食源性致病菌混合菌種的分離鑒定

張春鵬 馬妍娜 李媛 王波

摘要：依據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789現(xiàn)行有效的微生物檢驗(yàn)方法及CNAS評(píng)審專(zhuān)家提供的混合菌種鑒定作業(yè)指導(dǎo)書(shū)，對(duì)食源性致病茵混合茵種進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室比對(duì)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：盲樣樣品中檢出鼠傷寒沙門(mén)氏茵（1，4.[5]，12：i：1，2）和阪崎腸桿茵。此次混合茵種鑒定項(xiàng)目取得了滿(mǎn)意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)考核可以確保日常檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

關(guān)鍵詞：混合菌種;鑒定;食源性致病茵;盲樣

中圖分類(lèi)號(hào)：X959 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）18-0127-03

1引言

食品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制包括內(nèi)部質(zhì)量控制和外部質(zhì)量評(píng)估。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)控是實(shí)驗(yàn)室自我控制質(zhì)量的常規(guī)程序，可以反映檢驗(yàn)質(zhì)量穩(wěn)定性狀況，及時(shí)發(fā)現(xiàn)分析中異常情況。室內(nèi)質(zhì)量控制是從實(shí)驗(yàn)室的人員、方法、試劑、設(shè)備、標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)境等環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制，減少主觀因素對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響，以保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)室外部的質(zhì)量考核是對(duì)實(shí)驗(yàn)室人員技能和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的檢驗(yàn)?；旌暇N鑒定是檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證和實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)的常用方法，可以驗(yàn)證檢驗(yàn)人員的檢驗(yàn)?zāi)芰?，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部不易發(fā)現(xiàn)的潛在問(wèn)題。

2材料與方法

2.1樣品來(lái)源

樣品來(lái)自中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）專(zhuān)家提供的盲樣樣品1支，以西林瓶膠塞鋁蓋封口，內(nèi)含待測(cè)菌的凍干粉。盲樣有2種致病菌，最終結(jié)果應(yīng)報(bào)出所有檢出菌種的名稱(chēng)（如進(jìn)行血清學(xué)試驗(yàn)，菌種名稱(chēng)應(yīng)包含血清型，沙門(mén)氏菌報(bào)告相應(yīng)的群抗原即符合）。

2.2培養(yǎng)基及試劑

商品培養(yǎng)基和生化鑒定試劑盒購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;沙門(mén)氏菌診斷血清（60種）購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司;質(zhì)控菌株購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌鑒定卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。均在有效期內(nèi)使用。

2.3儀器與設(shè)備

HVE-50高壓滅菌器，日本Hirayama;LA2-6AI生物安全柜，新加坡藝思高;SPX-300BSH-II生化培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;DG250厭氧培養(yǎng)箱，英國(guó)DWS;BX41熒光顯微鏡，日本奧林巴斯;VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)，法國(guó)梅里埃。均性能良好，檢定校準(zhǔn)均在有限期內(nèi)。

2.4檢測(cè)方法

采用食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789現(xiàn)行有效的微生物檢驗(yàn)方法及CNAS評(píng)審專(zhuān)家提供的混合菌種鑒定作業(yè)指導(dǎo)書(shū)。

3結(jié)果與分析

3.1增菌與分離

無(wú)菌開(kāi)啟西林瓶，加入少量腦心浸出液肉湯（BHI）進(jìn)行再水化，待溶解后，接種到兩瓶100mL BHI肉湯培養(yǎng)基中，一瓶放人生化培養(yǎng)箱，36℃培養(yǎng)24h，另一瓶放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱，36℃培養(yǎng)24h，結(jié)果兩瓶增菌液均混濁。用接種環(huán)分別接種EMB瓊脂平板、血瓊脂平板、Baird-Parker瓊脂平板、哥倫比亞CNA血瓊脂平板、TCBS瓊脂平板、MYP瓊脂平板、HE瓊脂平板、BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板、沙門(mén)氏菌屬顯色瓊脂平板、CT-SMAC瓊脂平板、大腸埃希氏菌0157顯色瓊脂平板、阪崎腸桿菌顯色瓊脂平板、CN瓊脂平板、MAC瓊脂平板、PALCAM瓊脂平板、李斯特氏菌顯色瓊脂平板，觀察菌落特征。在阪崎腸桿菌顯色瓊脂平板、HE瓊脂平板、BS瓊脂平板、XLD瓊脂平板和沙門(mén)氏菌屬顯色瓊脂平板發(fā)現(xiàn)2種可疑致病菌菌落，編為1號(hào)菌和2號(hào)茵，菌落特征見(jiàn)表1。

3.2生化試驗(yàn)和血清學(xué)鑒定

自選擇性瓊脂平板上分別挑取2個(gè)以上可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，于36℃±l℃培養(yǎng)18h～24h，觀察三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果，同時(shí)做革蘭氏染色，結(jié)果見(jiàn)表2E2.33。

根據(jù)選擇性瓊脂平板上的菌落特征，三糖鐵試驗(yàn)和革蘭氏染色結(jié)果，1號(hào)菌和2號(hào)菌分別繼續(xù)做沙門(mén)氏菌和阪崎腸桿菌相關(guān)生化試驗(yàn)。

1號(hào)菌典型生化反應(yīng)可判定為沙門(mén)氏菌茵屬，結(jié)果見(jiàn)表3。進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)，以生理鹽水做對(duì)照，結(jié)果為鼠傷寒沙門(mén)氏菌（1，4，[5]，12：i：1，2）。采用VITEK2全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行分析，同時(shí)以沙門(mén)氏菌做陽(yáng)性對(duì)照，大腸埃希氏菌為陰性對(duì)照，生化結(jié)果顯示該菌為沙門(mén)氏菌，陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果完全符合。

2號(hào)菌生化試驗(yàn)結(jié)果可判定該菌為阪崎腸桿菌，結(jié)果見(jiàn)表4。以阪崎腸桿菌和大腸埃希氏菌為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，通過(guò)全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示該菌為阪崎腸桿菌。

綜合上述結(jié)果，該份盲樣中檢出鼠傷寒沙門(mén)氏菌（1，4，[5]，12：i：1，2）和阪崎腸桿菌，與CNAS評(píng)審專(zhuān)家結(jié)果一致，取得了滿(mǎn)意的結(jié)果。

4結(jié)語(yǔ)

致病菌是常見(jiàn)的致病性微生物，能夠引起人或動(dòng)物疾病。食品中的致病菌中主要有沙門(mén)氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、大腸埃希氏菌0157：H7、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌和志賀氏菌。隨著食品工業(yè)的發(fā)展和產(chǎn)品的快速流通，由食品引起的食源性疾病成為全球關(guān)注的重要食品安全問(wèn)題。食源性致病菌引起的食物中毒不斷發(fā)生，引起各國(guó)政府的高度重視，因此增強(qiáng)檢測(cè)能力對(duì)食品中致病菌的風(fēng)險(xiǎn)防控具有重要的意義。

接收盲樣樣品時(shí)應(yīng)認(rèn)真檢查樣品的狀態(tài)，有無(wú)破損情況，有異常情況及時(shí)與組織部門(mén)溝通，核實(shí)后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由于本次考核目標(biāo)菌未知，進(jìn)行鑒定時(shí)要考慮各種致病菌的菌落特征，這就需要平時(shí)工作中多積累經(jīng)驗(yàn)，并且有扎實(shí)的基本功。增菌及分離培養(yǎng)基配制在盲樣考核中至關(guān)重要，在檢驗(yàn)中要充分利用現(xiàn)有的顯色培養(yǎng)基和生化培養(yǎng)基的特性，應(yīng)選擇盡可能多的選擇性平板進(jìn)行接種，在發(fā)現(xiàn)可疑菌落時(shí)，應(yīng)盡量多挑取可疑菌落進(jìn)行鑒定，避免漏檢。有時(shí)也要對(duì)菌落特征不太明顯的菌落進(jìn)行鑒定，比如有的沙門(mén)氏菌在XLD瓊脂平板上呈現(xiàn)黃色菌落并且不帶黑色中心，這與大腸埃希氏茵菌落相似，因而容易在檢測(cè)過(guò)程中漏檢。平板在使用前應(yīng)無(wú)明顯的水珠，潮濕的平板可能會(huì)導(dǎo)致菌落擴(kuò)散蔓延，影響分離效果。

微生物混合菌種盲樣考核為實(shí)驗(yàn)室提供有效的外部質(zhì)量控制，改善實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理，提高檢驗(yàn)人員技術(shù)技能。特別是CNAS評(píng)審專(zhuān)家現(xiàn)場(chǎng)提供盲樣測(cè)試，可以直接展示實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)能力，有效地補(bǔ)充和支持評(píng)審專(zhuān)家的評(píng)審工作，證實(shí)實(shí)驗(yàn)室對(duì)程序、方法和其他運(yùn)作的有效控制。參加CNAS組織的微生物檢測(cè)能力考核，有利于檢驗(yàn)人員掌握微生物檢驗(yàn)的理論知識(shí)和實(shí)操技能，提高實(shí)驗(yàn)室能力的可信度，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的不斷提高。