microRNA-23b-3p對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞自噬和凋亡的抑制作用及其機制

劉文蘭 王莉 楊揚 閆瑾 何媛

1西安醫(yī)學院醫(yī)學技術學院，西安 710021；2西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院眼科，西安 710077

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的內分泌疾病，其在全球范圍內的發(fā)病率呈上升趨勢。糖尿病性白內障(diabetic cataract，DC)是糖尿病患者的主要眼部并發(fā)癥之一，其發(fā)病年齡較早，進展較快[1-2]。糖尿病患者的白內障發(fā)病率是非糖尿病人群的2～5倍，成為導致視力損害的主要原因[3]。研究表明晶狀體上皮細胞凋亡在白內障的發(fā)展中起著至關重要的作用[4]；此外，人晶狀體細胞主要通過自噬降解衰老的細胞器和蛋白質以維持晶狀體的透明度[5]。高糖誘導的晶狀體上皮細胞凋亡可能是DC形成的原因之一，但是具體的發(fā)病機制尚不十分清楚。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度為21～23個核苷酸的非編碼單鏈小RNA，通過靶向mRNA分子的3'-非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)，以mRNA降解或翻譯抑制的方式沉默基因表達[6-7]。越來越多的研究表明miRNA在白內障的發(fā)病機制中起著重要作用，如先天性白內障、后發(fā)性白內障以及DC[8-10]。miR-23b-3p已被證實在晶狀體組織中高度表達[11]，然而miR-23b-3p是否參與DC的發(fā)病仍不清楚。因此，本研究擬探討miR-23b-3p對高糖誘導的人晶狀體上皮細胞自噬和凋亡的調節(jié)作用，為DC的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1標本及細胞來源 收集2019年9月至2020年10月在西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院行白內障手術的DC患者30例30眼和單純白內障患者30例30眼的晶狀體前囊膜組織，分別作為DC組和單純白內障組，置于凍存管中液氮保存?zhèn)溆?。DC組中男19例19眼，女11例11眼，年齡61～81歲，平均(64.1±6.9)歲。對照組中男17例17眼，女13例13眼，年齡61～79歲，平均(62.2±9.2)歲。DC患者診斷為2型糖尿病，術前空腹血糖<7.8 mmol/L，病程為4～7年；單純白內障患者為無糖尿病病史的白內障患者。排除標準：(1)除糖尿病外其他原因造成的白內障患者；(2)合并青光眼、玻璃體積血等其他眼部疾病者；(3)患者臨床資料不完善、不配合治療者；(4)有嚴重心、腦、肝、腎功能障礙者。2個組患者性別構成比、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05)。本研究方案經西安醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院倫理委員會審核批準(批文號：LSL2019037)。每位患者及家屬均被告知實驗目的并簽署知情同意書。人晶狀體上皮細胞系HLEB3來自中國科學院ATCC細胞庫。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(美國Sigma公司)；Trizol試劑、LipofectamineTM2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；PrimeScript RT-PCR試劑盒、SYBR Green試劑盒(日本Takara公司)；RIPA裂解液(上海碧云天公司)；BCA蛋白含量測定試劑盒(美國Thermo公司)；ECL試劑盒(北京拜爾迪生物技術有限公司)；兔抗人原鈣黏附蛋白17(protocadherin 17，PCDH17)抗體(HPA026817)(美國Sigma公司)；兔抗人c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNK)抗體(ab199380)、兔抗人磷酸化(p-)JNK抗體(ab47337)、兔抗人c-Jun抗體(ab40766)、兔抗人p-c-Jun抗體(ab32385)、兔抗人微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3B)抗體(ab192890)、兔抗人哺乳動物ATG6同源蛋白(a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30，Beclin-1)抗體(ab207612)、兔抗人B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(ab32503)、兔抗人B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)抗體(ab32124)、山羊抗兔二抗(ab205718)(美國Abcam公司)；雙熒光素酶報告基因載體pGL3、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)；miR-23b-3p擬似物、陰性對照(negative control，NC)擬似物(深圳華大基因公司)。紫外分光光度計(美國Lab Tech公司)；實時熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Thermo VarioskanTMLUX多功能酶標儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾公司)；倒置普通光學顯微鏡(日本Olympus公司)；電子顯微鏡(日本電子JEOL公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組處理 將人晶狀體上皮細胞系HLEB3接種于DMEM/F12培養(yǎng)基(含體積分數10%胎牛血清、質量分數1%青霉素，質量分數1%鏈霉素)6孔板中培養(yǎng)，待細胞達到80%融合時，棄掉培養(yǎng)液，將其分為正常對照組和高糖組，分別于含5 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基和含25 mmol/L葡萄糖的培養(yǎng)基中37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。隨后取高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞，隨機分為miR-23b-3p擬似物組、NC擬似物組、NC-siRNA組、PCDH17-siRNA組、miR-23b-3p擬似物+Vector組、miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組，根據LipofectamineTM2000試劑盒說明書分別進行轉染，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.2.2實時熒光定量PCR法檢測各組細胞中miR-23b-3p、PCDH17相對表達量 收集前囊膜組織及轉染后的各組細胞，使用Trizol試劑提取總RNA，采用紫外分光光度計測定提取的RNA濃度和純度。根據PrimeScript RT-PCR試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，檢測miR-23b-3p表達時，按照TaqMan microRNA逆轉錄試劑盒說明書將miRNA逆轉錄為cDNA。使用SYBR Green進行熒光定量PCR。miR-23b-3p正向引物序列為5'-GAGCATCACATTGCCAG GG-3'，反向引物序列為5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6正向引物序列為5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'，反向引物序列為5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'；PCDH17正向引物序列為5'-CTTGCCGATGTTGCCTA T-3'，反向引物序列為5'-CCATCTGTTGCTGCTTTC-3'；GAPDH正向引物序列為5'-TGACTTCAACAGCGACA CCCA-3'，反向引物序列為5'-CACCCTGTTGCTGTAGC CAAA-3'。引物均由大連Takara公司設計合成。PCR反應體積為25 μl，引物1 μl，cDNA 2 μl。PCR反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40個循環(huán)。GAPDH和U6分別作為mRNA和miRNA的內參，采用2-ΔΔCt法計算每個樣本中目標基因的相對表達量。

1.2.3雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-23b-3p與靶基因PCDH17的關系 將含有miR-23b-3p結合位點的野生型(wild type，WT)和突變型(mutant type，MUT)PCDH17 3'-UTR克隆到pGL3載體中，得到熒光素酶報告載體。將細胞以1×104/ml的密度接種至96孔板中，分為NC擬似物組、miR-23b-3p擬似物組，待細胞密度達到70%融合時，將WT和MUT PCDH17分別與miR-23b-3p擬似物、NC擬似物共轉染到各組細胞中，放于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用雙熒光素酶分析系統(tǒng)檢測各組細胞熒光素酶活性。設置3個復孔，取平均值，實驗重復3次。

1.2.4Western blot法檢測各組細胞中JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、LC3B、Beclin-1、Bax及Bcl-2蛋白表達 收集各組轉染后的細胞，加入適量的RIPA裂解液提取蛋白，使用BCA蛋白分析試劑盒測定蛋白質量濃度。取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，并轉印至甲醇活化的PVDF膜，用5%脫脂奶粉在室溫條件下封閉PVDF膜1 h；加入JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、LC3B、Beclin-1、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗(均1∶ 1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次；加入相應二抗(1∶ 2 000)37 ℃孵育1 h，TBST漂洗3次；采用ECL試劑盒進行顯色，采用凝膠成像分析系統(tǒng)進行檢測，使用ImageJ軟件對條帶進行量化分析。以GAPDH作為內參照，計算各目的蛋白的相對表達量。

1.2.5流式細胞術檢測HLEB3細胞凋亡率 取正常對照組、高糖組、miR-23b-3p擬似物組、NC擬似物組、NC-siRNA組、PCDH17-siRNA組轉染48 h的細胞，用胰蛋白酶消化并收集細胞，磷酸鹽緩沖液洗2次；調整細胞數量至1×105個/孔，加入195 μl的Annexin V-FITC結合液，反復輕輕吹打細胞，用移液管將細胞充分混合成單細胞懸液。在單細胞懸液中加入5 μl的Annexin V-FITC和10 μl的碘化丙啶，混合均勻，放入暗盒中孵育10 min。將單細胞懸液轉移至流式細胞儀專用離心管中，流式細胞儀上樣檢測。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 單純白內障組和DC組前囊膜組織中miR-23b-3p相對表達量比較

DC組患者晶狀體組織中miR-23b-3p相對表達量為0.35±0.15，明顯低于單純白內障組患者的1.00±0.09，差異有統(tǒng)計學意義(t=44.627，P<0.01)(圖1)。

圖1 各組患者前囊膜組織中miR-23b-3p相對表達量比較 與單純白內障組比較，aP<0.01(獨立樣本t檢驗，n=30) miR：微小RNA；DC：糖尿病性白內障Figure 1 Comparison of the relative expression level of miR-23b-3p in anterior capsular membrane between two groups Compared with simple cataract group，aP<0.01 (Independent samples t test，n=30) miR：microRNA；DC：diabetic cataract

表1 各組細胞中miR-23b-3p相對表達量比較(x±s)Table 1 Comparison of relative expression of miR-23b-3pamong different groups (x±s)組別樣本量miR-23b-3p相對表達量正常對照組31.00±0.11高糖組30.39±0.08aNC擬似物組30.42±0.07miR-23b-3p擬似物組31.63±0.16bF值21.325P值<0.001 注:與正常對照組比較,aP<0.05;與NC擬似物組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) miR:微小RNA;NC:陰性對照 Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with NC mimics group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) miR:microRNA;NC:negative control

2.2 各miRNA轉染組細胞中miR-23b-3p相對表達量及細胞凋亡和自噬相關蛋白比較

正常對照組、高糖組、NC擬似物組、miR-23b-3p擬似物組細胞中miR-23b-3p及LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、細胞凋亡率、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量總體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=21.325，P<0.001；F=28.318，P=0.002；F=17.634，P=0.007；F=26.537，P=0.003；F=15.482，P=0.001；F=22.325，P<0.001)。與正常對照組比較，高糖組中miR-23b-3p表達量顯著降低，細胞凋亡率升高，LC3B Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1以及Bax蛋白表達量顯著升高，Bcl-2蛋白表達量顯著下降，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與NC擬似物組比較，miR-23b-3p擬似物組細胞中miR-23b-3p表達量顯著升高，細胞凋亡率降低，LC3 Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1以及Bax蛋白表達量顯著下降，Bcl-2蛋白表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖2，表1、2)。

圖2 各組細胞凋亡率以及凋亡、自噬蛋白的表達 A：各組細胞凋亡流式細胞圖 B：各組細胞凋亡相關蛋白表達電泳圖 C：各組細胞自噬相關蛋白表達電泳圖 1：正常對照組；2：高糖組；3：NC擬似物組；4：miR-23b-3p擬似物組 NC：陰性對照；miR：微小RNA；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；Bax：B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；LC3B：微管相關蛋白1輕鏈3；Beclin-1：哺乳動物ATG6同源蛋白Figure 2 Apoptosis rate and expression of apoptotic and autophagy-related proteins in different groups A：Flow cytometry of cell apoptosis B：Electrophoretogram of apoptotic proteins C：Electrophoretogram of autophagy-related proteins 1：normal control group；2：high glucose group；3：NC mimics group；4：miR-23b-3p mimics group NC：normal control；miR：microRNA；Bcl-2：B-cell lymphoma-2；Bax：Bcl-2 associated X protein；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；LC3B：microtubule-associated protein 1 light chain 3；Beclin-1：a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30

2.3 miR-23b-3p靶向結合PCDH17驗證

生物信息學數據庫預測miR-23b-3p直接靶向結合PCDH17 3'-UTR。miR-23b-3p擬似物組WT-PCDH17熒光素酶活性為1.00±0.11，明顯低于NC擬似物組的0.42±0.05，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.306，P=0.004)；miR-23b-3p擬似物組與NC擬似物組MUT-PCDH17熒光素酶活性分別為1.00±0.09和0.98±0.08，差異無統(tǒng)計學意義(t=0.314，P=0.952)。miR-23b-3p擬似物組細胞中PCDH17 mRNA相對表達量為0.41±0.04，明顯低于NC擬似物組的1.00±0.09，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.483，P=0.001)(圖3)。

圖3 miR-23b-3p靶向PCDH17驗證 A：miR-23b-3p與野生型PCDH17基因存在靶向結合位點 B：各組細胞野生型熒光素酶活性比較 與NC擬似物組比較，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) C：各組細胞突變型熒光素酶活性比較 與NC擬似物組比較，P=0.952(獨立樣本t檢驗，n=3) D：各細胞轉染組PCDH17 mRNA相對表達量比較 與NC擬似物組比較，aP<0.05(獨立樣本t檢驗，n=3) WT：野生型；PCDH17：原鈣黏附蛋白17；miR：微小RNA；MUT：突變型；NC：陰性對照Figure 3 Validation of miR-23b-3p targeting PCDH17 A：Targeted binding sites of miR-23b-3p and wild-type PCDH17 B：Comparison of wild luciferase activity between two groups Compared with NC mimics group，aP<0.05 (Independent samples t test，n=3) C：Comparison of mutant luciferase activity between two groups Compared with NC mimics group，P=0.952 (Independent samples t test，n=3) D：Comparison of the relative expression of PCDH17 mRNA between different transfection groups Compared with NC mimics group，aP<0.05 (Independent samples t test，n=3) WT：wild type；PCDH17：protocadherin 17；miR：microRNA；MUT：mutant type；NC：negative control

2.4 各siRNA轉染組細胞中PCDH17 mRNA相對表達量比較

正常對照組、高糖組、NC-siRNA組、PCDH17-siRNA組細胞中PCDH17 mRNA相對表達量分別為1.00±0.04、3.42±0.16、3.35±0.13和1.42±0.09，總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=41.183，P=0.001)；其中高糖組細胞中PCDH17 mRNA相對表達量高于正常對照組，PCDH17-siRNA組細胞中PCDH17 mRNA相對表達量低于NC-siRNA組，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖4)。

圖4 各組細胞中PCDH17 mRNA相對表達量比較 F=41.183，P=0.001.與正常對照組比較，aP<0.05；與NC-siRNA組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗，n=3) PCDH17：原鈣黏附蛋白17；NC：陰性對照Figure 4 Comparison of the relative expression level of PCDH17 mRNA among different groups F=41.183，P=0.001.Compared with normal control group，aP<0.05；compared with NC-siRNA group，bP<0.05 (One-way ANOVA，LSD-t test，n=3) PCDH17：protocadherin 17；NC：negative control

2.5 各siRNA轉染組凋亡率、細胞凋亡和自噬相關蛋白表達比較

與NC-siRNA組相比，PCDH17-siRNA組細胞凋亡率降低，LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1以及Bax蛋白相對表達量顯著下降，Bcl-2蛋白相對表達量顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(t=9.116，P=0.001；t=12.413，P=0.004；t=5.349，P=0.006；t=3.273，P=0.001;t=8.419，P<0.001)(圖5，表3)。

圖5 各組細胞凋亡及自噬和凋亡相關蛋白表達情況 A：各組細胞凋亡流式細胞圖 B：各組自噬和凋亡相關蛋白表達電泳圖 NC：陰性對照；PCDH17：原鈣黏附蛋白17；siRNA：小干擾RNA；Bax：B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白；Beclin-1：哺乳動物ATG6同源蛋白；LC3B：微管相關蛋白1輕鏈3；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 5 Cell apoptosis and the expression of autophagy- and apoptosis-related proteins in two groups A：Flow cytometry of cell apoptosis B：Electrophoretogram of autophagy- and apoptosis-related proteins NC：normal control；PCDH17：protocadherin 17；siRNA：small interfering RNA;Bax：Bcl-2 associated X protein；Beclin-1：a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30；LC3B：microtubule-associated protein 1 light chain 3；Bcl-2：B-cell lymphoma-2；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表2 各組細胞中自噬與凋亡相關蛋白相對表達量及凋亡率比較(x±s)Table 2 Comparison of apoptosis rate and the relative expression levels of autophagy-related and apoptotic protein amongdifferent groups (x±s)組別樣本量LC3B Ⅱ/ⅠBeclin-1Bcl-2Bax凋亡率(%)正常對照組31.02±0.061.00±0.051.24±0.071.01±0.084.49±0.69高糖組33.12±0.13a2.89±0.04a0.53±0.013.47±0.22a19.18±1.13aNC擬似物組33.01±0.092.82±0.110.51±0.033.29±0.1620.61±1.05miR-23b-3p擬似物組31.76±0.12b1.41±0.03b1.04±0.021.54±0.13b5.83±0.52bF值28.31817.63415.48222.32526.537P值0.0020.0070.001<0.0010.003 注:與正常對照組比較,aP<0.05;與NC擬似物組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) LC3B:微管相關蛋白1輕鏈3;Beclin-1:哺乳動物ATG6同源蛋白;Bcl-2:B淋巴細胞瘤-2;Bax:B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白;NC:陰性對照;miR:微小RNA Note:Compared with normal control group,aP<0.05;compared with NC mimics group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) LC3B:mi-crotubule-associated protein 1 light chain 3;Beclin-1:a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;Bax:Bcl-2 associated X protein;NC:negative control;miR:microRNA

2.6 各共轉染組細胞中JNK通路蛋白以及自噬和凋亡蛋白比較

NC擬似物組、miR-23b-3p擬似物組、miR-23b-3p擬似物+Vector組、miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組細胞中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Bcl-2、Bax蛋白相對表達量總體比較，差異均有統(tǒng)計學意義(F=24.724，P=0.004；F=19.319，P=0.008；F=23.418，P=0.009；F=17.562，P=0.011；F=20.263，P=0.001；F=15.249，P=0.005)；其中與NC擬似物組比較，miR-23b-3p擬似物組細胞中p-JNK/JNK比值和p-c-Jun/Jun比值顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)；與miR-23b-3p擬似物+Vector組比較，miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組細胞中p-JNK/JNK比值和p-c-Jun/c-Jun比值升高，LC3B Ⅱ/Ⅰ比值和Beclin-1以及Bax蛋白相對表達量顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達量顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)(圖6，表4)。

表3 各siRNA轉染組細胞中自噬與凋亡相關蛋白相對表達量及凋亡率比較(x±s)Table 3 Comparison of apoptosis rate and the relative expression levels of autophagy-related and apoptotic proteinsbetween different siRNA-transfected groups (x±s)組別樣本量LC3B Ⅱ/ⅠBeclin-1Bcl-2Bax凋亡率(%)NC-siRNA組31.00±0.091.00±0.061.00±0.121.00±0.1024.05±1.48PCDH17-siRNA組30.35±0.030.39±0.043.11±0.280.41±0.046.31±0.55t值12.4135.3498.4193.2739.116P值0.0040.006<0.0010.0010.001 注:(獨立樣本t檢驗) LC3B:微管相關蛋白1輕鏈3;Beclin-1:哺乳動物ATG6同源蛋白;Bcl-2:B淋巴細胞瘤-2;Bax:B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白;NC:陰性對照;PCDH17:原鈣黏附蛋白17;siRNA:小干擾RNA Note:(Independent samples t test) LC3B:microtubule-associated protein 1 light chain 3;Beclin-1:a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;Bax:Bcl-2 associated X protein;NC:negative control;PCDH17:protocadherin 17;siRNA:small interfering RNA

圖6 各共轉染組細胞中JNK通路蛋白以及自噬和凋亡蛋白表達電泳圖 與NC擬似物組比較，miR-23b-3p擬似物組細胞中p-JNK、p-c-Jun、LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1以及Bax蛋白表達條帶較窄，強度較弱，Bcl-2蛋白條帶較寬，強度較強；與miR-23b-3p擬似物+Vector組比較，miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組細胞中p-JNK、p-c-Jun、LC3B Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1以及Bax蛋白表達條帶較寬，強度較強，Bcl-2蛋白條帶較窄，強度較弱 1：NC擬似物組；2：miR-23b-3p擬似物組；3：miR-23b-3p擬似物+Vector組；4：miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組 LC3B：微管相關蛋白1輕鏈3；Beclin-1：哺乳動物ATG6同源蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；Bax：B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白；Bcl-2：B淋巴細胞瘤-2；JNK：c-Jun氨基末端激酶Figure 6 Electrophoretogram of JNK pathway proteins，autophagy-related and apoptotic proteins in different co-transfection groups Compared with NC mimics group，the expression bands of p-JNK，p-c-Jun，LC3B Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1 and Bax were narrower and weaker，while the expression band of Bcl-2 was wider and stronger in miR-23b-3p mimics group；compared with miR-23b-3p mimics+Vector group，the expression bands of p-JNK，p-c-Jun，LC3B Ⅱ/Ⅰ，Beclin-1 and Bax were wider and stronger while the expression band of Bcl-2 was narrower and weaker in miR-23b-3p mimics+pcDNA-PCDH17 group 1:NC mimics group;2:miR-23b-3p mimics group;3:miR-23b-3p mimics+Vector group;4：miR-23b-3p mimics+pcDNA-PCDH17 group LC3B：microtubule-associated protein1 light chain 3；Beclin-1：a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30；GAPDH：glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；Bax：Bcl-2 associated X protein；Bcl-2：B-cell lymphoma-2；JNK：c-Jun N-terminal kinases

表4 各共轉染組細胞中不同蛋白相對表達量比較(x±s)Table 4 Comparison of relative expression level of different proteins among co-transfection groups (x±s)組別樣本量p-JNK/JNKp-c-Jun/JunLC3B Ⅱ/ⅠBeclin-1Bcl-2BaxNC擬似物組31.01±0.021.00±0.061.00±0.051.00±0.081.00±0.021.00±0.03miR-23b-3p擬似物組30.43±0.03a0.31±0.01a0.33±0.03a0.39±0.04a3.14±0.13a0.31±0.01amiR-23b-3p擬似物+Vector組30.41±0.010.33±0.020.35±0.020.40±0.013.11±0.080.35±0.03miR-23b-3p擬似物+pcDNA-PCDH17組30.91±0.08b0.93±0.05b0.93±0.07b0.95±0.06b1.42±0.06b0.96±0.07bF值24.72419.31923.41817.56220.26315.249P值0.0040.0080.0090.0110.0010.005 注:與NC擬似物組比較,aP<0.05;與miR-23b-3p擬似物+Vector組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗) JNK:c-Jun氨基末端激酶;LC3B:微管相關蛋白1輕鏈3;Beclin-1:哺乳動物ATG6同源蛋白;Bcl-2:B淋巴細胞瘤-2;Bax:B淋巴細胞瘤-2相關X蛋白;NC:陰性對照;miR:微小RNA;PCDH17:原鈣黏附蛋白17 Note:Compared with NC mimics group,aP<0.05;Compared with miR-23b-3p mimic+Vector group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test) JNK:c-Jun N-terminal kinases;LC3B:microtubule-associated protein 1 light chain 3;Beclin-1:a mammalian homolog of yeast Atg6/Vps30;Bcl-2:B-cell lymphoma-2;Bax:Bcl-2 associated X protein;NC:negative control;miR:microRNA;PCDH17:protocadherin 17

3 討論

miRNA廣泛參與細胞凋亡、增生、分化及應激反應等，其異常表達與多種疾病的發(fā)生密切相關。研究報道m(xù)iRNA在白內障發(fā)展過程中異常表達，其在DC形成的機制研究中也受到越來越多的關注[12-13]。目前研究表明，miR-23b-3p在多種組織細胞中具有重要作用，可能抑制骨肉瘤細胞的增生和侵襲，并通過下調SIX1促進細胞凋亡[14]。miR-23b-3p通過調控HS6ST2激活骨關節(jié)炎患者軟骨細胞中的p38 MAPK促進基質降解[15]。miR-23b通過靶向肌醇多磷酸多激酶(inositol phosphate multikinase，IPMK)抑制神經炎癥，在腦溢血患者中起保護作用[16]。此外，Zhao等[17]研究發(fā)現miR-23b-3p通過SIRT1依賴性信號通路調節(jié)糖尿病視網膜病變中高糖誘導的細胞代謝。在年齡相關性白內障患者晶狀體前囊膜組織中，circZNF292可通過海綿吸附miR-23b-3p調控晶狀體上皮細胞氧化應激和凋亡[18]。目前miR-23b-3p在DC中的作用及機制尚不清楚。本研究中采用高糖培養(yǎng)HLEB3細胞作為DC模型，研究miR-23b-3p在DC中的作用機制。

晶狀體上皮細胞的功能改變被認為是白內障發(fā)生的細胞基礎。最近的研究表明，晶狀體上皮細胞凋亡和自噬在白內障的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。有研究顯示，晶狀體上皮細胞凋亡可能是DC形成的始動因素[19-20]。自噬溶酶體途徑對維持晶狀體透明至關重要。大量研究證實自噬在多種類型的白內障發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用[21-22]。微管相關蛋白1輕鏈3亞家族LC3B是參與自噬形成的重要泛素化系統(tǒng)，是細胞自噬水平的重要評價標準。LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值常用來評估自噬水平。Beclin-1主要參與自噬的起始階段，是評價自噬水平的重要標志物之一。先前的研究表明，高濃度葡萄糖可誘導血管內皮細胞自噬[23]。本研究結果也顯示，在高糖條件下培養(yǎng)的晶狀體上皮細胞中LC3B及Beclin-1表達升高，促凋亡蛋白Bax表達顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降，細胞出現自噬和凋亡。PCDH17屬于原鈣粘蛋白基因家族，已被證明與細胞凋亡和自噬有關[24-26]。目前尚無文獻報道PCDH17在DC中的作用。本研究發(fā)現高糖環(huán)境下HLEB3細胞中PCDH17 mRNA表達升高，沉默PCDH17表達后細胞自噬和細胞凋亡水平均顯著下降，推測PCDH17在DC中可能具有重要作用。但本研究未進行PCDH17蛋白水平的檢測，在之后的研究中應重點關注PCDH17在DC中的作用機制。此外，有研究表明自噬和凋亡之間具有復雜的相互作用，激活自噬可促進視網膜神經節(jié)細胞存活，抑制自噬可降低視神經退行性病變過程中細胞的存活[27]。本研究結果發(fā)現DC形成過程中細胞凋亡與自噬均發(fā)生顯著變化，然而自噬與細胞凋亡的關系尚不清楚，仍有待進一步研究。

本研究還探索了miR-23b-3p對高糖誘導的HLEB3細胞中JNK信號通路的潛在影響。JNK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，可結合磷酸化c-Jun的轉錄活化結構域，在調節(jié)細胞炎癥反應、細胞凋亡和細胞自噬中發(fā)揮重要作用[28-29]。在本研究中，miR-23b-3p過表達使p-JNK/JNK比值和p-c-Jun/Jun比值顯著降低，而PCDH17過表達可逆轉這一結果，說明在高糖誘導的HLEB3細胞中，miR-23b-3p通過調控PCDH17抑制了JNK信號通路的激活。

綜上所述，miR-23b-3p通過靶向PCDH17抑制JNK通路，促進高糖誘導的HLEB3細胞自噬和凋亡。以上結果為DC發(fā)生和發(fā)展的分子機制提供了新的見解，同時為miR-23b-3p成為DC治療的靶點提供了實驗依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明劉文蘭：參與研究選題，研究設計，研究實施，論文撰寫、修改及定稿；王莉：參與研究設計、數據分析、對文章的知識性內容作批評性審閱；楊揚：參與研究實施、數據采集與分析、論文修改；閆瑾：參與數據采集與分析、論文修改；何媛：參與研究實施、資料收集