng)基中碳水化合物和蛋白質(zhì)的含量及C∶P值，探究營養(yǎng)條件對水虻生長發(fā)育和油脂積累的影響，為深入研究水虻油脂積累的影響因素、提升畜禽糞便及餐廚剩余物等有機(jī)廢棄物的資源化利用效率、實現(xiàn)廢棄物向綠色能源的高效轉(zhuǎn)換提供理論支撐，進(jìn)而助力我國未來能源保障[21]。

1 實驗

1.1 材料

水虻種群：亮斑扁角水虻(HermetiaillucensL.)幼蟲，武漢品系，采集武漢野生品種在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物農(nóng)藥國家工程研究中心飼養(yǎng)繁衍馴化得到，種群穩(wěn)定。

人工飼料：將麩皮和小麥次粉以質(zhì)量比1∶1混合，加水?dāng)嚢瑁{(diào)整為相對含水率為65%的基礎(chǔ)飼料，按基礎(chǔ)飼料與碳水化合物質(zhì)量比為1∶ 0.4加入碳水化合物配制成人工飼料。麩皮和小麥次粉均從市場購買。

1.2 人工培養(yǎng)基的配制

在玻璃瓶中加入適量的去離子水、葡萄糖、瓊脂、酵母提取物和無機(jī)鹽，置于微波爐中加熱至瓊脂全部溶解，取出，待溫度下降，加入適量復(fù)合維生素、干酪素、纖維素、膽固醇、亞油酸等，充分?jǐn)嚢?，冷卻后使用。

人工培養(yǎng)基配方：瓊脂2 g、酵母提取物1 g、無機(jī)鹽600 μL、復(fù)合維生素303.33 mg、膽固醇366.67 mg、亞油酸370 μL。其中無機(jī)鹽母液(1000×)配方為：250 g·L-1CaCl2·6H2O 100 μL、2.5 g·L-1CuSO4·5H2O 100 μL、25 g·L-1FeSO4·7H2O 100 μL、250 g·L-1MgSO4100 μL、1 g·L-1MnCl2·4H2O 100 μL、25 g·L-1ZnSO4100 μL，以上試劑均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

改變碳水化合物和蛋白質(zhì)的含量，按表1配制不同C∶P值的人工培養(yǎng)基。

1.3 實驗水虻的飼養(yǎng)

首先用收卵盒收集新鮮的水虻蟲卵，然后放入孵化盆，在收卵盒上方蓋上一層濕潤的雙層紗布同時在孵化盆上方覆蓋雙層紗布；大約3～5 d后，收集水虻幼蟲轉(zhuǎn)移到塑料盆中，加入人工飼料，用雙層紗布封住塑料盆口，置于溫度為(28±2) ℃、相對濕度為60%的溫室中飼養(yǎng)，每天根據(jù)幼蟲的進(jìn)食情況添加人工飼料，直至6～8日齡，備用。

表1 不同C∶P值的人工培養(yǎng)基配方

1.4 粗脂肪的測定

稱取烘干的水虻蟲粉(m0，約1～5 g)，用濾紙包裹后置于(105±2) ℃烘箱中烘至恒重(m1)；取出，放入索氏提取器的提取管中，在平底燒瓶中加入100 mL石油醚和玻璃珠，連接儀器各部分，并接入水管，通入冷凝水，用一小團(tuán)脫脂棉塞入冷凝管中，調(diào)節(jié)水浴溫度為70～80 ℃，提取至管內(nèi)的濾紙上無油滴為止；然后用長鑷子取出，置于通風(fēng)處30 min使石油醚揮發(fā)；再置于(105±2) ℃烘箱中烘至恒重(m2)。按下式計算水虻的粗脂肪含量(%)：

1.5 三酰甘油的測定

稱取適量新鮮水虻幼蟲，按料液比1∶9(g∶mL)加入無水乙醇，冰水浴條件下機(jī)械勻漿，2 500 r·min-1離心10 min，取上清液。在96孔板中的空白孔中加入蒸餾水2.5 μL、工作液 250 μL；在標(biāo)準(zhǔn)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品2.5 μL、工作液250 μL；在樣品孔中加入上清液2.5 μL、工作液250 μL。參照甘油三酯測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明書測定三酰甘油含量。

1.6 粗蛋白的測定

采用凱氏定氮法測定粗蛋白含量。稱取1 g左右水虻蟲粉，加入一片凱氏定氮催化片、10 mL濃H2SO4進(jìn)行加熱消化，然后用K9840型海能自動凱氏定氮儀測定水虻氮含量，進(jìn)而計算水虻粗蛋白含量。消化程序為：240 ℃，1 h；420 ℃，2 h；冷卻至室溫。

1.7 脂肪體的染色和觀察

選取新鮮老熟水虻幼蟲少許，挑取脂肪體，用1×PBS輕輕漂洗3次，置于4%多聚甲醛中固定30 min；再用1×PBS輕輕漂洗3次，每次5 min；將脂肪體轉(zhuǎn)入工作濃度為1 μg·mL-1的Nile-Red染液中，室溫避光孵育10 min；再用1×PBS輕輕漂洗3次，每次5 min，避光操作；將脂肪體轉(zhuǎn)入工作濃度為1 μg·mL-1的DAPI染液中，室溫避光孵育10 min；再用1×PBS輕輕漂洗3次，每次5 min，避光操作。

將染色后的脂肪體置于載玻片上，加10 μL抗熒光猝滅封片劑，輕輕蓋上載玻片后用指甲油進(jìn)行封片，置于避光的組織孵育盒中；在尼康STORM超分辨共聚焦顯微鏡下觀察熒光信號，并拍攝照片。藍(lán)色信號代表細(xì)胞核，紅色信號代表脂滴，激光波長分別為405 nm和561 nm。利用尼康共聚焦軟件統(tǒng)計分析脂肪體脂滴的直徑。脂類物質(zhì)以脂滴形式主要分布在脂肪體中，脂滴直徑和熒光強(qiáng)度與脂肪體中的脂質(zhì)含量呈正相關(guān)關(guān)系。

1.8 脂肪酸相對含量的測定

稱取水虻蟲粉0.1～10 g(精確至0.1 mg，約含粗脂肪100～200 mg)，置于250 mL平底燒瓶中，加入25 mL石油醚，浸提；提取完畢，將平底燒瓶中的液體移至分液漏斗中，用50 mL石油醚沖洗燒瓶，沖洗液并入分液漏斗中，加蓋，振蕩5 min，靜置10 min；將醚層提取液并入到250 mL平底燒瓶中，按以上步驟重復(fù)提取3次，最后用石油醚沖洗分液漏斗，并入到250 mL平底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干，殘留物即為水虻脂肪提取物。

在脂肪提取物中加入2%氫氧化鈉甲醇溶液8 mL，連接回流冷凝器，(80±1) ℃水浴回流，直至油滴消失；從回流冷凝器上端加入7 mL 15%三氟化硼甲醇溶液，(80±1) ℃水浴繼續(xù)回流2 min；用少量水沖洗回流冷凝器；停止加熱，取下平底燒瓶，迅速冷卻至室溫；加入10～30 mL正庚烷，振搖2 min；加入飽和氯化鈉水溶液，靜置分層；吸取上層正庚烷提取液約5 mL，移至25 mL試管中，加入3～5 g無水硫酸鈉，振搖1 min，靜置5 min，取上層溶液于進(jìn)樣瓶中，按色譜條件測定水虻脂肪酸相對含量。

色譜條件：強(qiáng)極性毛細(xì)管色譜柱DB-WAX(20 m×0.18 mm，0.18 μm);進(jìn)樣器溫度270 ℃，檢測器溫度280 ℃;程序升溫：初始溫度100 ℃，保持6 min；100～180 ℃，升溫速率10 ℃·min-1，保持6 min；180～200 ℃，升溫速率1 ℃·min-1，保持20 min；200～230 ℃，升溫速率4 ℃·min-1，保持10.5 min;載氣為氮?dú)猓至鞅?00∶1，進(jìn)樣量10 μL。檢測條件應(yīng)滿足理論塔板數(shù)(n)至少2 000，分離度(R)至少1.25。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳水化合物對水虻預(yù)蛹體重和粗脂肪含量的影響

分別以葡萄糖、果糖、麥芽糖、淀粉為碳水化合物，加入到基礎(chǔ)飼料中飼養(yǎng)水虻，考察不同碳水化合物對水虻預(yù)蛹體重和粗脂肪含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同碳水化合物對水虻預(yù)蛹體重和粗脂肪含量的影響Fig.1 Effect of different carbohydrates on prepupa weight and crude fat content of BSFL

由圖1可知，與對照組相比，在基礎(chǔ)飼料中加入葡萄糖、果糖、麥芽糖時水虻預(yù)蛹體重增加，加入淀粉時預(yù)蛹體重變化不大；且加入葡萄糖時的預(yù)蛹體重最重，達(dá)到了(0.256±0.010) g，明顯高于對照組(0.226±0.009) g和淀粉組(0.230±0.004) g。與對照組相比，在基礎(chǔ)飼料中加入葡萄糖、果糖、麥芽糖時水虻粗脂肪含量增加，分別為40.0%±1.0%、40.4%±0.4%、40.1%±0.1%；而加入淀粉時水虻粗脂肪含量(34.1%±0.4%)與對照組(34.2%±0.6%)相差不大，遠(yuǎn)低于加入葡萄糖、果糖、麥芽糖時的粗脂肪含量。故，選取葡萄糖作為人工培養(yǎng)基的碳源進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.2 不同C∶P值對水虻粗脂肪、三酰甘油和粗蛋白含量的影響

以葡萄糖為碳源配制不同C∶P值的人工培養(yǎng)基飼養(yǎng)水虻，測定水虻粗脂肪和三酰甘油的含量，繪制碳水化合物含量與蛋白質(zhì)含量交互作用對水虻粗脂肪、三酰甘油和粗蛋白含量影響的響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖2所示。

圖2 碳水化合物含量與蛋白質(zhì)含量交互作用對水虻粗脂肪含量(a)、三酰甘油含量(b)、粗蛋白含量(c)影響的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surface plots for effect of interaction between carbohydrate content and protein content on crude fat content(a)，triacylglycerol content(b),and crude protein content(c) of BSFL

由圖2a可知，在低碳水化合物(C<50%)條件下，水虻粗脂肪含量隨人工培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量的增加逐漸增加；在高碳水化合物(C≥50%)條件下，粗脂肪含量主要受到碳水化合物含量的影響，蛋白質(zhì)含量對粗脂肪含量影響不大，如在碳水化合物含量為50%時，蛋白質(zhì)含量分別為25%、50%時的粗脂肪含量分別為40.4%±0.6%、38.9%±0.1%，相差不大。在低營養(yǎng)低碳水化合物(C+P=25%，C∶P=1∶4)條件下，粗脂肪含量為20.8%±0.3%；而在高營養(yǎng)高碳水化合物(C+P=100%,C∶P=4∶1)條件下，粗脂肪含量為52.1%±0.6%。

由圖2b可知，在低碳水化合物條件下，增加蛋白質(zhì)含量，水虻三酰甘油含量相應(yīng)增加；在高碳水化合物條件下，增加蛋白質(zhì)含量，三酰甘油含量相應(yīng)減少，而且?guī)缀醪皇芴妓衔锖吭黾拥挠绊?。在低營養(yǎng)(C+P=25%)、C∶P值為1∶2的條件下，三酰甘油含量最低，為(162.090±6.907) mmol·L-1；而在高營養(yǎng)(C+P=75%)、C∶P值為4∶1的條件下，三酰甘油含量最高，為(272.091±5.731) mmol·L-1。

由圖2c可知，在蛋白質(zhì)含量相同的情況下，水虻粗蛋白含量隨碳水化合物含量的變化趨勢與粗脂肪含量的變化趨勢(圖2a)相反。在低碳水化合物條件下，水虻粗蛋白含量隨人工培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量的增加逐漸增加；在高碳水化合物條件下，蛋白質(zhì)含量對粗蛋白含量影響較小。本實驗條件下，水虻粗蛋白含量最高可達(dá)到51.2%±0.2%，最低為35.6%±0.5%。

碳水化合物含量與蛋白質(zhì)含量交互作用對水虻粗脂肪含量和粗蛋白含量影響的方差分析見表2。

表2 碳水化合物含量與蛋白質(zhì)含量交互作用對水虻粗脂肪含量和粗蛋白含量影響的方差分析(F=1,df=59)

2.3 不同C∶P值對水虻脂肪體脂滴的影響

脂滴是細(xì)胞內(nèi)中性脂肪(neutral lipids)的主要貯存場所，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、植物以及動物細(xì)胞中。脂滴直徑能夠一定程度上反映水虻的脂肪積累情況。分別在低營養(yǎng)低碳水化合物(C+P=25%，C∶P=1∶4)、低營養(yǎng)高碳水化合物(C+P=25%，C∶P=4∶1)、高營養(yǎng)低碳水化合物(C+P=100%，C∶P=1∶4)、高營養(yǎng)高碳水化合物(C+P=100%，C∶P=4∶1)等4種營養(yǎng)條件下飼養(yǎng)水虻，在STORM超分辨共聚焦顯微鏡下觀察水虻脂肪體脂滴形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。

a.C+P=25%，C∶P=1∶4 b.C+P=25%，C∶P=4∶1

水虻脂肪體脂滴(紅色)和細(xì)胞核(藍(lán)色)的染色情況可以直觀反映水虻脂肪積累情況。由圖3可知，在C+P=25%、C∶P=1∶4條件下，水虻脂肪體脂滴幾乎不可見，熒光強(qiáng)度低，黑色區(qū)域面積大，說明在低營養(yǎng)低碳水化合物營養(yǎng)條件下水虻幾乎不積累脂肪；在C+P=25%、C∶P=4∶1條件下，可以看見少許的脂滴；在C+P=100%、C∶P=1∶4條件下，脂滴較為密集；而在C+P=100%、C∶P=4∶1條件下，脂滴明顯增多、增大，熒光強(qiáng)度高。表明，高營養(yǎng)高碳水化合物營養(yǎng)條件下，由于高碳水化合物的存在，水虻可以積累較多的脂肪。在C+P=25%、C∶P=1∶4，C+P=25%、C∶P=4∶1，C+P=100%、C∶P=1∶4，C+P=100%、C∶P=4∶1營養(yǎng)條件下，水虻的粗脂肪含量分別為20.8%±0.3%、25.3%±0.6%、34.1%±0.3%、52.1%±0.6%。

2.4 不同C∶P值對水虻脂肪酸相對含量的影響

在不同營養(yǎng)條件下飼養(yǎng)水虻，采用GC-MS測定水虻的脂肪酸相對含量，結(jié)果見表3。

表3 不同營養(yǎng)條件下水虻的脂肪酸相對含量/%

由表3可知，在水虻中共檢測到10種脂肪酸，其中月桂酸、棕櫚酸、油酸是主要的脂肪酸，它們的相對含量較高，且?guī)缀醪皇苋斯づ囵B(yǎng)基營養(yǎng)濃度和C∶P值的影響。月桂酸作為一種中鏈脂肪酸對包括金黃色葡萄球菌、幽門螺旋桿菌等多種病原菌有殺滅作用，不僅可以作為動物日糧中常規(guī)的能量來源替代品，而且能夠替代用于預(yù)防和管理胃腸道疾病的飼料抗生素；棕櫚酸屬于飽和脂肪酸；油酸屬于單不飽和脂肪酸，具有降血糖、調(diào)血脂、降膽固醇、保護(hù)心臟等作用。棕櫚酸+油酸組合代替月桂酸+肉豆蔻酸組合可能具有治療血栓的作用。提高人工培養(yǎng)基的營養(yǎng)濃度可以增加十三烷酸的相對含量，但肉豆蔻酸、十五烷酸、十七碳烯酸、硬脂酸的相對含量則減少，特別是肉豆蔻酸，在人工培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度較低(C+P=25%)的情況下，相對含量為10.0%左右，而在營養(yǎng)濃度較高(C+P=100%)的情況下，幾乎檢測不到肉豆蔻酸。

2.5 不同C∶P值對水虻其它指標(biāo)的影響

以不同C∶P值的人工培養(yǎng)基飼養(yǎng)水虻，測定水虻的存活率、單重及干物質(zhì)量，結(jié)果見表4。

表4 不同營養(yǎng)條件下水虻的存活率、單重及干物質(zhì)量

由表4可知，以不同營養(yǎng)濃度、不同C∶P值的人工培養(yǎng)基飼養(yǎng)水虻，水虻的存活率均在90%以上，表明水虻的抗逆性較強(qiáng)，能夠適應(yīng)不同的生活環(huán)境。在低營養(yǎng)濃度(25%)下，隨著人工培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量的增加，水虻的單重和干物質(zhì)量整體逐漸增加；在高營養(yǎng)濃度(100%)下，隨著人工培養(yǎng)基中碳水化合物含量的增加，水虻的單重和干物質(zhì)量整體逐漸增加。實驗還發(fā)現(xiàn)，隨著人工培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度的升高，水虻到預(yù)蛹的時間也會延長。

3 結(jié)論

通過測定水虻預(yù)蛹體重、粗脂肪含量、三酰甘油含量、粗蛋白含量、脂滴形態(tài)、脂肪酸相對含量，研究了水虻在不同營養(yǎng)條件下的脂肪積累情況。結(jié)果表明：(1)葡萄糖、果糖、麥芽糖均能促進(jìn)水虻粗脂肪的積累，粗脂肪含量分別達(dá)到40.0%±1.0%、40.4%±0.4%、 40.1%±0.1%。(2)響應(yīng)面分析表明，在低碳水化合物(C<50%)條件下，增加人工培養(yǎng)基中蛋白質(zhì)含量能夠促進(jìn)水虻粗脂肪的積累；在高碳水化合物(C≥50%)條件下，水虻粗脂肪的積累主要受到碳水化合物含量的影響；當(dāng)C+P=100%、C∶P=4∶1時，水虻粗脂肪含量達(dá)到52.1%±0.6%；當(dāng)C+P=25%、C∶P=1∶4時，水虻粗脂肪含量則降至20.8%±0.3%;不同營養(yǎng)條件下，水虻粗蛋白與粗脂肪的積累趨勢相反。(3)水虻脂肪的積累同樣會影響其體內(nèi)脂肪酸的相對含量。月桂酸、棕櫚酸、油酸是水虻生物質(zhì)衍生的主要脂肪酸，其相對含量幾乎不受人工培養(yǎng)基營養(yǎng)濃度和C∶P值的影響。營養(yǎng)濃度的提高會使十三烷酸的相對含量增加，使肉豆蔻酸、十五烷酸、十七碳烯酸、硬脂酸的相對含量減少。特別是肉豆蔻酸，在營養(yǎng)濃度較低時，肉豆蔻酸的相對含量為10.0%左右；而在營養(yǎng)濃度較高時，幾乎檢測不到肉豆蔻酸。本研究為水虻脂肪的高效積累提供了一定的理論基礎(chǔ)。