2021 年北京市獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)

吳 迪，杜 鵑，王 林，史 記，程敏姮，趙浩軍，周德剛，吳惠明

（北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京 102629）

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染家豬和野豬引起的一種廣泛出血性、高度接觸性傳染病，其特征為病程短，呈最急性和急性感染，死亡率可達(dá)100%[1]，是全球公認(rèn)的養(yǎng)豬業(yè)第一殺手。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（WOAH）將其列為法定報(bào)告動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類(lèi)動(dòng)物疫病[2]。

2018 年非洲豬瘟疫情在北京市暴發(fā)，北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心共委托17 家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)工作，包括區(qū)級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室10 家，非洲豬瘟第三方授權(quán)實(shí)驗(yàn)室7 家。實(shí)驗(yàn)室間能力比對(duì)是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平的重要手段[3]。2021 年，根據(jù)《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于做好非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的通知》（農(nóng)辦牧〔2018〕54號(hào)）[4]、《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部辦公廳關(guān)于進(jìn)一步做好非洲豬瘟實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)工作的通知》（農(nóng)辦牧〔2018〕66號(hào)）[5]等文件要求，北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心組織17 家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展了非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)工作。本研究依據(jù)《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法》（GB/T 28043—2019）[6]，對(duì)各實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，以期為深度挖掘?qū)嶒?yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)，持續(xù)提升實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 參加能力比對(duì)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室

2021 年，北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心組織10 家區(qū)級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室與7 家非洲豬瘟第三方授權(quán)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)試驗(yàn)，北京市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室對(duì)盲樣進(jìn)行了檢測(cè)。共計(jì)獲得18 家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)室編號(hào)為1～18。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與參比項(xiàng)目

1 000 copies/μL（Ct=29）、100 copies/μL（Ct=33）與陰性對(duì)照3 種比對(duì)質(zhì)控樣品，由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心非洲豬瘟國(guó)家參考實(shí)驗(yàn)室提供。每組設(shè)置6 份盲樣，其中1 000 copies/μL 比對(duì)盲樣2 份，100 copies/μL 比對(duì)盲樣3 份，陰性比對(duì)盲樣1 份。每組盲樣獨(dú)立包裝并置于-20 ℃保存。

參比項(xiàng)目為非洲豬瘟病毒熒光定量PCR 檢測(cè)。各實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)一領(lǐng)取比對(duì)盲樣，統(tǒng)一選用青島立見(jiàn)診斷技術(shù)發(fā)展中心非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測(cè)試劑盒作為比對(duì)試驗(yàn)診斷試劑，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)文獻(xiàn)[6]，分別采用箱線圖、穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)Z比分?jǐn)?shù)、堯敦圖等統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)各實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.1 頻率分布直方圖 以18 家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室100 copies/μL 與1 000 copies/μL 比對(duì)盲樣檢測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，繪制頻率分布直方圖，檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。若符合正態(tài)分布，則利用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)18 家參比實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.2 箱線圖 以18 家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室100 copies/μL與1 000 copies/μL 比對(duì)盲樣檢測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，統(tǒng)計(jì)中位數(shù)、均值、組間SD、組間CV 等數(shù)據(jù)，繪制箱線圖，反映數(shù)據(jù)分布的中心位置和散布范圍。

1.3.3 穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)Z比分?jǐn)?shù) 以18 家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室100 copies/μL 與1 000 copies/μL 的比對(duì)盲樣檢測(cè)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，計(jì)算Z比分?jǐn)?shù)，公式為

式中，Z代表獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果xi與平均值x的偏離程度。|Z|≤2，結(jié)果判定為滿(mǎn)意；2 ＜|Z|＜3，結(jié)果判定為可疑，需要查找原因；|Z|≥3，結(jié)果判定為不滿(mǎn)意，需要查找原因整改。s代表標(biāo)準(zhǔn)偏差。符號(hào)“+”與“-”代表xi與平均值x的偏離方向。

1.3.4 堯敦圖 以18 家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室1 000 copies/μL的比對(duì)盲樣Z比分?jǐn)?shù)為X軸，以100 copies/μL 比對(duì)盲樣Z比分?jǐn)?shù)為Y軸，畫(huà)出垂直線和水平線，創(chuàng)建四個(gè)象限，輔助進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。檢查圖中遠(yuǎn)離數(shù)據(jù)中心的點(diǎn)，若實(shí)驗(yàn)室未遵循正確檢測(cè)方法，其結(jié)果會(huì)受系統(tǒng)誤差影響，存在較大偏倚，會(huì)在左下象限和右上象限出現(xiàn)遠(yuǎn)離點(diǎn)；若實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)隨機(jī)誤差，會(huì)在左上象限和右下象限出現(xiàn)遠(yuǎn)離點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 頻率分布直方圖

頻率分布直方圖（圖1）顯示，18 家實(shí)驗(yàn)室的100 copies/μL 與1 000 copies/μL 比對(duì)盲樣檢測(cè)數(shù)據(jù)均呈近似正態(tài)分布。

圖1 盲樣頻率分布直方圖

2.2 核酸檢測(cè)比對(duì)

對(duì)18 家參比實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的盲樣結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，盲樣標(biāo)定為1 000 copies/μL 與100 copies/μL，取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差作圖。結(jié)果（圖2）顯示，盲樣標(biāo)定為100 copies/μL 時(shí)，編號(hào)16 號(hào)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)差相比其他實(shí)驗(yàn)室較高。

圖2 18 家實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)比對(duì)結(jié)果

2.3 箱線圖

箱線圖結(jié)果（圖3）顯示，在1 000 copies/μL盲樣檢測(cè)中無(wú)異常點(diǎn)，在100 copies/μL 盲樣檢測(cè)中存在一個(gè)異常點(diǎn)，結(jié)合表1，顯示異常Ct 為45.000。

表1 不同濃度盲樣比對(duì)結(jié)果分析

圖3 箱線圖結(jié)果（異常值用紅點(diǎn)標(biāo)出）

2.4 穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)Z 比分?jǐn)?shù)

結(jié)果（圖4）顯示，全部36 份1 000 copies/μL比對(duì)盲樣檢測(cè)結(jié)果中，結(jié)果判定為滿(mǎn)意的有35 份，占97.2%；可疑樣品1 份，來(lái)自3 號(hào)實(shí)驗(yàn)室，Z值為-2.25。

圖4 18 家實(shí)驗(yàn)室1 000 copies/μL 比對(duì)盲樣Z 比分?jǐn)?shù)分布

結(jié)果（圖5）顯示，全部54 份100 copies/μL比對(duì)盲樣檢測(cè)結(jié)果中，結(jié)果判定為滿(mǎn)意的有52 份，占96.3%；可疑樣品1 份，來(lái)自3 號(hào)實(shí)驗(yàn)室，Z值為-2.04；不滿(mǎn)意樣品1 份，來(lái)自16 號(hào)實(shí)驗(yàn)室，Z值為4.43。

圖5 18 家實(shí)驗(yàn)室100 copies/μL 比對(duì)盲樣Z 比分?jǐn)?shù)分布

2.5 堯敦圖

結(jié)果（圖6）顯示，16 號(hào)實(shí)驗(yàn)室在95%置信橢圓外，出現(xiàn)在右上象限，顯示已離群，提示該實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)系統(tǒng)誤差。

圖6 18 家實(shí)驗(yàn)室比對(duì)樣品Z 值堯敦圖

3 討論

本次區(qū)級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)能力比對(duì)結(jié)果顯示：16 號(hào)實(shí)驗(yàn)室的1 份標(biāo)定為100 copies/μL 的盲樣檢測(cè)Ct 為45.000，且無(wú)擴(kuò)增曲線，結(jié)合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)（當(dāng)Ct ≥40 時(shí)判為陰性），判定檢測(cè)結(jié)果不合格，其余17 家檢測(cè)結(jié)果均為符合。雖然17 家檢測(cè)結(jié)果為符合的實(shí)驗(yàn)室在本次能力比對(duì)中陰陽(yáng)性結(jié)果判定正確，但一些實(shí)驗(yàn)室也存在檢測(cè)結(jié)果預(yù)警情況。其中12、15 號(hào)實(shí)驗(yàn)室在100 copies/μL 盲樣檢測(cè)中重復(fù)性較差，標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，但在1 000 copies/μL 盲樣檢測(cè)中重復(fù)性較好，標(biāo)準(zhǔn)偏差較小。4、11、13 號(hào)實(shí)驗(yàn)室在1 000 copies/μL 盲樣檢測(cè)中重復(fù)性較差，但在低濃度100 copies/μL 盲樣檢測(cè)中重復(fù)性較好。8 號(hào)實(shí)驗(yàn)室在1 000 copies/μL 與100 copies/μL 盲樣檢測(cè)中標(biāo)準(zhǔn)偏差均較大，樣品重復(fù)性較差。

堯敦圖檢測(cè)結(jié)果可以反映實(shí)驗(yàn)室的系統(tǒng)誤差與隨機(jī)誤差，含有明顯系統(tǒng)誤差的實(shí)驗(yàn)室將在右上象限（正偏差）與左下象限（負(fù)偏差）出現(xiàn)偏離點(diǎn)，即檢測(cè)的兩個(gè)樣品結(jié)果會(huì)同時(shí)出現(xiàn)異常高值或低值；而隨機(jī)誤差將在左上象限與右下象限出現(xiàn)偏離點(diǎn)，即一個(gè)樣品的檢測(cè)值高，另一個(gè)樣品的檢測(cè)值低。比對(duì)本次18 家實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16 號(hào)實(shí)驗(yàn)室已離群，存在明顯系統(tǒng)誤差，11、12 號(hào)實(shí)驗(yàn)室存在隨機(jī)誤差，建議在下輪比對(duì)試驗(yàn)中持續(xù)跟蹤。3 號(hào)實(shí)驗(yàn)室在1 000 copies/μL 樣品Z比分?jǐn)?shù)為-2.25，在100 copies/μL 樣品Z比分?jǐn)?shù)為-2.04，均顯示可疑，但3 號(hào)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)Ct 值較其他實(shí)驗(yàn)室比較靠前，可能是因?yàn)? 號(hào)實(shí)驗(yàn)室采用核酸提取方法提取效率較高。

本研究依據(jù)《利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法》（GB/T 28043—2019）中能力計(jì)量的評(píng)定運(yùn)算，采用箱線圖、穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)Z比分?jǐn)?shù)、堯敦圖等統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)各實(shí)驗(yàn)室比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，使區(qū)級(jí)獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒核酸檢測(cè)比對(duì)不僅可以依靠陰陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行判讀，還可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法深度分析出各實(shí)驗(yàn)室的系統(tǒng)誤差與隨機(jī)誤差。結(jié)果提示，各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)持續(xù)加強(qiáng)質(zhì)量控制，保持和提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力水平。