藍(lán)莓花色苷抑菌活性及其在復(fù)合果蔬肉制品中的應(yīng)用

路高勇，馬 劍，陳智玲，邊道剛，馬艷弘

（1. 豐縣綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江蘇 徐州 221700；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；3. 徐州雙信食品有限公司，江蘇 徐州 221700）

即食果蔬肉制品是在傳統(tǒng)即食肉制品基礎(chǔ)上，加入水果、蔬菜、大豆蛋白和調(diào)味料等輔料煮制而成的熟食復(fù)合肉制品。因其營養(yǎng)全面、風(fēng)味獨(dú)特、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)備受市場(chǎng)青睞[1]。隨著人們對(duì)食品安全與營養(yǎng)健康認(rèn)知的提高，復(fù)合果蔬肉制品的綠色制造及其品質(zhì)提升技術(shù)已經(jīng)成為肉制品加工領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。但是，復(fù)合果蔬肉制品的貨架期短，在生產(chǎn)和銷售過程中極易被微生物污染而成為人類食源性疾病的載體[2-3]。因此，復(fù)合果蔬肉制品的貯藏保鮮技術(shù)是復(fù)合肉制品工業(yè)化生產(chǎn)中亟待解決的技術(shù)問題。

藍(lán)莓是21 世紀(jì)功能性保健漿果，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織（FAO） 列為人類五大健康食品之一[4]，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景。藍(lán)莓含有多種活性物質(zhì)，如花色苷、黃酮醇、酚酸等[5]，具有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)視力[6]、抗炎抗腫瘤、抗氧化[7]、抗衰老[8]、保護(hù)心血管[9]等多種藥理保健功能，在功能食品、生物醫(yī)藥、醫(yī)療美容等領(lǐng)域均具有良好的發(fā)展?jié)摿ΑＦ渲?，藍(lán)莓花色苷作為一種天然色素，被認(rèn)為是最有效的天然自由基清除劑[10]。有研究表明，藍(lán)莓花色苷對(duì)枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等致病菌具有一定的抑制作用[11]。但迄今為止，藍(lán)莓花色苷在肉制品防腐保鮮方面的研究報(bào)道較為少見。因此，以藍(lán)莓渣為原料提取花色苷，通過研究其抑菌作用及其對(duì)復(fù)合果蔬肉制品的保鮮效果，旨在為天然植物保鮮劑的開發(fā)和藍(lán)莓渣的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)莓渣，句容萬山紅遍生物科技有限公司提供；供試菌株：大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所提供；鮮豬肉、山藥、蘋果及調(diào)味料，購自蘇果超市；雞蛋皮、紅薯泥、蘋果汁、大豆蛋白，徐州雙信食品有限公司提供；BCA 蛋白測(cè)試盒，丙二醛（MDA） 試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、瓊脂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

HPP600 MPa 型超高壓食品處理裝置，包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；RE-5220 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；HJ-6A 型多頭磁力攪拌器，常州國華儀器有限公司產(chǎn)品；ZD-F12 型真空冷凍干燥機(jī)，南京載智自動(dòng)化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；LRH-150 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司產(chǎn)品；HH-2 型恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品；Epoch 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，BioTek 公司產(chǎn)品；D-B5 型紫外可見分光光度計(jì)，上海奧析科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SW-CJ-1D 型單人凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；3K15 臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國Sigma 公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)莓花色苷的制備

參照李鵬等人[12]研究方法稍做修改，取藍(lán)莓渣干粉按1∶20（g∶mL） 的料液比加入60%乙醇溶液（V/V，pH 值3.0），轉(zhuǎn)入聚乙烯袋，封口后置于超高壓設(shè)備中于400 MPa 壓力下保壓9 min，然后離心，上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，再用AB-8 型大孔樹脂純化，50%乙醇溶液洗脫2 次，合并洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，真空冷凍干燥至恒質(zhì)量得藍(lán)莓花色苷，于-20 ℃下冷凍保藏備用。

1.3.2 藍(lán)莓花色苷體外抑菌活性

（1） 菌種活化及菌懸液的制備。取出保存的大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌菌懸液于常溫下解凍，取100 μL 大腸桿菌和沙門氏菌菌懸液加入到100 mL LB 液體培養(yǎng)基中，100 μL 單增李斯特菌菌懸液加入到100 mL BHI 液體培養(yǎng)基中，均在溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速 120 r/min 搖床培養(yǎng) 18～24 h，活化 2 次后置于4 ℃冰箱中待用。在超凈臺(tái)中，用無菌生理鹽水稀釋活化好的菌種，制備濃度為106～108CFU/mL的菌懸液，備用。

（2） 抑菌活性的測(cè)定。參照李曉嬌等人[13]研究方法稍做修改。分別配置質(zhì)量濃度為0，2.5，5.0，10.0 mg/mL 的藍(lán)莓渣花色苷溶液。將活化的供試菌種100 μL 接種到100 mL 固體培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，待完全凝固后，用滅過菌的打孔器打出4 個(gè)直徑約為10 mm 的孔，吸取200 μL 花色苷溶液加入到孔中，無菌生理鹽水作為空白對(duì)照，放置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察是否出現(xiàn)抑菌圈，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的直徑大小，并作記錄。

（3） 最小抑菌（MIC） 濃度的測(cè)定。采用二倍稀釋法[14]，分別配制30 mL 終質(zhì)量濃度為10.000，5.000，2.500，1.250，0.625，0.313 mg/mL 藍(lán)莓渣花色苷培養(yǎng)基，無菌水作為空白對(duì)照。將培養(yǎng)基倒入平皿中，待冷卻凝固后，將50 μL 菌懸液加入平皿中并涂布均勻。將供試菌置于培養(yǎng)箱中37℃下培養(yǎng)24 h，觀察有無可見菌落并計(jì)數(shù)。

1.3.3 果蔬重組肉制品的制備

（1） 工藝流程。原料肉混合→絞碎→混合拌料（加紅薯泥、蘋果汁、香菇丁、大豆蛋白、香辛料）→腌制→成型→蒸煮→冷卻→藍(lán)莓花色苷溶液浸漬→真空包裝→冷藏。

（2） 操作要點(diǎn)。①原料肉去除筋膜，將2 份前腿肉，1 份五花肉混合絞碎，再加0.5 份紅薯泥和0.6 份蘋果汁，0.1 份香菇丁，0.05 份大豆蛋白、香辛料充分混勻，腌制40 min，裝入模具壓制成型，蒸煮熟化20 min，冷卻后放入藍(lán)莓花色苷溶液中浸漬1 min（溶液中花色苷添加量占復(fù)合肉制品的質(zhì)量濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0 mg/g），瀝去水分，真空包裝，于4 ℃下冷藏備用。②添加的香辛料（占復(fù)合肉制品的質(zhì)量百分比）：食鹽1.5%，桂皮0.1%，八角0.1%，花椒0.15%，生姜0.35%，大蔥0.5%，醬油0.2%，白酒1%。

1.3.4 感官評(píng)價(jià)

將制備好的復(fù)合肉制品切片，選擇10 名受過專業(yè)訓(xùn)練成員組成的感官評(píng)價(jià)小組，在標(biāo)準(zhǔn)品嘗室進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

產(chǎn)品感官質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 產(chǎn)品感官質(zhì)量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 花色苷對(duì)復(fù)合果蔬肉制品的防腐保鮮效果分析

以未用花色苷處理的樣品作對(duì)照，每隔2 d 取樣測(cè)定復(fù)合果蔬肉制品的TVB-N（揮發(fā)性氨基氮）、脂質(zhì)氧化（丙二醛） 值、細(xì)菌總數(shù)等指標(biāo)。

菌落總數(shù)的測(cè)定：根據(jù)GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》[15]，采用傾注平皿計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品菌落總數(shù)變化。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：熟肉制品中微生物安全限量標(biāo)準(zhǔn)為5 lgCFU/g[16]。

揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N） 值的測(cè)定：根據(jù)GB 5009.208—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》[17]。即取5 g 均質(zhì)樣品，加入25.0 mL三氯乙酸溶液振搖1 min，靜置15 min 待蛋白沉淀后過濾，采用凱氏定氮儀進(jìn)行蒸餾，5 mL 硼酸加2 滴指示劑用于接收蒸餾液，最后以鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液（0.010 mol/L） 滴定至終點(diǎn)。

脂質(zhì)氧化（丙二醛） 值的測(cè)定：采用硫代巴比妥酸法測(cè)定脂質(zhì)氧化程度[18]。結(jié)果以丙二醛（MDA）表示。準(zhǔn)確稱取樣品2.0 g，加入8 mL 生理鹽水，冰水浴條件下超聲破碎2 min 制成樣品懸液，檢測(cè)MDA 含量。具體按照細(xì)胞丙二醛（MDA） 測(cè)試試劑盒說明書進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。采用Origin 8.5.0 進(jìn)行繪圖和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓花色苷的抑菌能力分析

2.1.1 藍(lán)莓渣花色苷的抑菌能力

藍(lán)莓渣花色苷的抑菌效果見圖1，藍(lán)莓渣花色苷的抑菌能力見表2。

圖1 藍(lán)莓渣花色苷的抑菌效果

由圖1 和表2 可知，與對(duì)照組相比，加入藍(lán)莓渣花色苷的小孔均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，表明藍(lán)莓渣花色苷對(duì)3 種供試菌均具有抑菌效果[11]，且抑菌圈直徑隨著藍(lán)莓渣花色苷質(zhì)量濃度的增加而增大。藍(lán)莓渣花色苷對(duì)3 種致病菌的抑菌作用強(qiáng)弱的依次為沙門氏菌＞大腸桿菌＞單增李斯特菌。當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，沙門氏菌出現(xiàn)的抑菌圈最大，直徑達(dá)到20.07±1.10 mm，而大腸桿菌和單增李斯特菌的抑菌圈直徑分別為19.93±1.90，17.47±1.50 mm。說明，藍(lán)莓花色苷中的錦葵色素和矢車菊素對(duì)3 種食品中常見的致病菌有著良好的抑制作用，通過改變菌體的細(xì)胞膜通透性達(dá)到抑菌的效果。

表2 藍(lán)莓渣花色苷的抑菌能力

2.1.2 最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC） 的測(cè)定

藍(lán)莓渣花色苷的最小抑菌質(zhì)量濃度見表3。

表3 藍(lán)莓渣花色苷的最小抑菌質(zhì)量濃度

由表3 可知，與對(duì)照組相比，藍(lán)莓渣花色苷對(duì)3 種致病菌的生長均具有一定的抑制作用，且抑制能力隨著花色苷質(zhì)量濃度的增大而增大。對(duì)于不同菌種，花色苷的抑制效果不同，對(duì)大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的最小抑菌質(zhì)量濃度分別為5，10，5 mg/mL，表明藍(lán)莓花色苷對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有較強(qiáng)的抑菌作用，而對(duì)單增李斯特菌的抑制效果相對(duì)較弱。藍(lán)莓花色苷對(duì)于食品中常見的有害菌都存在一定的一致作用，對(duì)于藍(lán)莓花色苷在復(fù)合果蔬肉質(zhì)品種的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)，具有廣闊的開發(fā)前景。

2.2 藍(lán)莓花色苷對(duì)復(fù)合果蔬肉制品感官評(píng)分的影響

復(fù)合果蔬肉制品感官評(píng)定結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)合果蔬肉制品感官評(píng)定結(jié)果

由圖2 可知，除0.5 mg/g 花色苷處理組外，其他花色苷處理組的感官評(píng)分均顯著高于對(duì)照組（p＜0.05），其中高含量2.0 mg/g 花色苷處理組的感官評(píng)分最高（93.3±3.67），但其與4.0 mg/g 花色苷處理組 （91.42±2.87） 無顯著性差異 （p＞0.05），高含量的花色苷處理后，復(fù)合果蔬肉制品的色澤變得更加具有特點(diǎn)，口感風(fēng)味更加突出，營養(yǎng)品質(zhì)保存較好，導(dǎo)致其感官評(píng)分較高；1.0 mg/g 處理組感官評(píng)價(jià)略低，可能是此時(shí)花色苷含量對(duì)樣品的口感影響較小，主要為色澤的改變，導(dǎo)致其感官得分的上升，表明一定含量的藍(lán)莓渣花色苷能有效提高復(fù)合果蔬肉制品的色澤和風(fēng)味。

2.3 藍(lán)莓花色苷對(duì)復(fù)合果蔬肉制品脂質(zhì)抗氧化程度的影響

丙二醛是評(píng)判肉類中脂肪氧化的良好指標(biāo)，由動(dòng)物脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)化而生成[18]。

復(fù)合果蔬肉制品冷藏過程中的MDA 值見圖3。

圖3 復(fù)合果蔬肉制品冷藏過程中的MDA 值

由圖3 可知，各組復(fù)合肉制品的MDA 含量隨貯藏期的延長而迅速增加，說明樣品中均發(fā)生了脂質(zhì)氧化反應(yīng)。復(fù)合肉制品的各組冷藏前4 d，MDA 上升速度緩慢，4 d 之后，各組MDA 含量快速升高。且在相同冷藏時(shí)間內(nèi)，花色苷濃度越大，復(fù)合肉制品中MDA 含量越低，冷藏到第10 天時(shí)，對(duì)照組MDA 含量 （6.57 nmol/mg pro）t 上升至初始值 （3.12 nmol/mg pro）t 的2 倍，說明脂質(zhì)氧化是肉制品貯藏過程中最易發(fā)生的反應(yīng)，也是復(fù)合果蔬肉制品品質(zhì)下降的重要原因；而4.0 mg/g 花色苷處理組MDA 含量為4.87 nmol/mg prot，比對(duì)照組降低了25.88%，說明添加外源花色苷可以很好地抑制復(fù)合果蔬肉制品中脂質(zhì)反應(yīng)的發(fā)生，這是由于花色苷中具有很強(qiáng)的羥基清除能力和抗氧化能力。因此，藍(lán)莓花色苷在防止復(fù)合果蔬肉制品脂質(zhì)氧化方面作用突出，表現(xiàn)出極強(qiáng)的保鮮能力。

2.4 藍(lán)莓花色苷對(duì)復(fù)合肉制品TVB-N 的影響

揮發(fā)性鹽基氮是肉制品蛋白質(zhì)在微生物或內(nèi)源蛋白酶共同作用下生成的含氮降解產(chǎn)物，通常被作為評(píng)判肉制品新鮮程度的重要指標(biāo)[19]。

復(fù)合果蔬肉制品冷藏過程中TVB-N 值見圖4。

圖4 復(fù)合果蔬肉制品冷藏過程中TVB-N 值

由圖4 可知，2 d 之內(nèi)，各組揮發(fā)性鹽基氮含量相對(duì)平緩，2 d 之后，隨著貯藏期的延長，各組復(fù)合果蔬肉制品的揮發(fā)性鹽基氮含量均呈上升趨勢(shì)，其中空白組的上升速度最快，說明其新鮮度最差[19]。同一貯藏期內(nèi)，花色苷濃度越高，其復(fù)合果蔬肉質(zhì)品的TVB-N 的含量越低，表明花色苷能抑制樣品中微生物的產(chǎn)生，從而降低復(fù)合果蔬肉質(zhì)品的TVB-N 值。在第6 天時(shí)，對(duì)照組的TVB-N 值達(dá)21.9 mg/100 g，已超過了國家規(guī)定的變質(zhì)肉標(biāo)準(zhǔn)（20 mg/100 g）。而4 mg/g 處理組在貯藏的第10 天時(shí)其揮發(fā)性鹽基氮值為17.12 mg/100 g，比對(duì)照組降低了39.58%，并低于國家標(biāo)準(zhǔn)，表明用4 mg/g 處理后的復(fù)合果蔬肉制品保留新鮮程度較長，并且具有食用價(jià)值。由此可知，添加藍(lán)莓花色苷可有效延緩復(fù)合果蔬肉制品的腐敗程度，降低TVB-N 值的含量，從而延長保藏時(shí)間，達(dá)到保鮮目的。

2.5 藍(lán)莓花色苷對(duì)貯藏期復(fù)合肉制品菌落總數(shù)的影響

微生物是導(dǎo)致肉制品腐敗的重要因素，降低微生物含量是延長肉制品貯藏期的重要技術(shù)手段。

復(fù)合肉制品冷藏過程中菌落總數(shù)的變化見表4。

表4 復(fù)合肉制品冷藏過程中菌落總數(shù)的變化

由表4 可知，隨著冷藏時(shí)間的延長，各組復(fù)合肉制品中菌落總數(shù)都有所增加。同一時(shí)間內(nèi)，花色苷處理組菌落總數(shù)低于對(duì)照組，高含量花色苷處理組菌落總數(shù)少于低含量花色苷處理組。貯藏到第8 天時(shí)，對(duì)照組與0.5 mg/g 處理組的菌落總數(shù)均超過國家標(biāo)準(zhǔn)最低要求，而其他花色苷處理組的菌落總數(shù)均低于國家標(biāo)準(zhǔn)最低要求。其中4.0 mg/g 花色苷處理組在貯藏10 d 時(shí)仍具有食用價(jià)值，其菌落總數(shù)為4.732±0.059 lg（CFU/g），顯著低于其他處理組（p＜0.05）。其中，比對(duì)照組的菌落總數(shù)降低了31.33%，表明較高含量的藍(lán)莓渣花色苷能抑制細(xì)菌的增殖，對(duì)復(fù)合肉制品具有一定的防腐保鮮作用。

3 結(jié)論

藍(lán)莓花色苷色澤誘人、食用安全性高，且具有較高的抗氧化活性和抑菌能力，在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)潛力。研究考查了藍(lán)莓花色苷對(duì)大腸桿菌、單增李斯特菌和沙門氏菌的抑菌效果。結(jié)果表明，藍(lán)莓花色苷對(duì)3 種菌均有抑菌作用，強(qiáng)弱順序?yàn)樯抽T氏菌＞大腸桿菌＞單增李斯特菌，當(dāng)花色苷質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，直徑分別達(dá)到 20.07±1.10，19.93±1.90，17.47±1.50 mm，最小抑菌質(zhì)量濃度（MIC） 分別為5，5，10 mg/mL。進(jìn)一步將藍(lán)莓花色苷應(yīng)用于果蔬復(fù)合肉制品的保鮮，探討其對(duì)產(chǎn)品冷藏過程中品質(zhì)變化的影響。結(jié)果表明，2.0～4.0 mg/g 花色苷處理的復(fù)合果蔬肉制品色澤紅潤、香氣濃郁、口感細(xì)膩有嚼勁，感官評(píng)分較高。藍(lán)莓花色苷能有效降低復(fù)合肉制品的脂肪和蛋白質(zhì)氧化程度，抑制細(xì)菌生長。當(dāng)貯藏10 d 時(shí)，與對(duì)照組相比，4.0 mg/g 花色苷處理組的MDA 含量 （4.87 nmol/mg pro）t 降低了25.88%，揮發(fā)性鹽基氮值降低了39.58%，菌落總數(shù)降低了31.33%，仍具有食用價(jià)值。說明藍(lán)莓花色苷不僅能有效改善復(fù)合果蔬肉制品的色澤和風(fēng)味，還能顯著抑制細(xì)菌的增殖并有效延緩復(fù)合果蔬肉制品的腐敗程度，從而延長保藏時(shí)間，且其防腐保鮮效果隨著花色苷濃度的增加而提升。