中藥中馬兜鈴酸快速檢測及分離技術(shù)研究進(jìn)展

邵 鑫，張 月，鄭雁雪，王圓圓，魏金霞，李遇伯

·綜 述·

中藥中馬兜鈴酸快速檢測及分離技術(shù)研究進(jìn)展

邵 鑫，張 月，鄭雁雪，王圓圓，魏金霞*，李遇伯*

天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617

馬兜鈴酸是一類廣泛存在于馬兜鈴屬及細(xì)辛屬植物中的硝基菲羧酸類化合物，因其具有不可逆轉(zhuǎn)的腎毒性，2000年6月，美國食品藥品監(jiān)督管理局下令停止進(jìn)口、制造和銷售含有馬兜鈴酸的原料及藥品。隨后，世界各國和地區(qū)紛紛暫停了含馬兜鈴酸藥物的使用。但目前，一些含有低劑量馬兜鈴酸的藥物仍在我國臨床上廣泛應(yīng)用，鑒于馬兜鈴酸的不良反應(yīng)，為保障臨床用藥安全和人民生命安全，對其進(jìn)行風(fēng)險評估具有重要意義。因此，對近年來馬兜鈴酸快速檢測和分離技術(shù)的原理、應(yīng)用、優(yōu)勢與不足進(jìn)行總結(jié)，以期為含馬兜鈴酸的中藥及其制劑的風(fēng)險控制及安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

中藥；馬兜鈴酸；快速檢測；分離；吸附劑

馬兜鈴酸屬于硝基菲羧酸類化合物，廣泛存在于馬兜鈴屬和細(xì)辛屬植物中，如馬兜鈴、細(xì)辛等[1-3]。馬兜鈴科中藥在傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著悠久的應(yīng)用歷史，被廣泛用作消炎劑、抗癌劑、鎮(zhèn)痛劑和利尿劑[4]。然而，20世紀(jì)90年代初比利時減肥藥事件報道后，攝入含馬兜鈴酸中藥引起腎功能衰竭的事件時有報道，馬兜鈴酸再一次被推到了輿論的風(fēng)口浪尖[5-7]。在此情況下，國內(nèi)外學(xué)者對馬兜鈴酸進(jìn)行了充分研究，證實馬兜鈴酸具有腎毒性和致癌性，與腎功能衰竭有關(guān)[8]。其中，馬兜鈴酸I作為馬兜鈴酸最具代表性的成分，毒性最強，且?guī)缀醮嬖谟谒械鸟R兜鈴科中藥中。由于馬兜鈴酸的不良反應(yīng)，一時之間，英國、美國、澳大利亞、日本和西班牙等國相繼對含馬兜鈴酸的中藥及其相關(guān)產(chǎn)品實行無限期禁用，整個中醫(yī)藥行業(yè)都受到嚴(yán)重波及。2003年，我國禁止了含高劑量馬兜鈴酸傳統(tǒng)中藥的使用[9-10]，但目前市場上仍存在馬兜鈴屬和細(xì)辛屬中藥及其制劑。據(jù)不完全統(tǒng)計，已上市的含馬兜鈴酸的中藥材及中成藥有300多種，其中《中國藥典》2020年版收載的中藥材和中成藥有55種。為加強對含馬兜鈴酸中藥材及中成藥的風(fēng)險評估，降低其對人體的危害，本文主要對近年來馬兜鈴酸快速檢測及分離技術(shù)的原理、應(yīng)用及優(yōu)勢與不足進(jìn)行總結(jié)，為相關(guān)中藥材及中成藥中馬兜鈴酸的分析提供參考，并為相關(guān)中藥及制劑的風(fēng)險控制及安全使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 馬兜鈴酸快速檢測方法

1.1 經(jīng)典的檢測方法

目前針對馬兜鈴酸的檢測分析方法大多依賴于紫外分光光度法、色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-13]。作為經(jīng)典的檢測分析方法，紫外分光光度法是通過測定待測物的吸光度對其含量進(jìn)行測定的一種光譜法，具有操作簡單、分析速度快的優(yōu)點，但由于該方法選擇性差，因此在復(fù)雜樣品檢測領(lǐng)域應(yīng)用中具有一定的局限性[14]。

由于紫外分光光度法不具有分離能力，選擇性差，因此，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了同時具有分離和分析能力的色譜法。常用于馬兜鈴酸檢測的色譜法包括薄層色譜法和高效液相色譜法。薄層色譜法作為一種簡單而經(jīng)濟的方法被廣泛用于化學(xué)和生物成分的定性分析，由于在固定相和流動相之間的親和力不同而具有不同移動速率的分析物在薄層色譜板上分離，噴以顯色劑或在紫外燈下可以檢測到形成的斑點[15]。高效液相色譜法被認(rèn)為是檢測方法中常用的色譜方法，通常用于分離不同類型的化合物，具有出色的分離能力[16]。其主要限制是便攜性和基于基質(zhì)效應(yīng)、樣品類型、樣品制備和校準(zhǔn)選擇的實際問題。因此，需要更先進(jìn)的檢測分析方法。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用日益廣泛。高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法是由具有高效分離能力的液相色譜和具有定性能力的質(zhì)譜結(jié)合的一種用于化合物定性和定量的重要分析方法，具有操作簡單、高效靈敏、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點，因此被用于解析化合物分子結(jié)構(gòu)或樣品的定性定量分析[17]。馬兜鈴酸經(jīng)典檢測方法的利弊見表1。

表1 馬兜鈴酸經(jīng)典檢測方法的特點

Table 1 Characteristics of traditional detection methods for aristolochic acids

檢測方法優(yōu)勢不足 紫外可見分光光度法分析速度快、操作簡單、應(yīng)用范圍廣適用于微量分析、待測物濃度不能過高、選擇性差 薄層色譜耗時少、設(shè)備簡單、成本低、可同時處理多個樣品、操作方便樣品易受空氣濕度和溫度影響、準(zhǔn)確度差、靈敏度和精密度較低 高效液相色譜高靈敏度、重現(xiàn)性好、選擇性好、準(zhǔn)確度高、易于重現(xiàn)設(shè)備昂貴、成本高、故障排除困難、耗時長、溶劑消耗多、需要專業(yè)人員操作 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用高通量、靈敏度高、準(zhǔn)確度高、選擇性好儀器設(shè)備昂貴、需要專業(yè)人員操作、靈敏度依賴于電離技術(shù)、耗時長

1.2 新型的快速檢測方法

鑒于經(jīng)典的檢測方法預(yù)處理步驟復(fù)雜和檢測耗時較長，因此，快速檢測方法作為一種監(jiān)管手段，成為加強相關(guān)中藥材及其制劑風(fēng)險評估的重要步驟，可有效降低臨床安全問題的出現(xiàn)。近年來，具有快速檢測、簡單的預(yù)處理以及更好的靈敏度和選擇性等顯著優(yōu)勢的馬兜鈴酸快速檢測方法發(fā)展迅速，主要包括熒光傳感器法、酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、膠體金免疫色譜法（colloidal gold immunochromatography assay，CGICA）和近紅外光譜法（near-infrared spectroscopy，NIRS）。

1.2.1 熒光傳感器法

（1）概述及檢測原理：熒光傳感器是一種由熒光基團(tuán)、識別元件和連接基團(tuán)構(gòu)成，將化學(xué)信號按一定規(guī)律轉(zhuǎn)換成光信號輸出的化學(xué)傳感器裝置（圖1）。其檢測原理為熒光猝滅機制，涉及光致電子轉(zhuǎn)移機制、熒光共振能量轉(zhuǎn)移機制、內(nèi)濾效應(yīng)及聚集誘導(dǎo)猝滅機制。其中，金納米粒子、共軛聚合物、光子晶體、石墨烯、納米材料和量子點是用于熒光傳感器的主要熒光材料[18]。

圖1 熒光傳感器示意圖

（2）應(yīng)用：目前，一些學(xué)者對熒光傳感器在馬兜鈴酸快速檢測領(lǐng)域中的應(yīng)用進(jìn)行了廣泛研究。Wu等[19]使用溶菌酶功能化的金納米團(tuán)簇（Lys-AuNCs）作為探針檢測馬兜鈴酸I，檢測可在幾秒內(nèi)完成，回收率為117.49%，結(jié)果準(zhǔn)確，同時對馬兜鈴酸I的檢測具有良好的選擇性。此外，在紫外燈照射下，Lys-AuNCs制備的紙基傳感器可肉眼直接、快速、特異性檢測馬兜鈴酸I。因此，紙基熒光傳感器為中藥中馬兜鈴酸I檢測提供了一種便攜式且簡單的方法。Liu等[20]設(shè)計合成了一種新型共軛聚合物［聚(2,5-二(聚乙二醇氧丁酸酯)-1,4-苯乙炔-ALT-1,4-苯乙炔)，PPE-OB-PEG］作為熒光傳感器，用于馬兜鈴酸I的檢測。結(jié)果PPE-OB-PEG的熒光強度隨馬兜鈴酸I濃度的升高而降低，且與馬兜鈴酸I相互作用在20 s內(nèi)達(dá)到平衡，對馬兜鈴酸I檢測具有較高的選擇性。在馬兜鈴酸I濃度為1.00×10?7～8.00×10?5μmol/L時，PPE-OB-PEG的熒光強度與馬兜鈴酸I的濃度呈線性關(guān)系。PPE-OB-PEG熒光傳感器應(yīng)用于龍膽瀉肝丸等中成藥中馬兜鈴酸I的檢測，結(jié)果準(zhǔn)確，證明其在中藥中馬兜鈴酸I快速檢測領(lǐng)域具有巨大潛力。李燦鵬等[21]申請的專利公開了一種檢測馬兜鈴酸I的熒光傳感器（CQDs-OVA@AuNCs），其應(yīng)用熒光猝滅的方法對馬兜鈴酸I進(jìn)行定量檢測。該專利申請的發(fā)明點在于克服了現(xiàn)有馬兜鈴酸I檢測技術(shù)過于復(fù)雜、檢測速度慢及對馬兜鈴酸I識別性較低的缺陷。

（3）潛在的優(yōu)勢與不足：熒光傳感器與馬兜鈴酸的經(jīng)典光譜分析方法相比，具有多方面的優(yōu)勢，如熒光傳感器具有靈敏度高、選擇性高、響應(yīng)快速、成本低和操作簡單等優(yōu)點[22-24]。但同時也存在一些局限性，大多數(shù)熒光傳感器在進(jìn)行檢測分析時必須依賴于熒光分光光度計。另外，共軛聚合物作為熒光材料在空氣中暴露于紫外-可見光下不穩(wěn)定，進(jìn)而導(dǎo)致無法準(zhǔn)確進(jìn)行分析檢測。

1.2.2 ELISA

（1）概述及檢測原理：ELISA是一種免疫學(xué)分析方法，基于酶的特異性抗原-抗體識別和高效的生物催化特性，將酶與抗體或抗原結(jié)合，催化底物顯色轉(zhuǎn)化為可見的顏色信號，將其通過酶標(biāo)儀分析轉(zhuǎn)換成相應(yīng)的數(shù)字信號，實現(xiàn)對待測物的定量檢測分析[25-26]。ELISA被認(rèn)為是食品藥品安全、臨床診斷和環(huán)境監(jiān)測等應(yīng)用領(lǐng)域中的金標(biāo)準(zhǔn)方法[27-30]。常用的ELISA是間接競爭酶聯(lián)免疫吸附法（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，ic-ELISA），其檢測原理示意圖見圖2。

圖2 ic-ELISA檢測原理

（2）應(yīng)用：近年來，ic-ELISA被廣泛應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸的檢測分析。南鐵貴等[31]采用基于馬兜鈴酸I單克隆抗體的ic-ELISA方法對中藥及其制劑中的馬兜鈴酸I進(jìn)行了含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ic-ELISA測得馬兜鈴酸I的含量高于高效液相色譜法，認(rèn)為可能是由于馬兜鈴酸I單克隆抗體與馬兜鈴酸I結(jié)構(gòu)類似物發(fā)生了交叉反應(yīng)。鑒于馬兜鈴酸類成分均表現(xiàn)出毒性作用，此檢測分析法同樣具有實際應(yīng)用價值。Li等[32]采用免疫和細(xì)胞融合的方法篩選得到一種高特異性、高敏感性的單克隆抗體2A8，并建立了檢測中藥樣品中馬兜鈴酸Ⅰ的ic-ELISA和免疫層析試紙法。ic-ELISA對馬兜鈴酸I具有特異性檢測，免疫層析試紙視覺檢測極限和截止極限分別為0.25、0.5 μg/g，肉眼在5 min內(nèi)可獲得檢測結(jié)果。該方法可成功應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸I的現(xiàn)場檢測和大量樣品篩選。

（3）潛在優(yōu)勢與不足：ic-ELISA檢測法具有較高的靈敏度，檢測限可達(dá)ng/mL級，并且由于抗原與抗體的特異性識別而使其具有高度的選擇性[33]。與傳統(tǒng)的檢測分析方法（如液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用等）相比，ic-ELISA對樣品分析速度較快，可在短時間內(nèi)處理大量樣品，節(jié)省分析時間，降低成本[34]。但其洗滌步驟、孵化程序繁瑣，要求具有豐富經(jīng)驗的專業(yè)人員進(jìn)行操作，這些均限制了其應(yīng)用。其次，抗體的成本相對昂貴。采用ic-ELISA會存在抗體與密切相關(guān)的物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)的現(xiàn)象，對待測物的定量結(jié)果產(chǎn)生影響[35]。

1.2.3 CGICA

（1）概述及檢測原理：CGICA是一種以酶聯(lián)免疫吸附法、單克隆抗體技術(shù)和膠體金免疫技術(shù)為基礎(chǔ)的新型體外診斷方法（圖3）[36]。其檢測原理為將樣品滴加到樣品墊上，樣品通過虹吸作用原理流動至金標(biāo)結(jié)合墊上，如果樣品中含有待測物質(zhì)，待測物質(zhì)與金標(biāo)抗體結(jié)合后不再與包被抗原反應(yīng)，T線不顯色；若樣品中不含有待測物質(zhì)，金標(biāo)抗體則與包被抗原反應(yīng)，T線顯色[37]。CGICA法最初用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，后來逐漸應(yīng)用于藥物檢測[38]和環(huán)境污染監(jiān)測[39]等領(lǐng)域。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，近10年來CGICA應(yīng)用領(lǐng)域擴展至中藥材真?zhèn)舞b別及質(zhì)量的檢測[40]。

圖3 CGICA示意圖的側(cè)視圖(A) 和俯視圖 (B)

（2）應(yīng)用：目前，CGICA法已應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸的分析檢測。周堅等[41]申請的發(fā)明專利公開了一種馬兜鈴酸I的快速檢測卡。該快速檢測卡主要由含抗馬兜鈴酸I單克隆抗體膠體金（或乳膠顆粒）標(biāo)志物的玻璃纖維膜組成，通過免疫學(xué)特異性的方法對中藥及中成藥中含有的馬兜鈴酸I進(jìn)行檢測。此檢測卡操作簡單、檢測迅速，能對復(fù)雜中藥及中成藥中的馬兜鈴酸I實現(xiàn)特異性檢測。

（3）潛在的優(yōu)勢與不足：與傳統(tǒng)檢測方法相比，CGICA法具有多種優(yōu)勢。膠體金呈紅色，無需顯色標(biāo)記和復(fù)雜的操作技巧，肉眼可在短時間內(nèi)觀察到結(jié)果[42-43]；不需要昂貴的設(shè)備，對操作人員要求不高，結(jié)果判斷直觀，適合于現(xiàn)場和批量檢測；無需添加化學(xué)試劑，避免ELISA等繁瑣的洗滌步驟[44]；所需樣品量少（50～150 μL）[45]。但是CGICA法只能用于定性或半定量檢測，無法實現(xiàn)對待測物的準(zhǔn)確定量分析[46]。

1.2.4 NIRS

（1）概述及檢測原理：NIRS是一種快速且無損的分析方法，基于樣品中分子基團(tuán)（C-H、N-H和O-H）的振動吸收，測定相應(yīng)的光譜，利用其組成或性質(zhì)的相關(guān)數(shù)據(jù)庫，采用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)方法建立準(zhǔn)確的校正模型，將未知樣品與建立的校正模型進(jìn)行比較，實現(xiàn)對樣品的定性和定量分析[47]。圖4顯示了NIRS檢測分析技術(shù)流程圖。目前該方法已成功應(yīng)用于定性檢測、定量分析和質(zhì)量控制等領(lǐng)域[48]。

圖4 NIRS的技術(shù)流程圖

（2）應(yīng)用：近年來，NIRS已應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸的檢測研究。黃婷等[49]運用NIRS方法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法對關(guān)木通、川木通和含有不同濃度馬兜鈴酸I的淀粉樣本中的馬兜鈴酸進(jìn)行定性和定量分析。結(jié)果顯示，定性分析模型可準(zhǔn)確檢測馬兜鈴酸，利用NIRS結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可準(zhǔn)確定量中藥制劑中馬酸鈴酸的含量。證明NIRS可作為一種檢測中藥制劑中馬兜鈴酸含量的可靠的新方法。

（3）潛在的優(yōu)勢與不足：NIRS作為一種檢測分析方法，具有多種優(yōu)勢。分析速度快，一般可在30 s內(nèi)完成；無試劑，檢測中不產(chǎn)生廢物，是一種綠色環(huán)保的檢測方法；成本低，且一次樣品采集可同時檢測多種指標(biāo)[50]；無損傷，不需破壞樣品[51]；操作簡單。此外，NIRS也不是盡善盡美的，也存在一些缺點。對檢測物質(zhì)的內(nèi)部成分要求高，要求成分均勻，對受檢對象的溫度有要求，否則容易造成數(shù)據(jù)偏差大；需依靠其他學(xué)科建立模型，方可進(jìn)行下一步的分析鑒定；掃描出的某些光譜帶特征性不強，峰值不強，重疊譜帶多造成測定結(jié)果不太靈敏，易受樣品成分復(fù)雜程度的影響[52-53]；NIRS易受外界因素的影響，儀器、溫度、濕度、裝樣條件及樣品檢測部位等都會導(dǎo)致吸收峰的變化，使NIRS解析更加復(fù)雜化[54]。

新型快速檢測方法的特點見表2。

表2 馬兜鈴酸新型快速檢測方法的特點

Table 2 Characteristics of new rapid detection methods for aristolochic acids

新型快速檢測方法共同優(yōu)點優(yōu)點不足之處 熒光傳感器高靈敏度、高選擇性、高效率成本低、操作簡單依賴于儀器設(shè)備、共軛聚合物在空氣中暴露于紫外-可見光不穩(wěn)定 ic-ELISA短時間內(nèi)可處理大量樣品依賴于儀器設(shè)備、要求經(jīng)驗豐富的專業(yè)人員、抗體可能與密切相關(guān)的物質(zhì)發(fā)生交叉反應(yīng)、抗體昂貴 CGICA結(jié)果直觀可見、不需要昂貴的設(shè)備、操作簡單、所需樣品量少定性或半定量檢測 NIRS 分析速度快、操作簡單、無損傷、綠色、環(huán)保、多組分同時檢測對檢測物質(zhì)的內(nèi)部成分要求高、易受外界因素的影響

2 馬兜鈴酸分離富集方法

馬兜鈴酸的毒性作用嚴(yán)重限制了含馬兜鈴酸中藥及其制劑的臨床應(yīng)用。為降低含馬兜鈴酸中藥的毒性，國內(nèi)外眾多研究者進(jìn)行了廣泛的研究，在不影響藥材中其他藥效成分的情況下，分離富集馬兜鈴酸，達(dá)到去毒存效的目的。近年來，已報道的馬兜鈴酸分離富集的方法主要為固相萃取法（solid phase extraction，SPE）和超臨界流體萃取法（supercritical fluid extraction，SFE）。

2.1 SPE

SPE是一種通過添加吸附劑，對待測組分進(jìn)行吸附、洗脫等步驟，實現(xiàn)吸附劑對待測組分選擇性分離富集的一種方法。近年來，金屬-有機框架（metal organic frameworks，MOFs）、分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）、碳納米管和大孔吸附樹脂（macroporous adsorption resin，MAR）等材料逐漸作為吸附劑應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸的固相萃取過程中，大大提高了分離富集效率和選擇性。

2.1.1 MOFs

（1）概述及分離富集原理：MOFs材料是新興的多孔材料，通常由金屬節(jié)點和有機連接體之間形成配位鍵構(gòu)成[55]。在分離富集過程中，MOFs材料作為主體，其內(nèi)部規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)可為待測物質(zhì)提供空間，同時，通過氫鍵、π-π堆積和靜電作用等超分子作用，可選擇性地分離富集待測物質(zhì)。其分離富集示意圖見圖5。

（2）應(yīng)用：近年來，越來越多的學(xué)者將MOFs材料應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸的分離富集研究。Shu等[56]將三聚氰胺修飾到MOFs材料上，獲得了比表面積高、形態(tài)均勻的復(fù)合材料，表現(xiàn)出對馬兜鈴酸I的高吸附容量、高選擇性和高吸附分離效率。以該材料為吸附劑，應(yīng)用于微固相萃取，可選擇性識別和分離富集中藥中的馬兜鈴酸I。Zhang等[57]通過原位聚合方法以功能化的UiO-66-NH2和-甲基丙烯酰胺為常用單體合成了MOFs復(fù)合材料，并將其用作固相萃取的吸附劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法操作簡單、回收率高，可用于中藥中馬兜鈴酸I的分離富集。Fang等[58]為了有效和選擇性地分離馬兜鈴酸I，將離子液體和MIPs固定于MOFs材料ZIF-67，在甲醇-水（95∶5）體系中于39 ℃、138 min時對馬兜鈴酸I的最高吸附量為34.25 mg/g。將其用于固相萃取的吸附劑，經(jīng)上樣、洗滌和洗脫過程后，從天仙藤提取物中分離0.043 mg/g馬兜鈴酸I，回收率為97.67%～106.98%，表明MOFs材料可成功分離富集馬兜鈴酸I。

（3）潛在的優(yōu)勢與不足：MOFs材料具有高比表面積、高孔隙率的優(yōu)勢。通過改變有機和無機組分的組合，可非常靈活、合理地調(diào)整MOFs的幾何形狀、結(jié)構(gòu)、組成和性能[59]。基于以上獨特的優(yōu)勢，對目標(biāo)分析物表現(xiàn)出較高的吸附能力和高選擇性分離性能。但MOFs材料在水中不穩(wěn)定，結(jié)構(gòu)易坍塌，金屬離子泄露會對待測樣品產(chǎn)生二次污染。此外，合成后得到的MOFs材料，其表面和孔道內(nèi)會殘留一些在合成過程中所用的有機溶劑、金屬鹽和配體等物質(zhì)，這些殘留物質(zhì)通常會降低材料的比表面積、堵塞其孔道，對后續(xù)應(yīng)用產(chǎn)生影響，因此通常采用有機溶劑對其浸泡、洗滌以去除表面和孔道內(nèi)殘留的金屬鹽和有機配體，但這一過程消耗有機溶劑和時間[60]。

2.1.2 MIPs

（1）概述及分離富集原理：分子印跡法是由功能性單體、交聯(lián)劑和以目標(biāo)分析物或結(jié)構(gòu)類似物作為模板合成特定MIPs的一種方法，其原理為去除模板后，MIPs中會產(chǎn)生與目標(biāo)分析物或結(jié)構(gòu)類似物大小、形狀和功能互補的空腔，使MIPs具有特異性識別和吸附目標(biāo)分析物或結(jié)構(gòu)類似物的作用[61-62]。圖6顯示了MIPs制備過程。

圖6 MIPs制備示意圖

（2）應(yīng)用：目前，國內(nèi)外學(xué)者將MIPs廣泛應(yīng)用于中藥中馬兜鈴酸的分離去除研究。Xiong等[63]通過表面分子印跡法合成了熱敏和磁性MIPs，對馬兜鈴酸I表現(xiàn)出優(yōu)越的吸附性能、選擇性和快速磁分離能力。采用分散SPE分離富集魚腥草中的馬兜鈴酸I，回收率為79.03%～99.67%。張悅美等[64]運用表面分子印跡法合成了核-殼結(jié)構(gòu)SiO2表面分子印跡復(fù)合材料（SiO2@MIP NPs），其表現(xiàn)出對馬兜鈴酸I高的吸附性能和選擇性吸附效果。將SiO2@MIP NPs用于加標(biāo)中藥川木通中馬兜鈴酸I的吸附，可有效將馬兜鈴酸I去除，回收率為73%～83%。陸雅婷等[65]以Fe3O4為載體，制備了磁性MIPs，并將其應(yīng)用于馬兜鈴酸I的吸附，結(jié)果表明，其對馬兜鈴酸I具有高吸附容量，為實現(xiàn)中藥中馬兜鈴酸I的分離富集提供了一種新思路。

Xiao等[66]通過RAFT沉淀聚合技術(shù)以馬兜鈴酸I為模板分子成功制備了MIPs，在結(jié)構(gòu)類似物的存在下，證明了MIPs對馬兜鈴酸Ⅰ優(yōu)良的選擇性分離富集性能，并能夠成功從關(guān)木通提取液中選擇性分離富集馬兜鈴酸I。Wang等[67]采用虛擬模板分子1,10-菲咯啉-4-羧酸制備了分子印跡二氧化硅材料，結(jié)果表明二氧化硅與馬兜鈴酸I的親和力強（8.12 mg/g），同時，其對馬兜鈴酸I表現(xiàn)出優(yōu)異的特異性識別能力，成功從朱砂蓮根提取物中分離富集馬兜鈴酸I。

Ge等[68]使用毒性較小的氧氟沙星為虛擬模板，制備了表面MIPs，并將其作為固相萃取的吸附劑，用于中藥中馬兜鈴酸I的選擇性分離。結(jié)果表明，馬兜鈴酸I富集可達(dá)16倍，能夠選擇性分離馬兜鈴酸I。傅強等[69]申請的發(fā)明專利公開了一種應(yīng)用MIPs從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測微量馬兜鈴酸I的方法，結(jié)果顯示，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)馬兜鈴酸I的特異性富集，且具有富集容量高、操作簡單的特點。

（3）潛在的優(yōu)勢與不足：MIPs具有穩(wěn)定性高的優(yōu)點，包括耐壓、耐高溫等。其次，MIPs結(jié)構(gòu)可設(shè)計，根據(jù)目標(biāo)物質(zhì)，有針對性地設(shè)計制備出具有選擇性的MIPs，從而實現(xiàn)對目標(biāo)物質(zhì)的有效分離。此外，MIPs還具有特異識別性，MIPs與模板分子在空間結(jié)構(gòu)、尺寸大小上完全吻合，因此，能夠特異性識別目標(biāo)物質(zhì)。但MIPs依然存在較多問題，如聚合方法和功能單體的種類有局限性，不能滿足某些分子的識別分離要求；MIPs合成過程模板分子難以從孔中完全洗脫，需要消耗大量溶劑；MIPs是一個高度交聯(lián)的聚合物，使得模板分子在MIPs中的擴散緩慢且印跡孔穴埋藏過深不便使用[70]。

2.1.3 碳納米管

（1）概述及分離富集原理：碳納米管是一種由單層或多層石墨卷曲形成的中空管狀結(jié)構(gòu)的碳基材料，按其分層方式，分為單壁碳納米管和多壁碳納米管[71]。碳納米管對目標(biāo)分析物的分離富集受多種相互作用（π-π、氫鍵、共價鍵、靜電相互作用和疏水作用）的影響[72]，此外，還受孔道結(jié)構(gòu)（孔徑大小、分布和孔形狀）的影響，只有當(dāng)目標(biāo)分析物分子的直徑小于碳納米管的孔徑時，才能被吸附到碳納米管的吸附位點上[73]。其分離富集原理示意圖見圖7。

圖7 碳納米管分離富集原理示意圖

（2）應(yīng)用：近年來，碳納米管已廣泛應(yīng)用于馬兜鈴酸的吸附分離。Shu等[74]設(shè)計合成了一種腺嘌呤修飾的磁性碳納米管復(fù)合材料，其通過π- π相互作用、氫鍵作用和靜電作用對馬兜鈴酸I表現(xiàn)出良好的吸附性能（24.5 μg/mg）。將其作為吸附劑，進(jìn)行磁性固相萃取，馬兜鈴酸I和馬兜鈴酸II回收率分別為92.7%～97.5%、92.6%～99.4%，表明腺嘌呤修飾的磁性碳納米管復(fù)合材料能夠從復(fù)雜基質(zhì)中有效富集和分離馬兜鈴酸。Li等[75]合成的MIPs功能化的磁性碳納米管（MCNTs@AAI-MIPs）對馬兜鈴酸I具有快速的分離速率（10 s），較短的動力學(xué)平衡時間（15 min）和良好的選擇性（印跡因子3.17）。此外，MCNTs@AAI-MIPs對中藥中馬兜鈴酸I的回收率范圍為80%～110%（RSD值為3.27%～8.16%），證明其可以有效且特異性地從實際復(fù)雜的中藥中分離富集馬兜鈴酸I。

（3）潛在的優(yōu)勢與不足：碳納米管由于具有疏水性、高比表面積、層狀中空結(jié)構(gòu)、豐富的官能團(tuán)、結(jié)構(gòu)可調(diào)、高機械強度和化學(xué)穩(wěn)定性等特點，對目標(biāo)分析物具有很強的吸附分離能力[76-78]。但碳納米管在多種溶劑中溶解性較差，限制了其在多種領(lǐng)域的應(yīng)用，需對其進(jìn)行修飾。

2.1.4 MAR

（1）概述及分離富集原理：MAR是一種具有空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的人工多孔聚合物，同時是具有吸附性和篩選性原理的一種分離介質(zhì)。利用與被吸附物質(zhì)之間的范德華作用力，通過其巨大的比表面積進(jìn)行物理吸附，以及篩選性，篩選得到相對分子質(zhì)量大小匹配的物質(zhì)，達(dá)到分離富集的目的[79-80]。

（2）應(yīng)用：近年來，MAR已成功應(yīng)用于馬兜鈴科植物中馬兜鈴酸的分離去除。王翰[81]研究關(guān)木通中馬兜鈴酸的分離工藝，采用MAR分離關(guān)木通中的馬兜鈴酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，關(guān)木通提取物經(jīng)MAR處理后，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到41%，證明MAR可用于分離去除關(guān)木通中的馬兜鈴酸。

（3）潛在的優(yōu)勢與不足：MAR具有比表面積大、吸附容量大、吸附速度快、解吸條件溫和、可回收、化學(xué)穩(wěn)定性好、運行成本低、效率高、溶劑消耗少、壽命長、選擇性好等優(yōu)點，是一種很有前景的吸附劑。在單一MAR分離方法中，由于不同MAR的結(jié)構(gòu)參數(shù)不同，對于具有相似結(jié)構(gòu)組分的分離，回收率和分離效果較差。因此，有必要對MAR進(jìn)行篩選和組合[82]。但篩選和組合出分離效率最佳的MAR工作量巨大。

2.2 SFE

2.2.1 概述及分離富集原理 超臨界流體（supercritical fluid，SCF）是溫度和壓力高于其臨界點的流體。SFE采用SCF為萃取溶劑，利用SCF的溶解能力（極性）可通過控制流體的溫度和壓力調(diào)節(jié)，從而可選擇性地提取分離多種化合物[83]。SFE工藝流程示意圖見圖8。目前，大多以二氧化碳作為首選萃取溶劑，稱為超臨界二氧化碳萃取。

圖8 SFE工藝流程的示意圖

2.2.2 應(yīng)用 目前，已有研究者將SFE應(yīng)用于馬兜鈴植物中馬兜鈴酸的分離去除研究。如Liang等[84]采用SFE分離去除馬兜鈴和關(guān)木通中的馬兜鈴酸。以容器壓力19.4 MPa，溫度50 ℃，夾帶劑濃度0.2摩爾分?jǐn)?shù)，萃取時間4 h為SCF萃取條件。結(jié)果顯示，馬兜鈴和關(guān)木通中馬兜鈴酸Ⅰ的去除率分別為65.2%、59.1%，馬兜鈴酸II的去除率分別為81.3%、81.2%，證實了采用SFE從2種代表性馬兜鈴植物中去除有毒成分馬兜鈴酸的可行性。

2.2.3 潛在的優(yōu)勢與不足 SFE是經(jīng)典和傳統(tǒng)溶劑萃取的一種很有前途的替代方法，它具有各種獨特的優(yōu)勢。如分離效率高、分析時間短；提取分離過程中，不使用有機溶劑，減少對人類健康和環(huán)境的不利影響，是一種綠色的分離方法[85]；通過調(diào)節(jié)溫度和壓力實現(xiàn)對待測成分的選擇性提取分離，操作簡單；二氧化碳具有毒性低、易燃性、可回收、成本低及純度高等優(yōu)點[86]。盡管SFE具有多種優(yōu)勢，但仍然存在局限性。購買設(shè)備、啟動和運行該過程的成本很高，另外，SFE難以分離強極性組分，需添加有機溶劑作為改性劑提高分離效率，但在凈化步驟中需分離改性劑[87]。

馬兜鈴酸2種分離富集方法具有分離能力強、選擇性高的共同優(yōu)點，其具體特點見表3。

3 結(jié)語與展望

中藥是中醫(yī)學(xué)的瑰寶和靈魂，是中華民族幾千年歷史長河中沉淀下來的寶貴財富。馬兜鈴科中藥具有顯著的抗炎、抗癌和利尿作用，常被用于治療多種疾病。馬兜鈴科中藥毒性事件的報道造成人們對其毒性的關(guān)注大于其功效作用。然而藥物作用具有雙重性，通過合理的手段對其毒性進(jìn)行控制，達(dá)到去毒存效的目的，含馬兜鈴酸中藥仍能發(fā)揮重要功效[88]。為發(fā)揮馬兜鈴科中藥的藥用價值和提高其用藥安全性，加強其安全性評價及風(fēng)險控制研究，迫切需要對馬兜鈴科中藥中的馬兜鈴酸進(jìn)行檢測與分離?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀，現(xiàn)有的快速檢測技術(shù)檢測效率高，但大多依賴于檢測分析儀器。由于CGICA不依賴于分析儀器，所以未來可在CGICA試紙條的研究方面加大力度，實現(xiàn)對馬兜鈴酸的現(xiàn)場快速檢測?，F(xiàn)有的分離富集馬兜鈴酸所采用的吸附劑存在各自的特點。MOFs材料結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，會引發(fā)二次污染；MIPs印跡孔穴埋藏過深不便使用；碳納米管需進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾實現(xiàn)對其選擇性分離富集；MAR在組合和篩選環(huán)節(jié)中工作量較大。考慮到馬兜鈴科中藥的藥理作用，開發(fā)一種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及綠色、環(huán)保的吸附材料是未來的研究方向。共價有機框架材料作為一種新興的多孔材料，其較高的比表面積、可調(diào)節(jié)的孔徑、規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)和較高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，使其在吸附領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，未來可設(shè)計一種共價有機框架材料用于馬兜鈴科中藥中馬兜鈴酸的分離，為保障含馬兜鈴酸藥材與制劑的風(fēng)險控制提供科學(xué)依據(jù)與參考。

表3 馬兜鈴酸分離富集方法的特點

Table 3 Characteristics of enrichment methods for aristolochic acids

分離富集方法吸附劑優(yōu)點不足之處 SPEMOFs材料高比表面積、靈活的功能金屬位點結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、材料處理消耗時間 MIPs高穩(wěn)定性聚合方法和功能單體種類有局限性、模板分子擴散緩慢且印跡孔穴埋藏過深 碳納米管疏水性、高比表面積、官能團(tuán)豐富、化學(xué)穩(wěn)定性好溶解性較差 MAR吸附速度快、化學(xué)穩(wěn)定性好、成本低、溶劑消耗少篩選和組合分離效率最佳的MAR工作量巨大 SFE 效率高、無有機溶劑、操作簡單成本高、難以分離強極性組分

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Research progress on rapid detection and separation techniques of aristolochic acids in traditional Chinese medicine

SHAO Xin, ZHANG Yue, ZHENG Yan-xue, WANG Yuan-yuan, WEI Jin-xia, LI Yu-bo

School of Traditional Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

Aristolochic acids are a kind of nitro-phenanthrene carboxylic acid compounds widely existing inspecies andspecies. Because of their irreversible nephrotoxicity, the US Food and Drug Administration ordered to stop importing, manufacturing and selling raw materials and medicines containing aristolochic acids in June, 2000. Subsequently, countries and regions around the world have suspended the use of medicines containing aristolochic acids. However, at present, some drugs containing low-dose aristolochic acids are still widely used clinically in China. In view of the toxic and side effects of aristolochic acids, it is of great significance to carry out risk assessment to ensure the safety of clinical medication and people’s lives. Therefore, the principle, application, advantages and disadvantages of rapid detection and separation technologies of aristolochic acids in recent years were summarized in this paper, in order to provide scientific basis for risk control and safe use of traditional Chinese medicine and their preparations containing aristolochic acids.

traditional Chinese medicine; aristolochic acids; rapid detection; separate; adsorbent

R284.1

A

0253 - 2670(2022)19 - 6200 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.19.026

2022-06-20

國家自然科學(xué)基金面上項目（81873194）；國家中醫(yī)藥管理局青年岐黃學(xué)者支持項目

邵 鑫（1996—），女，碩士研究生，研究方向為中藥安全性評價研究。E-mail: shaoxin969@163.com

魏金霞（1987—），女，講師，研究方向為中藥安全性評價研究。E-mail: syykdxwjx410@163.com

李遇伯（1978—），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥安全性評價研究。E-mail: yaowufenxi001@sina.com

[責(zé)任編輯 崔艷麗]