憂遁草葉莖中活性組分分析及其飲料制備工藝

馮立婷 ， 王 聰

（1. 大連工業(yè)大學(xué)儀器分析中心，遼寧 大連 116034；2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150090）

0 引言

憂遁草，別名鱷嘴花，為爵床科鱷嘴花屬草本植物[1]；莖圓柱狀，具條紋，無毛；葉先端銳尖或漸尖，邊緣呈齒狀[2]，是一種生長在靠近赤道的低海拔疏林中或灌叢內(nèi)潮濕砂質(zhì)土壤里的野生灌木狀草本植物，多分布于馬來西亞、印度尼西亞、泰國等東南亞國家及我國南部至西南部如廣東、海南、云南等地區(qū)[3]。

近年來，研究者對憂遁草展開了一系列研究，整體上看仍然屬于剛剛起步階段。研究表明，憂遁草中含有三萜類、黃酮碳苷、植物甾醇、含硫糖苷類等生物活性成分以及豐富的必需氨基酸和微量元素[2-3]，具有較高的藥用價值和食用價值[4-5]。不同種類的憂遁草提取物及其純化物具有抗氧化、抗炎癥、抗病毒、抗糖尿病、抗腫瘤等生物活性[6-7]。

民間用新鮮的憂遁草葉片榨汁飲用，或?qū)⑵渥鳛槭卟耸秤?，不利于運(yùn)輸和貯存，且目前關(guān)于其食品開發(fā)也鮮有報道[8]。國內(nèi)市場僅有憂遁草茶葉和憂遁草粉兩種憂遁草產(chǎn)品。采用不同的有機(jī)溶劑萃取憂遁草莖葉中的活性成分，并對其進(jìn)行定量研究；在該研究基礎(chǔ)上進(jìn)行憂遁草茶飲料的開發(fā)，探索其浸提工藝及其配方設(shè)計，最終產(chǎn)品不僅保留了憂遁草原料原有特色，營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特純正，而且便于攜帶和保存，為憂遁草食品的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)和工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

憂遁草原料來自云南，將植物清洗分離后于日光下自然風(fēng)干，莖葉分離，并分別用高速中藥粉碎機(jī)將莖、葉粉碎至粉末狀，用60 目篩篩分后備用。無水乙醇、正丁醇、氯仿、甲醇等，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供，均為分析純；木瓜蛋白酶、果膠酶，Amresco 公司提供；牛血清白蛋白，Roche公司提供；齊墩果酸、蘆丁、豆甾醇、谷甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥90%），乙腈、乙酸為色譜純，F(xiàn)luka 公司提供。

1.2 組分提取

分別將憂遁草葉粉與各浸提溶劑按1∶25 的比例恒溫磁力攪拌3 h，減壓過濾得濾液，濾液經(jīng)旋蒸濃縮后冷凍干燥得到5 種提取物，即憂遁草粉水提物、甲醇提取物、乙醇提取物、氯仿提取物、正丁醇提取物的粉末[9]。

1.3 活性成分測定方法

根據(jù)不同的發(fā)色原理，采用比色法測定總萜類物質(zhì)的含量[10]，總黃酮含量[11]及葉綠素含量[12]。反相高效液相色譜法（RP-HPLC） 測定甾醇類物質(zhì)的含量[13]。BCA 法[14]測定可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.4 憂遁草水提體系穩(wěn)定性影響因素研究

1.4.1 憂遁草飲料的制作工藝

采用如下流程進(jìn)行飲料的制作：

憂遁草烘干全葉→篩選→粉碎→浸提（酌情加入β - 環(huán)糊精） →抽濾→離心→酶解→離心過濾→調(diào)配→灌裝殺菌→冷卻→成品→包裝。

1.4.2 料液浸提條件對體系穩(wěn)定性的影響

料液浸提條件（浸提溫度、浸提時間、茶水質(zhì)量比） 是決定憂遁草茶湯品質(zhì)的重要因素，浸提工藝的好壞直接影響后續(xù)茶飲料產(chǎn)品加工品質(zhì)（見表1）。根據(jù)浸提后茶湯穩(wěn)定性的變化，確定最佳浸提條件。請10 名有一定品評經(jīng)驗的感官評審員對浸提后的茶湯進(jìn)行感官評分，滿分為100 分，其中湯色25 分，香氣35 分，滋味40 分，結(jié)果取其平均值。

茶湯浸提因素與水平設(shè)計見表1，茶湯感官評分標(biāo)準(zhǔn)[15]見表 2。

表1 茶湯浸提因素與水平設(shè)計

表2 茶湯感官評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.3 木瓜蛋白酶對體系穩(wěn)定性的影響

取部分茶湯，用去離子水稀釋5 倍，再用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)至其酶最適pH 值6.0，取等量適量茶湯分裝在玻璃容器中，分別加入茶湯體積0，0.01%，0.02%，0.04%的木瓜蛋白酶并混合均勻，置于60 ℃電熱恒溫水浴鍋中，依次在0，30，60，120 min 時取樣，于90 ℃條件下保溫10 min 使酶滅活，然后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心15 min，取上清液用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，并作出溶液中蛋白質(zhì)濃度隨時間變化曲線。

1.4.4 果膠酶對茶湯穩(wěn)定性的影響

取茶湯浸提液稀釋5 倍，用檸檬酸調(diào)節(jié)至其水解最適pH 值3.0，取等量適量茶湯分裝于玻璃容器中，分別加入0，0.02%，0.04%，0.08%的果膠酶攪拌均勻，于50 ℃條件下水解，在水解時間為1，2 h時分別取樣，用果膠物質(zhì)定性檢測方法測定茶湯中果膠物質(zhì)含量。果膠物質(zhì)定性采用酒精法[16]。

將95%的乙醇與澄清酶解液等體積混合于50 mL試旋緊管口并翻轉(zhuǎn)輕搖，靜置15 min 后觀察。如果未出現(xiàn)凝膠狀物質(zhì)，說明酶解液中的果膠物質(zhì)被分解完全，體系中已無果膠物質(zhì)存在，用符號“-”表示；如果出現(xiàn)凝膠狀物質(zhì)，表明酶解液中的果膠物質(zhì)沒有被分解完全，用符號“+”表示。酶解液中凝膠狀物質(zhì)越多，其“+”個數(shù)也越多。

1.4.5 pH 值對茶湯穩(wěn)定性的影響

pH 值是影響茶湯色澤及茶湯穩(wěn)定性的一個主要因素，同時影響飲用口感[17]。用食用級檸檬酸及碳酸氫鈉調(diào)整茶湯pH 值，經(jīng)灌裝殺菌（121 ℃，15 min）后觀察并記錄結(jié)果。

1.4.6 其他影響因素

分別在茶湯中加入0，0.01%，0.02%，0.05%的維C，灌裝滅菌后避光保存，觀察其護(hù)色效果；在浸提時分別加入0，0.1%，0.2%，0.4%的β - 環(huán)糊精（β-CD），觀察其護(hù)色及對苦味的包埋效果；分別向茶湯中加入0，0.01%，0.02%，0.05%的六偏磷酸鈉，灌裝殺菌（121 ℃，15 min） 后觀察其沉淀產(chǎn)生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 憂遁草原料中活性組分的含量確定

2.1.1 萜類物質(zhì)的測定

三萜含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 三萜含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1 可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：Y=0.008 08X-0.012 11，R2=0.997 49。通過測定憂遁草不同處理樣品的吸光度值計算不同溶劑提取的憂遁草葉粉末、憂遁草葉粉末浸提濃縮物及憂遁草莖粉末中三萜含量。

憂遁草不同部位三萜含量見圖2。

圖2 憂遁草不同部位三萜含量

2.1.2 黃酮類物質(zhì)的測定

黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3。

圖3 黃酮含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖3 可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為：Y=42.947X-0.006 99，R2=0.999 3。通過測定憂遁草不同處理樣品的黃酮吸光度，計算不同溶劑提取的憂遁草葉粉末、憂遁草葉粉末浸提濃縮物及憂遁草莖粉末中黃酮含量。

憂遁草不同部位黃酮含量見圖4。

圖4 憂遁草不同部位黃酮含量

2.1.3 葉綠素的測定

計算不同溶劑提取的憂遁草葉粉末、憂遁草葉粉末浸提濃縮物及憂遁草莖粉末中葉綠素含量，換算成每千克樣品含有的毫克數(shù)（mg/kg） 表示。

憂遁草不同部位及浸提條件下葉綠素含量見圖5。

圖5 憂遁草不同部位及浸提條件下葉綠素含量

2.1.4 甾醇類物質(zhì)的測定

以吸光度（A） 為縱坐標(biāo)，以甾醇含量（mg） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間（豆甾醇：10.468 s，谷甾醇：11.888 s） 見圖 6。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間（豆甾醇：10.468 s，谷甾醇：11.888 s）

由圖6 可知，豆甾醇曲線為Y1=3 045X+4.383 5，R2=0.999 7；谷甾醇曲線為 Y2=24 715X+2.843 5，R2=0.999 7；將得到的豆甾醇和谷甾醇含量相加，即為樣品中甾醇類物質(zhì)總含量。

計算出樣品中的含量X，進(jìn)而得出不同溶劑提取的憂遁草葉粉末、憂遁草葉粉末浸提濃縮物以及憂遁草莖粉末中甾醇類物質(zhì)含量X（g/100 g）。

憂遁草不同部位及浸提條件下甾醇含量見圖7。

圖7 憂遁草不同部位及浸提條件下甾醇含量

2.2 溶劑種類對活性組分提取率的影響研究

對7 種不同處理手段樣品的4 種活性成分進(jìn)行定量分析，將結(jié)果都轉(zhuǎn)化為測得的活性成分在憂遁草莖/葉直接粉碎物中的百分含量，采用蛛網(wǎng)圖[18-19]的形式的表達(dá)試驗結(jié)果。

憂遁草不同部位及浸提條件下各活性成分含量見圖8。

圖8 憂遁草不同部位及浸提條件下各活性成分含量

由圖8 可知，對于同種活性成分（同種顏色），以在得到的相對活性成分含量最大值（最外圍數(shù)值）即為憂遁草葉/莖直接粉碎粉末中實際活性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)。研究發(fā)現(xiàn)，對憂遁草葉粉末和憂遁草粉末浸提濃縮物而言，葉綠素在氯仿中的溶解度最大，為171.7 mg/kg，總黃酮在憂遁草葉粉末中含量最高，為2.13%，三萜類物質(zhì)含量在葉粉末中含量最大，為1.17%，總甾醇在氯仿提物中的含量最大，為1.72%。對憂遁草莖粉碎物而言，其葉綠素含量為47.98 mg/kg，含量微乎其微；總黃酮含量為0.44%，約是葉粉末含量的五分之一；三萜含量為1.13%，與葉粉末相當(dāng)；甾醇含量未達(dá)到檢出限，未被檢測到。

總體而言，憂遁草葉中活性成分含量要高于莖，說明葉更具食用價值和營養(yǎng)價值。同時，對于表格后5 列不同溶劑憂遁草葉粉末浸提物而言，水提物中三萜含量較高，乙醇提取物中黃酮及三萜含量較高，氯仿提物中葉綠素、三萜、甾醇含量較為突出，正丁醇提物三萜含量較高，而甲醇提取物中黃酮含量較高。對于不同極性的溶劑，不同活性成分在其中的最大溶解度不同。

2.3 憂遁草浸提條件的優(yōu)化

料液浸提條件（浸提溫度、浸提時間、茶水質(zhì)量比） 是決定憂遁草茶湯品質(zhì)的重要因素，浸提工藝的好壞直接影響后續(xù)茶飲料產(chǎn)品加工品質(zhì)。根據(jù)三因素三水平試驗及茶湯感官評價標(biāo)準(zhǔn)，得到感官評價正交結(jié)果。

茶湯感官評價正交結(jié)果見表3。

表3 茶湯感官評價正交結(jié)果

根據(jù)極差大小得出茶湯感官審評影響因素由大到小排序為浸提溫度、茶水質(zhì)量比、浸提時間。A3B2C1（8 號試驗） 組別在綜合得分以及均值分布上得分皆最高，因此判定此組別為最佳組合，即浸提溫度為85 ℃，浸提時間為40 min，茶水質(zhì)量比為1∶25 時茶湯的感官品質(zhì)最好。

2.4 憂遁草水溶性提取物穩(wěn)定控制技術(shù)

為提高溶液澄清效果，選擇木瓜蛋白酶和果膠酶，在酶最適條件下對用最佳浸提工藝浸提的茶湯進(jìn)行酶解。研究發(fā)現(xiàn)，占茶湯體積0，0.01%，0.02%，0.04%的木瓜蛋白酶水解后，憂遁草浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度分別為 952，744.7，692.7，313 μg/mL。當(dāng)加酶量為0.04%時憂遁草浸提液中可溶性含量最少，因此確定該木瓜蛋白酶濃度為酶解濃度。茶飲料中茶多酚及其氧化物與茶汁中的蛋白質(zhì)、咖啡堿、金屬離子、果膠等發(fā)生絡(luò)合，主要是分子間的氫鍵、鹽鍵、疏水作用、電解質(zhì)、電場、溶解性等的變化，使溶液由澄清變?yōu)闇啙釥顟B(tài)[20]。此時析出的沉淀稱為“茶乳”，會影響茶飲料的感官品質(zhì)及質(zhì)量。

用不同濃度的果膠酶作用于茶湯浸提液，對果膠含量進(jìn)行測定。結(jié)果表明，未加入果膠酶的樣品含有較多果膠，當(dāng)果膠酶質(zhì)量濃度達(dá)到0.04 g/100 mL，水浴時間為2 h 時，茶湯中果膠物質(zhì)被完全分解；隨著酶質(zhì)量濃度達(dá)到0.08 g/100 mL，水浴1 h，茶湯中果膠物質(zhì)被分解完全。從經(jīng)濟(jì)成本和茶湯品質(zhì)2 個方面綜合考慮，最終確定果膠酶質(zhì)量濃度為0.04 g/100 mL，水浴時間2 h，可將茶湯中大分子果膠分解為小分子可溶性物質(zhì)，從而提高茶湯穩(wěn)定性。

茶湯湯色及澄清度隨pH 值變化見表4。

表4 茶湯湯色及澄清度隨pH 值變化

若將上述表格更加形象化地表示，可以按照打分制的原則，上表中標(biāo)有“*”的項記為5 分滿分，其余項感官評價效果越差分?jǐn)?shù)越低，最低分為1 分。在每個pH 值條件下3 項累計加和，轉(zhuǎn)化成堆積條形圖的形式，得分即為最終感官評價結(jié)果。

茶湯pH 值與感官評價總得分見圖9。

圖9 茶湯pH 值與感官評價總得分

結(jié)果表明，降低茶湯的pH 值可以有效防止茶湯變色，同時有利于提高茶湯的澄清穩(wěn)定性及改善茶感。當(dāng)pH 值降為5.0 時，茶湯為橙黃色，溶液澄清透明，澀味較淡，得分最高，品質(zhì)最佳。因此，選擇pH 值5.0 作為最佳護(hù)色手段。

2.4.1 維C 對體系穩(wěn)定性的影響

維C 作為一種食品級常用抗氧化劑，對茶湯有明顯的護(hù)色作用，而且不會影響茶飲料的風(fēng)味，作用機(jī)理為可與茶飲料中的溶氧反應(yīng)生成氧化型維C，從而避免溶氧與茶湯中的單寧等成分反應(yīng)而色澤變褐[21]。

維C 添加量對湯色穩(wěn)定性的影響見表5。

表5 維C 添加量對湯色穩(wěn)定性的影響

由表5 可知，較之未添加維C 的茶湯，添加維C茶湯的色澤均有一定的改善，且添加量為0.05%的組別在第15 天依然保持良好的色澤，因此確定維C最適添加量為0.05%。另外，維C 也是一種營養(yǎng)物質(zhì)，添加可以起到補(bǔ)充營養(yǎng)元素的作用。

2.4.2 β - 環(huán)糊精對體系穩(wěn)定性的影響

加入β - 環(huán)糊精可以包合茶湯中的葉綠素，防止兒茶素的氧化褐變，對茶湯色澤有保護(hù)作用。在茶飲料加工中，通過添加β - 環(huán)糊精，對茶湯中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行包埋，可降低茶湯的苦澀味，減少其對味覺神經(jīng)的刺激；同時減少香氣物質(zhì)的揮發(fā)和損失，從而達(dá)到保香護(hù)色的目的[22]。

β - 環(huán)糊精添加量對茶湯感官品質(zhì)的影響見表6。

表6 β - 環(huán)糊精添加量對茶湯感官品質(zhì)的影響

通過對加入不同濃度β-CD 浸提的茶湯進(jìn)行品鑒，可以看出當(dāng)β-CD 添加量為0.2%時茶湯口感、湯色較好，適合飲用，因此選用此濃度下的β-CD 作為浸提輔助添加劑，可有效改善茶湯口感。

2.4.3 離子螯合劑對體系穩(wěn)定性的影響

六偏磷酸鈉為一種常用離子螯合劑，能與茶湯中多價金屬離子和堿土金屬離子絡(luò)合，從而形成可溶性金屬絡(luò)合物，有利于減少茶乳的生成[23]。研究表明，隨著六偏磷酸鈉加入量的提高，沉淀量逐漸減少，當(dāng)添加量達(dá)到0.05%時幾乎無沉淀產(chǎn)生，防沉淀效果最好。

3 結(jié)論

憂遁草葉綠素在氯仿中的溶解度最大，為0.0171 7%；總黃酮在憂遁草葉粉末中含量最高，為2.13%；三萜類物質(zhì)含量在葉粉末中含量最大，為1.17%；同樣，總甾醇在葉粉末中的含量也最大，為8.09%；憂遁草莖中黃酮及甾醇含量較高。憂遁草飲料最佳制作工藝為浸提時加入0.2 g/100 mL β - 環(huán)糊精，料液比1∶25，浸提溫度80 ℃，浸提時間40 min后抽濾離心（8 000 r/min，15 min） 得茶湯；然后可將所得茶湯分別用0.02%木瓜蛋白酶及0.04%果膠酶水解，優(yōu)化后的配方為25%憂遁草浸提液，0.05%維C，0.05%六偏磷酸鈉，6%白砂糖，0.1%檸檬香精，最后調(diào)節(jié)溶液pH 值5.0，進(jìn)行調(diào)配灌裝，并在高壓滅菌鍋中進(jìn)行滅菌（121 ℃，15 min）。該研究的結(jié)果可為憂遁草產(chǎn)品開發(fā)提供一定的理論和技術(shù)支撐。