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    舒肝和絡(luò)醒脾方對肝纖維化模型大鼠肝組織Wnt/β-Catenin信號通路的影響

    2022-10-19 03:03:44王奎淞張秋菊魏書瑤殷世鵬李婕妠陳世玉郭嘉琪趙鯤鵬
    臨床肝膽病雜志 2022年10期
    關(guān)鍵詞:薊賓低劑量批號

    王奎淞, 張秋菊, 魏書瑤, 殷世鵬, 李婕妠, 陳世玉, 郭嘉琪, 趙鯤鵬

    甘肅中醫(yī)藥大學(xué) a.中醫(yī)臨床學(xué)院, b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院, c.公共衛(wèi)生學(xué)院, d.圖書館古籍部, 蘭州 730000

    肝纖維化是各種慢性肝損傷導(dǎo)致的肝內(nèi)膠原纖維異常增生的病理過程,是多種慢性肝病發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。由于其形成機(jī)制十分復(fù)雜,目前在臨床上尚無理想的、公認(rèn)的抗纖維化特效藥物[1]。中藥復(fù)方湯劑具有經(jīng)多靶點、多途徑發(fā)揮作用的特點,在抗肝纖維化治療中具有獨特優(yōu)勢。甘肅省國醫(yī)大師周信有教授將肝纖維化“細(xì)胞外基質(zhì)沉積(肝損傷)-肝纖維化特征性改變(纖維化)-大量假小葉形成(肝硬化)”過程提煉為中醫(yī)學(xué)“絡(luò)脈瘀滯-微小癥積-癥積形成”理論,提出“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說,并基于此結(jié)合臨床驗效擬舒肝和絡(luò)醒脾方,具有舒肝醒脾、祛瘀活絡(luò)、益氣養(yǎng)血之功效[2]。

    Wnt/β-Catenin是具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化功能的Wnt家族經(jīng)典蛋白信號通路,當(dāng)該信號通路被激活后,可以調(diào)節(jié)許多器官的纖維化發(fā)展過程,與肝纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。且該通路Wnt1/β-Catenin/Cyclin D1導(dǎo)致肝纖維化形成的機(jī)理與“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說不謀而合。故本研究旨在觀察舒肝和絡(luò)醒脾方對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的治療作用,并探討其是否通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路發(fā)揮影響,驗證“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的科學(xué)性,并為該復(fù)方的臨床應(yīng)用提供實驗數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 動物 雄性6周齡SPF級Wistar大鼠60只,體質(zhì)量(200±20)g,飼養(yǎng)于室溫20~25 ℃,濕度50%~65%的12 h光暗循環(huán)環(huán)境,自由進(jìn)食和飲水,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證編號:SCXK(甘)2020-0001,實驗動物使用許可證編號:SYXK(甘)2020-0009。

    1.1.2 藥物及制備 舒肝和絡(luò)醒脾方組成:醋柴胡10 g、岷當(dāng)歸15 g、炙黃芪12 g、莪術(shù)12 g、鱉甲10 g、枳椇子10 g,購于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。灌胃藥劑采用水提法將各單味藥物按臨床用藥比例混合制備:(1)加5倍量水不浸泡,回流提取0.5 h,趁熱過濾;(2)藥渣再加4倍量水回流提取0.5 h,趁熱過濾,并將濾液合并;(3)高劑量組濃縮至每1 mL含生藥1.24 g,低劑量組稀釋至每1 mL含生藥0.31 g[4]。陽性對照組藥物選用水飛薊賓葡甲胺片(江蘇中興藥業(yè)有限公司,批號:H32026145,0.5 mg/片)。

    1.1.3 試劑及耗材 食用玉米油(上海益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司,生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)號:SC10161048100337);CCl4分析純(恒興試劑,批號:20120211);HE染色試劑盒(Solarbio,批號:G1120);Masson染色試劑盒(Solarbio,批號:G1343);RIPA裂解液(Solarbio,批號:20200730);BCA試劑盒(Solarbio,批號:20200817);羥脯氨酸(HYP)堿水解法檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號A030-2-1);AST、ALT、Alb和總蛋白使用全自動生化儀配套試劑檢測(ROCHE,批號:56902901,57938901,57927501,57378001);Wnt1兔抗單克隆抗體(GeneTex,批號:GTX105955);β-Catenin兔抗單克隆抗體(GeneTex,批號:GTX101435);Cyclin D1兔抗單克隆抗體(GeneTex,批號:GTX108624);GAPDH兔抗多克隆抗體(ImmunoWay,批號:YM3215);ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒(YEASEN,批號:S2018081);RNA純化試劑盒(TaKaRa,批號:9767);熒光定量試劑盒(TaKaRa,批號:RR820A);反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,批號:RR047A)。

    1.1.4 主要儀器 全自動組織脫水切片機(jī)(Leica Biosystems,CM3050S);顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(OLYMPUS,BX53);全自動生化分析儀(ROCHE,COBAS C311);實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Bio-Rad,CFX96);電泳儀(BIO-RAD,041BR 109973);全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(Bio-Rad,Trans-Blot Turbo);全能型成像系統(tǒng)(Bio-Rad ,Chemi Doc MP);酶標(biāo)儀(Bio-Rad,Mark1509),精密電子天平(OHAUS,AR224CN)。

    1.2 動物分組、造模及藥物干預(yù) 60只Wistar大鼠使用簡單隨機(jī)化分組法分為空白對照組、模型組、陽性對照組和舒肝和絡(luò)醒脾方高、中、低劑量組6組,每組10只。分組法如下操作:(1)將60只大鼠從1~60編號;(2)繪制隨機(jī)數(shù)字表,從數(shù)字表中任意數(shù)字開始,以同一方向順序得到每只大鼠的隨機(jī)數(shù)字;(3)隨機(jī)數(shù)除以組數(shù)求余數(shù),整除則余數(shù)取組數(shù);(4)按余數(shù)分組;(5)調(diào)整[5]。分組后,除正常對照組外,其余各組均腹腔注射1.0 mL/kg的40%CCl4玉米油溶液,每周2次,持續(xù)8周[6]。肝纖維大鼠模型成功的標(biāo)志為:肝組織HE切片能觀察到明顯纖維間隔形成[7]??瞻讓φ战M和模型組給予10 mL/kg生理鹽水灌胃,陽性對照組用水飛薊賓葡甲胺溶液50 mg/kg灌胃,舒肝和絡(luò)醒脾方高、中、低劑量組分別按12.42 g/kg、6.21 g/kg和3.11 g/kg(生藥/體質(zhì)量)灌胃,每日1次,持續(xù)8周。給藥量計算方法參照《實驗藥理方法學(xué)》[8],大鼠劑量=人臨床劑量/70 kg×6.3。末次給藥后次日,大鼠以45 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉。腹主動脈穿刺取血后,離心取血清,-80 ℃保存?zhèn)溆谩S诟斡胰~切取肝組織(1 cm×1 cm×1 cm)浸于4%多聚甲醛固定液中做預(yù)切片處理;取肝左葉組織(1 cm×1 cm×1 cm)用于提取總蛋白和總RNA。

    1.3 研究方法

    1.3.1 大鼠生理狀況的觀察 每日觀察大鼠生長、進(jìn)食、飲水、毛色、糞便、尿量及顏色、活動、死亡情況。使用精密電子天平每周稱量并記錄各大鼠體質(zhì)量。

    1.3.2 血液學(xué)指標(biāo)檢測 取大鼠腹主動脈血血清用堿水解比色法檢測大鼠血清中HYP含量,于全自動生化分析儀檢測大鼠AST、ALT、總蛋白、Alb指標(biāo)水平。

    1.3.3 肝組織病理學(xué)觀察 取甲醛固定的部分肝臟脫水、石蠟包埋、切片后做常規(guī)HE染色與Masson染色。常規(guī)HE染色評估采用鏡下觀察方法,每張切片選取3個不同視野,觀察纖維化程度,綜合參考臨床肝炎分級和肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)對肝臟損傷程度進(jìn)行評分,評分越高代表肝纖維化程度越嚴(yán)重(表1)[1]。

    表1 慢性肝炎分級和肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn)

    Masson染色切片評估采用膠原容積分?jǐn)?shù)半定量分析法。每張切片選取3個不同視野,使用Image-pro Plus 6.0軟件選取相同的綠色作為判斷所有照片膠原纖維的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),分析得出膠原纖維占整個組織面積的比率即膠原纖維的面積百分比(%)[9]。

    1.3.4 RT-qPCR法檢測肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA的表達(dá) 取肝組織100 mg,液氮速凍后研磨,使用RNA純化試劑盒提取總RNA,RT-q PCR檢測Wnt1,β-Catenin和Cyclin D1的mRNA水平。取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板,按qPCR試劑盒說明書擴(kuò)增。根據(jù) qPCR所得的Ct值,以β-actin為內(nèi)參計算2-ΔΔCt,計算結(jié)果以空白對照組表達(dá)水平進(jìn)行歸一化處理。PCR引物由北京擎科生物科技有限公司設(shè)計合成(表2)。

    1.3.5 Western blot法檢測肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1蛋白的表達(dá) 取肝組織100 mg,粗剪碎加入RIPA裂解液,經(jīng)4 ℃低溫高速離心機(jī)12 000 r/min,30 min離心后取上清液進(jìn)行BCA法蛋白濃度測定以計算上樣量后加入4×loading buffer 上樣緩沖液,使用振蕩恒溫金屬浴100 ℃煮沸10 min變性。根據(jù)Western blot標(biāo)準(zhǔn)操作步驟依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉,分別孵育Wnt1(1∶2000)、β-Catenin(1∶2000)、Cyclin D1(1∶2000)和內(nèi)參蛋白GAPDH(1∶2000),ECL發(fā)光顯影,凝膠成像,使用Image J與GraphPad Prism 9.0軟件進(jìn)行Wnt1、β-Catenin、Cyclin D1及GAPDH 顯影條帶的相對灰度值分析。

    表2 PCR引物列表

    2 結(jié)果

    2.1 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠生理狀況的影響 造模過程中,空白組大鼠無死亡,余10只;模型組死亡4只,余6只;陽性對照組死亡1只,余9只;舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組死亡1只,余9只;舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組死亡2只,余8只;舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組死亡3只,余7只。經(jīng)觀察,空白對照組大鼠,體質(zhì)量正常,皮毛光澤,食量正常,活動靈敏,健康狀況良好。模型組大鼠明顯消瘦,體質(zhì)量減輕,毛色暗淡,精神不佳,進(jìn)食進(jìn)水少,糞便溏稀,尿色發(fā)黃。陽性對照組與舒肝和絡(luò)醒脾方組大鼠精神狀態(tài)尚可,活動度有所增加,反應(yīng)較快,進(jìn)食、飲水、毛色、糞便、尿量及皮毛光澤度有所改善,其中舒肝和絡(luò)醒脾方高、中劑量組效果較為明顯。

    2.2 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠肝組織血液學(xué)指標(biāo)的影響

    與空白對照組比較,模型組大鼠血清中HYP、ALT、AST和Glo水平顯著升高(P值均<0.05),總蛋白、Alb和Alb/Glo(A/G)水平明顯降低(P值均<0.05),提示造模成功。與模型組比較,陽性對照組和舒肝和絡(luò)醒脾方干預(yù)后大鼠血清中HYP、ALT、AST和Glo水平顯著降低(P值均<0.05),總蛋白、Alb和A/G水平明顯升高(P值均<0.05);與陽性對照組比較,舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組的ALT、 AST水平顯著升高(P值均<0.05),總蛋白、Alb和A/G水平明顯降低(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示,舒肝和絡(luò)醒脾方和水飛薊賓葡甲胺對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠的肝損傷具有保護(hù)作用,對大鼠的膠原蛋白分解代謝功能具有促進(jìn)作用,且提示水飛薊賓葡甲胺效果比舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量顯著,但舒肝和絡(luò)醒脾方高、中劑量效果與水飛薊賓葡甲胺基本等效(表3、4)。

    2.3 舒肝和絡(luò)醒脾方對肝臟病理學(xué)結(jié)構(gòu)變化的影響及肝損傷程度評分 HE染色顯示:空白對照組大鼠肝臟分為6葉,色暗紅,邊角銳利,質(zhì)地柔軟;肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝索及肝竇圍繞中央靜脈呈放射狀排列;模型組大鼠肝臟顏色變淺,邊角變鈍,質(zhì)地變韌,并出現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié),可見門靜脈中度纖維化伴大量纖維間隔,肝小葉內(nèi)纖維結(jié)締組織彌漫增生形成纖維間隔,小葉周圍及匯管區(qū)可見變性壞死的肝細(xì)胞,形成假小葉;與模型組比較,各用藥組大鼠肝臟纖維結(jié)締組織增生、分割明顯減輕,肝小葉輪廓相對清晰,肝細(xì)胞變性壞死程度減輕,肝臟形態(tài)、顏色和質(zhì)地接近正常;陽性對照組可見門靜脈輕度纖維化伴少量纖維間隔,肝細(xì)胞輕微脂肪變;舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組可見明顯門靜脈纖維化伴少量纖維間隔;舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組可見少量門靜脈輕微纖維化;舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組未觀察到明顯異常(圖1,表5)。Masson染色顯示:空白對照組僅匯管區(qū)血管有少量膠原沉積;模型組肝組織門靜脈中度纖維化伴大量纖維間隔,匯管區(qū)可見明顯纖維間隔,肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,并形成假小葉,膠原沉積顯著增多(P<0.05);與模型組比較,舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組雖然能有效減少膠原沉積(P<0.05),但仍可觀察到明顯的門靜脈纖維化伴少量纖維間隔和假小葉,其余各藥物干預(yù)組纖維化程度均明顯減輕,膠原沉積顯著減少(P<0.05);與陽性對照組比較,舒肝和洛醒脾方高劑量組膠原沉積的治療效果方面優(yōu)于水飛薊賓葡甲胺組舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量組(P值均<0.05),與舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組基本等效(圖2,表6)。上述結(jié)果提示,舒肝和絡(luò)醒脾方能夠明顯改善肝纖維化大鼠肝組織病理改變及纖維化程度。舒肝和絡(luò)醒脾和低劑量具有輕微藥效作用,舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量和水飛薊賓葡甲胺具有一定治療作用,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量具有明顯藥效作用。

    2.4 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA水平的影響 與空白對照組比較,模型組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1mRNA表達(dá)水平顯著升高(P值均<0.05);與模型組比較,各藥物治療組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1 mRNA的水平顯著降低(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示,水飛薊賓葡甲胺和舒肝和絡(luò)醒脾方對于調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路的關(guān)鍵配體Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA表達(dá)水平有顯著作用,且各藥物治療組效果無明顯差異(表7)。

    表3 各組HYP、ALT、AST表達(dá)水平比較

    表4 各組TP、Alb、Glo和A/G表達(dá)水平比較

    注:a,正常對照組;b,模型組;c,陽性對照組;d,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組;e,舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組;f,舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組。

    注:a,正常對照組;b,模型組;c,陽性對照組;d,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組;e,舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組;f,舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組。

    2.5 舒肝和絡(luò)醒脾方對大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin、Cyclin D1蛋白表達(dá)的影響 Western blot 結(jié)果顯示,與空白對照組比較,模型組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平均顯著升高(P值均<0.05);與模型組比較,除舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組外,其余各治療組肝組織中Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P值均<0.05);與陽性對照組比較,舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量組在β-Catenin蛋白水平表達(dá)上顯著升高(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示,水飛薊賓葡甲胺和舒肝和絡(luò)醒脾方高、中劑量能夠抑制CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠Wnt/β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的蛋白表達(dá)水平,且提示水飛薊賓葡甲胺與舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量對于該通路關(guān)鍵蛋白 β-Catenin調(diào)控作用優(yōu)于舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量(圖3,表8)。

    表5 各組HE染色切片分級及評分

    表6 各組Masson染色切片肝纖維化分級及膠原容積分?jǐn)?shù)半定量分析結(jié)果

    表7 各組大鼠肝組織中Wnt1、β-Catenin和 CyclinD1 mRNA 的表達(dá)

    表8 各組大鼠組織Wnt1、β-Catenin和 CyclinD1 蛋白表達(dá)水平比較

    注:空白,空白對照組;模型,模型組;陽性,陽性對照組;高,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量組;中,舒肝和絡(luò)醒脾方中劑量組;低,舒肝和絡(luò)醒脾方低劑量組。

    3 討論

    肝纖維化是所有慢性肝病共同的病理基礎(chǔ)。臨床上,肝硬化導(dǎo)致的腹水、上消化道出血、肝衰竭、肝細(xì)胞癌等均為肝纖維化的顯性表達(dá)。雖然肝纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,但主要是由于“慢性肝損傷-促靜息肝星狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外過度沉積的發(fā)生-導(dǎo)致肝纖維化病理變化”。肝纖維化于中醫(yī)屬“脅痛”“積聚”“肝著”等病癥范疇。甘肅省國醫(yī)大師周信有教授基于“肝藏血”“脾統(tǒng)血”“久病入絡(luò)”和“肝體陰用陽”理論,將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“慢性肝損傷-肝纖維化-肝硬化形成”疾病進(jìn)展提煉為中醫(yī)學(xué)“絡(luò)脈瘀滯-微小癥積-癥積形成”的理論,提出“益氣養(yǎng)血、祛瘀活絡(luò)、舒肝醒脾”的治療大法,即“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說,且結(jié)合臨床驗效擬專方舒肝和絡(luò)醒脾方。該方由醋柴胡,岷當(dāng)歸,炙黃芪,莪術(shù),鱉甲,枳椇子六味藥構(gòu)成,以醋柴胡舒肝行氣,岷當(dāng)歸養(yǎng)血和絡(luò),炙黃芪益氣扶正,鱉甲去痞除癥,莪術(shù)破血通絡(luò),枳椇子醒脾解毒,共奏舒肝醒脾、祛瘀活絡(luò)、益氣養(yǎng)血之功效。針對肝纖維化絡(luò)脈瘀滯、肝郁脾困,氣血失和,進(jìn)而形成微小癥積的病機(jī)和證候要素,辨證施治,臨床確有良效[10]。臨床研究[11-13]表明,該方能夠有效改善肝纖維化患者臨床癥狀,并促進(jìn)肝功能恢復(fù)。已完成的基礎(chǔ)研究[4]證實,舒肝和絡(luò)醒脾方能夠顯著降低CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠的透明質(zhì)酸、Ⅳ型膠原和肝瞬時彈性成像指數(shù)水平,以發(fā)揮抗纖維化治療作用。

    由于無論是肝纖維化發(fā)病的分子機(jī)制,還是Wnt/β-Catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制均暗合“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的學(xué)術(shù)思想,為了進(jìn)一步揭示舒肝和絡(luò)醒脾方的抗肝纖維化機(jī)制,印證“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的科學(xué)性,本課題組檢測了與肝纖維化進(jìn)展密切相關(guān)的經(jīng)典信號通路Wnt/β-Catenin的主要相關(guān)蛋白。Wnt信號通路在HSC的激活和肝纖維化發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。Wnt1是肝損傷后激活的細(xì)胞因子,可導(dǎo)致β-Catenin大量聚集,促進(jìn)HSC的活化[14]。β-Catenin的活性可以促進(jìn)肝臟修復(fù)反應(yīng)和疾病的發(fā)展,β-Catenin的表達(dá)水平越高,肝纖維化程度越高,沉默β-Catenin可以抑制膠原的分泌和HSC的增殖,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。大量游離的β-Catenin到細(xì)胞核后能促進(jìn)Wnt靶基因的轉(zhuǎn)錄,并激活細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1。Cyclin D1對細(xì)胞周期的正調(diào)控會加速活化HSC的增殖,當(dāng)Cyclin D1表達(dá)被抑制時HSC的增殖也受到抑制,發(fā)生凋亡[16]。臨床常通過血液學(xué)指標(biāo)聯(lián)合病理學(xué)診斷(HE染色、Masson染色)確定肝纖維化。血液學(xué)指標(biāo)分為直接型指標(biāo)和間接型指標(biāo),直接指標(biāo)HYP作為膠原組織的主要成分可以衡量體內(nèi)膠原含量,反映纖維化程度。間接指標(biāo)如ALT、AST可反映肝實質(zhì)損害指標(biāo)水平,與肝臟合成功能指標(biāo)總蛋白、Alb和Glo協(xié)同參照,可作為評價肝功能和纖維化水平的間接評價指標(biāo)[1]。

    本研究采用水飛薊賓葡甲胺和不同劑量的舒肝和絡(luò)醒脾方對CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠進(jìn)行干預(yù),結(jié)果顯示,舒肝和絡(luò)醒脾方和水飛薊賓葡甲胺能夠發(fā)揮顯著的抗肝纖維化治療作用。其中,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量能夠明顯改善大鼠的生理狀況、肝功能、肝臟的膠原蛋白分解代謝水平和肝組織病理改變及纖維化程度,且與水飛薊賓葡甲胺基本等效,治療效果優(yōu)于舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量。在調(diào)控信號通路Wnt/β-Catenin主要蛋白Wnt1、β-Catenin和Cyclin D1的mRNA水平和蛋白表達(dá)方面,舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量對于關(guān)鍵蛋白 β-Catenin調(diào)控作用明顯優(yōu)于舒肝和絡(luò)醒脾方中、低劑量,且與水飛薊賓葡甲胺基本等效。上述結(jié)果提示,舒肝和絡(luò)醒脾方的抗肝纖維化作用可能與抑制Wnt/β-Catenin信號通路相關(guān)蛋白活化有關(guān),且以舒肝和絡(luò)醒脾方高劑量效果最為明顯,與戴琦等[17]益氣活血利水湯抑制慢性肝纖維化的研究結(jié)果較為一致。上述結(jié)果也提示,肝纖維化發(fā)病的分子機(jī)制和Wnt/β-Catenin信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制均符合“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的學(xué)術(shù)思想,驗證了學(xué)說的科學(xué)性和有效性。

    本研究的創(chuàng)新之處在基于“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說,把握肝纖維化絡(luò)脈瘀滯、肝郁脾困,氣血失和,進(jìn)而形成微小癥積的病機(jī)和證候要素,遵循扶正祛邪的總則,以舒肝醒脾、祛瘀活絡(luò)、益氣養(yǎng)血立法,創(chuàng)立舒肝和絡(luò)醒脾方,在基礎(chǔ)及臨床研究中均證實本方能有效發(fā)揮抗肝纖維化治療作用,印證了“舒肝和絡(luò)醒脾法”學(xué)說的科學(xué)性和有效性。應(yīng)用中醫(yī)藥復(fù)方干預(yù)肝絡(luò)微小癥積的發(fā)展,亦體現(xiàn)了中醫(yī)學(xué)“治未病”的思想。本實驗雖然從生理學(xué)、病理學(xué)和血液學(xué)方面驗證了舒肝和絡(luò)醒脾方的抗肝纖維化治療作用,并初步了解其抗纖維化機(jī)制可能是通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號通路發(fā)揮作用,但由于復(fù)方中藥成分的復(fù)雜性,是否有其他信號通路參與仍需進(jìn)一步驗證,且舒肝和絡(luò)醒脾方對于脾臟血液動力學(xué)及免疫功能是否具有調(diào)控作用仍需進(jìn)一步探索。

    倫理學(xué)聲明:本研究方案于2019年3月8日經(jīng)由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批,批號:2019-140,符合實驗室動物管理與使用準(zhǔn)則。

    利益沖突聲明:本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

    作者貢獻(xiàn)聲明:王奎淞負(fù)責(zé)課題設(shè)計,資料分析,撰寫論文;魏書瑤、殷世鵬、李婕妠、陳世玉、郭嘉琪參與收集數(shù)據(jù),修改論文;趙鯤鵬、張秋菊負(fù)責(zé)擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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