• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    穩(wěn)定低表達(dá)GSNOR細(xì)胞系Neuro-2a的構(gòu)建及其對(duì)S-亞硝基化的影響*

    2022-10-13 05:40:26嚴(yán)潔萍韓臻平李婷婷王思懿高立羅雙李漢兵黃萍
    中國(guó)病理生理雜志 2022年9期
    關(guān)鍵詞:亞硝基谷胱甘肽細(xì)胞系

    嚴(yán)潔萍, 韓臻平, 李婷婷, 王思懿, 高立, 羅雙, 李漢兵, 黃萍,3

    穩(wěn)定低表達(dá)細(xì)胞系Neuro-2a的構(gòu)建及其對(duì)-亞硝基化的影響*

    嚴(yán)潔萍1,2,3△, 韓臻平1, 李婷婷2, 王思懿1, 高立2, 羅雙2, 李漢兵1, 黃萍2,3

    (1浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2浙江省人民醫(yī)院/杭州醫(yī)學(xué)院附屬人民醫(yī)院臨床藥學(xué)中心藥學(xué)部,浙江 杭州 310014;3浙江省內(nèi)分泌腺體疾病診療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江 杭州 310014)

    探討轉(zhuǎn)染慢病毒載體構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)-亞硝基谷胱甘肽還原酶(-nitrosoglutathione reductase,)的小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤Neuro-2a細(xì)胞系,并考察穩(wěn)定低表達(dá)對(duì)-亞硝基化修飾水平的影響。構(gòu)建靶向的慢病毒載體,用LipoFiter?脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Neuro-2a細(xì)胞,并用嘌呤霉素篩選穩(wěn)定低表達(dá)的細(xì)胞系。光鏡觀察Neuro-2a細(xì)胞的形態(tài)變化,CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同時(shí)間后的細(xì)胞活力,RT-qPCR和Western blot檢測(cè)GSNOR的mRNA和蛋白表達(dá)水平。生物素轉(zhuǎn)換法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)總-亞硝基化蛋白水平。HBLV-m-ADH5-shRNA1-PURO慢病毒載體序列與目的序列結(jié)果一致,提示慢病毒載體構(gòu)建成功。嘌呤霉素篩選后,光鏡觀察Neuro-2a細(xì)胞形態(tài)良好,CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在24、48、72和96 h時(shí)點(diǎn)細(xì)胞活力無(wú)顯著差異,提示轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。轉(zhuǎn)染第2、4和6代后細(xì)胞內(nèi)GSNOR mRNA水平分別是空載病毒組的37.02%、40.66%和30.13%,均顯著降低(<0.01),GSNOR蛋白表達(dá)水平較空載病毒組亦顯著下降(<0.01)。此外,穩(wěn)定低表達(dá)的Neuro-2a細(xì)胞中蛋白-亞硝基化修飾水平顯著上調(diào)(<0.01)。穩(wěn)定低表達(dá)的Neuro-2a細(xì)胞系構(gòu)建成功,低表達(dá)可上調(diào)胞內(nèi)總蛋白的-亞硝基化修飾水平。

    -亞硝基谷胱甘肽還原酶;慢病毒;Neuro-2a細(xì)胞;-亞硝基化

    -亞硝基谷胱甘肽還原酶(-nitrosoglutathione reductase, GSNOR)被認(rèn)為是乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase, ADH)家族成員之一,為主要代謝乙醇的酶系。是編碼GSNOR的基因,位于人類4號(hào)染色體上(4q23-Chr4: 99993567-10000985)[1-2]。GSNOR的底物相較于其它類型的ADH有顯著區(qū)別,其主要底物是-亞硝基谷胱甘肽(-nitrosoglutathione, GSNO)和-羥甲基谷胱甘肽(-hydroxymethylglutathione, HMGSH)[3]。

    -亞硝基化(-nitrosylation)是由一氧化氮(nitric oxide, NO)介導(dǎo)的基于氧化還原反應(yīng)的一種修飾,作用位點(diǎn)在半胱氨酸(cysteine, Cys)巰基(?SH),Cys巰基被氧化修飾為-亞硝基硫醇(-nitrosothiols, SNOs),是一種常見(jiàn)的蛋白翻譯后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制[3]。GSNO是機(jī)體-亞硝基化的主要調(diào)控因子。GSNOR介導(dǎo)的去亞硝基化就是NO基團(tuán)從Cys巰基脫離,是NO信號(hào)通路的重要組分。GSNOR由NADH供能將GSNO催化轉(zhuǎn)換為中間產(chǎn)物GSNHOH,進(jìn)一步轉(zhuǎn)換為二硫鍵形式的氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione, GSSG),GSSG再次還原為含疏基形式的谷胱甘肽(glutathione, GSH),這一過(guò)程被稱為去亞硝基化[1, 4]。-亞硝基化水平因生理刺激而發(fā)生變化,一般由細(xì)胞表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo),信號(hào)介導(dǎo)的NOS激活與蛋白-亞硝基化程度增加之間的關(guān)聯(lián)廣泛存在。內(nèi)源性-亞硝基化具有很高的時(shí)空特異性,使有游離巰基的蛋白發(fā)生翻譯后-亞硝基化修飾,具有激活特定蛋白活性、核質(zhì)分布、蛋白穩(wěn)定性以及蛋白間相互作用,參與損傷修復(fù)、應(yīng)激狀態(tài)激活信號(hào)通路等生物活性,參與心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤等眾多疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[1-2]。

    GSNOR是目前腦中ADH主要成員,其參與大腦發(fā)育、神經(jīng)分化、血管生成及損傷保護(hù)等眾多病理生理過(guò)程。研究表明,過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致幼年和成年小鼠神經(jīng)元分化減少,這與組蛋白脫乙酰酶2(histone deacetylase 2, HDAC2)的去亞硝基化作用相關(guān)[5];過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)控神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor, NGF)抑制神經(jīng)突觸生長(zhǎng),降低神經(jīng)細(xì)胞分化比例;相反,敲除促進(jìn)神經(jīng)元分化,間接調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑和控制神經(jīng)元分化的基因表達(dá)[6]。上述研究均提示GSNOR參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后,提示GSNOR可作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展的重要潛在靶點(diǎn)。

    Neuro-2a細(xì)胞來(lái)源于小鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤,具有神經(jīng)生物學(xué)特性和內(nèi)分泌功能,一般用于毒性篩選、神經(jīng)分化、細(xì)胞損傷和藥物干預(yù)的體外模型[7]。GSNOR調(diào)控去亞硝基化的作用,已見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道其下游靶蛋白參與神經(jīng)發(fā)育、分化及損傷調(diào)控等重要過(guò)程[8-9]。本研究通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染和藥物篩選等方法,獲得穩(wěn)定低表達(dá)的Neuro-2a細(xì)胞系,對(duì)細(xì)胞系中GSNOR表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,并檢測(cè)轉(zhuǎn)染后Neuro-2a細(xì)胞內(nèi)S-亞硝基化水平,為進(jìn)一步深入發(fā)掘GSNOR的調(diào)控靶蛋白,研究其調(diào)控靶蛋白、細(xì)胞損傷保護(hù)和毒性篩選等作用機(jī)制提供體外細(xì)胞模型。

    材料和方法

    1 主要試劑及儀器

    DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco;和胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;PBS購(gòu)自浙江森瑞生物技術(shù)有限公司;胰酶-EDTA購(gòu)自HyClone;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購(gòu)自Sigma;LipoFiter?轉(zhuǎn)染試劑和嘌呤霉素購(gòu)自漢恒生物技術(shù)(上海)有限公司;Cell Counting Kit-8 (CCK-8)、RNA快速提取試劑盒和SYBR Green qPCR Mix等購(gòu)自上海奕杉生物科技有限公司;支原體預(yù)防去除試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Biotin Switch Assay Kit (-nitrosylation)和抗GSNOR抗體購(gòu)自Abcam;抗β-actin抗體和辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗購(gòu)自Cell Signaling Technology。

    倒置顯微鏡(Nikon);Synergy LX酶標(biāo)儀(BioTek);RT-qPCR儀(Roche);高速低溫離心機(jī)(Thermo Fisher);Ion Torrent 3500基因測(cè)序儀(Thermo Fisher Scientific);電泳儀電源和凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad)。

    2 細(xì)胞系和質(zhì)粒

    小鼠Neuro-2a細(xì)胞系(批號(hào):CCL-131)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所。pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO載體、psPAX2載體、pMD2G載體、基因干擾慢病毒及引物序列均由漢恒生物技術(shù)(上海)有限公司提供。

    3 主要方法

    3.1pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO質(zhì)粒的提取與鑒定將pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO載體、psPAX2載體和pMD2G載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后分別在48和72 h收集病毒上清液,并將病毒上清液超速離心,得到最終的慢病毒保存液,于-80 ℃冰箱保存。采用Ion Torrent 3500基因測(cè)序儀對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,并與目標(biāo)基因片進(jìn)行比對(duì)。

    3.2pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及嘌呤霉素篩選將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Neuro-2a細(xì)胞接種到12孔板,每孔1×105個(gè),放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)胞匯合率為30%~50%,加入50 μL病毒進(jìn)行感染,同時(shí)加入適量聚凝胺。感染約24 h后,棄去含有病毒的培養(yǎng)液,換上常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)液。感染48 h后,加入嘌呤霉素(4.0 mg/L)篩選。慢病毒感染48~72 h后,感染效率約在80%左右,且細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定,匯合率在60%~70%時(shí),加入嘌呤霉素(4.0 mg/L)進(jìn)行處理。加藥約48 h后觀察對(duì)照組細(xì)胞的存活率,若對(duì)照組細(xì)胞死亡率在90%以上,撤掉嘌呤霉素?fù)Q新鮮的培養(yǎng)液培養(yǎng)。

    3.3穩(wěn)定低表達(dá)的Neuro-2a細(xì)胞活力的檢測(cè)將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Neuro-2a細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后,以6×107/L的密度重懸接種于96孔板。貼壁培養(yǎng)24 h后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,并在450 nm處檢測(cè)吸光度()值。

    3.4RT-qPCR法檢測(cè)GSNOR的mRNA表達(dá)采用RNA快速提取試劑盒提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。加40 μL DEPC水(即濃度為10 mg/L)于cDNA,取2 μL加入八聯(lián)管中,再加上、下游引物(序列見(jiàn)表1)各0.5 μL,SYBR Green 5 μL,DEPC水2 μL。94 ℃變性10 min;40個(gè)循環(huán)依次做94 ℃變性10 s、60 ℃退火15 s和72 ℃延伸20 s;最后在72 ℃延伸90 s,并根據(jù)產(chǎn)物的溶解曲線,得到Ct值。用2-ΔΔCt法計(jì)算GSNOR mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

    表1 RT-qPCR引物序列

    3.5Western blot法檢測(cè)GSNOR的蛋白表達(dá)采用細(xì)胞蛋白裂解液對(duì)細(xì)胞裂解,進(jìn)行SDS-PAGE分離(10%分離膠),將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉,搖床1~2 h,分別加入抗GSNOR(1∶500)和抗β-actin(1∶3 000)抗體,搖床4 ℃過(guò)夜;再用T-TBS洗滌3次,每次10 min;加入Ⅱ抗。ECL顯色曝光。

    3.6生物素轉(zhuǎn)換法檢測(cè)-亞硝基化水平轉(zhuǎn)染后細(xì)胞用不含二硫蘇糖醇(1,4-dithio-DL-threitol, DTT)的細(xì)胞裂解液裂解,按生物素轉(zhuǎn)換法試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。通過(guò)離心清洗細(xì)胞并使其成沉淀。加入封閉緩沖液A,在4 ℃下離心30 min。取上清液,用冷丙酮沉淀。沉淀物用含有還原和標(biāo)記試劑的緩沖液B重懸后,再用冷丙酮沉淀,重懸后HRP標(biāo)記的Ⅱ抗進(jìn)行Western blot。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)比較采用檢驗(yàn)或單因素方差分析。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié)果

    1 pHBLV-U6-MCS-PGK-PURO質(zhì)粒鑒定結(jié)果

    基因測(cè)序結(jié)果顯示質(zhì)粒序列中包含5'-GATCCGACGAATTTGTGACCGGCAATCTCGAGATTGCCGTCACAAATTCGTCTTTTTTG-3'的堿基序列,結(jié)果與目的序列一致,提示質(zhì)粒構(gòu)建成功,見(jiàn)圖1。

    Figure 1. Sanger sequencing peak map of lentivirus transfer vector shRNA1-ADH5 fragment. DNA sequencing showed the sequence of recombinant plasmids of HBLV-m-ADH5 shRNA1 Puro lentivirus vector accorded with ADH5 gene sequence.

    2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞形態(tài)及活力的變化

    細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,通過(guò)光鏡觀察細(xì)胞形態(tài),發(fā)現(xiàn)第2、4和6代的轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組均無(wú)明顯差異,見(jiàn)圖2A。CCK-8結(jié)果顯示在24、48、72及96 h時(shí)點(diǎn)細(xì)胞活力無(wú)顯著差異,見(jiàn)圖2B。

    Figure 2. Morpholocical observation and cell viability were measured in the Neuro-2a cells after HBLV-m-ADH5-shRNA1 transfection. A: light microscopic micrographs were performed at the 2nd (P2), 4th (P4) and 6th (P6) passages; B: cell viability was assessed at the designated time points (24, 48,72 and 96 h) by CCK-8 assay. Mean±SD. n=6.

    3 RT-qPCR法檢測(cè)GSNOR的mRNA表達(dá)水平

    RT-qPCR結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,第2、4和6代細(xì)胞系中GSNOR mRNA的表達(dá)量分別為空載病毒組的37.02%、40.66%和30.13%,均顯著降低(<0.01),見(jiàn)圖3。

    Figure 3. The mRNA expression of GSNOR was determined by RT-qPCR. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sh-Control group.

    4 Western blot檢測(cè)GSNOR的蛋白表達(dá)水平

    Western blot結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,第2、4和6代細(xì)胞系中GSNOR蛋白的表達(dá)量均顯著降低(<0.01),見(jiàn)圖4。

    Figure 4. The protein expression of GSNOR in transfected Neuro-2a cells at the 2nd (P2), 4th (P4) and 6th (P6) passages was detected by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sh-Control group.

    5 胞內(nèi)S-亞硝基化水平變化

    生物素轉(zhuǎn)換法結(jié)果顯示,與sh-Control組相比,sh-ADH5轉(zhuǎn)染后Neuro-2a細(xì)胞胞內(nèi)-亞硝基化水平顯著上調(diào)(<0.01),見(jiàn)圖5。

    Figure 5. Cellular S-nitrosylation level was upregulated in transfected Neuro-2a cells. The S-nitrosylation level was detected by biotin switch method. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs sh-Control group.

    討論

    GSNOR介導(dǎo)的去亞硝基化是一種細(xì)胞受特殊刺激而產(chǎn)生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式,其可維持蛋白-亞硝基化的平衡,從而維持機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài),成為研究神經(jīng)退行性疾病關(guān)注的熱點(diǎn)之一。有研究報(bào)道敲除可顯著上調(diào)GSNO水平,從而影響-亞硝基化水平[10]。內(nèi)源性NO可促使一些特殊靶蛋白發(fā)生-亞硝基化,從而影響神經(jīng)元的活性和功能。

    GSNOR作為腦中主要的ADH成員,對(duì)大腦發(fā)育和神經(jīng)分化過(guò)程十分重要。研究表明,過(guò)表達(dá)導(dǎo)致幼年和成年小鼠神經(jīng)元分化減少,降低神經(jīng)細(xì)胞分化比例,抑制神經(jīng)突觸生長(zhǎng);而低表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)元分化,其調(diào)控機(jī)制均由-亞硝基化修飾異常導(dǎo)致[5]。GSNOR還可間接調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑和控制神經(jīng)元分化的基因表達(dá)[6]。這些研究均提示,GSNOR參與神經(jīng)發(fā)育、分化及神經(jīng)病變過(guò)程。

    雖然GSNOR介導(dǎo)特殊靶蛋白-亞硝基化的調(diào)控機(jī)制及特異性還未完全闡明,但越來(lái)越多的研究表明,parkin、Drp-1和CaMKIIα等蛋白的-亞硝基化已經(jīng)成為神經(jīng)退行性疾病病變過(guò)程的重要參與者。研究報(bào)道,老年人群的海馬體中GSNOR蛋白表達(dá)顯著上調(diào),而衰老小鼠海馬中CaMKIIα Cys280和Cys289位點(diǎn)-亞硝基化水平降低,并導(dǎo)致其在海馬突觸體中的累積量減少,上述現(xiàn)象可通過(guò)在小鼠模型上敲除得到逆轉(zhuǎn)[11]。另有研究報(bào)道,阿爾茨海默病患者大腦和外周血液中均存在Drp1的-亞硝基化,Drp1 Cys644位點(diǎn)的-亞硝基化激活GTP水解酶并形成二聚體,導(dǎo)致線粒體的過(guò)度碎片化,因能量代謝失調(diào)而最終導(dǎo)致樹(shù)突棘丟失和神經(jīng)元死亡[12]。此外,帕金森?。≒arkinson disease, PD)小鼠模型中parkin蛋白-亞硝基化上調(diào)Drp-1蛋白表達(dá),Drp-1及parkin的-亞硝基化修飾參與PD病變過(guò)程[13]。在PD細(xì)胞模型中,敲除可降低SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞毒性,起神經(jīng)保護(hù)作用[14]。上述研究均提示,進(jìn)一步探討GSNOR介導(dǎo)去亞硝基化修飾的分子機(jī)制研究,將有助于挖掘神經(jīng)退行性疾病的潛在新靶點(diǎn)。

    構(gòu)建穩(wěn)定低表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞模型有助于深入探討GSNOR調(diào)控神經(jīng)的生物學(xué)特性及-亞硝基化異常表達(dá)疾病的機(jī)制研究。短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)由含有特定核苷酸片段的質(zhì)粒表達(dá),進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)隨著細(xì)胞增殖而復(fù)制,在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)[15]。與小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)相比,其優(yōu)點(diǎn)在于能穩(wěn)定表達(dá)特異性核苷酸干擾片段,使得細(xì)胞特定基因和蛋白穩(wěn)定低表達(dá),適用于靶蛋白的后續(xù)研究[16]。本研究中,基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒包含干擾序列后,將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Neuro-2a細(xì)胞中,GSNOR的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低,表明穩(wěn)定低表達(dá)的Neuro-2a細(xì)胞系構(gòu)建成功。該細(xì)胞模型將為研究GSNOR調(diào)控神經(jīng)的生物學(xué)特性和神經(jīng)疾病模型的探索提供穩(wěn)定的體外模型。同時(shí),表達(dá)shRNA-的Neuro-2a細(xì)胞系呈現(xiàn)總蛋白-亞硝基化修飾水平上調(diào),為-亞硝基化修飾異常修飾參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究提供了潛在的細(xì)胞模型[17-18]。

    本研究采用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),基因測(cè)序結(jié)果證實(shí)質(zhì)粒包含干擾序列后將shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Neuro-2a細(xì)胞,構(gòu)建的Neuro-2a細(xì)胞系能穩(wěn)定低表達(dá)并易化細(xì)胞內(nèi)-亞硝基化水平,可用于后續(xù)GSNOR調(diào)控去亞硝基化的生物學(xué)作用及下游信號(hào)通路的研究。

    [1] Benhar M, Forrester MT, Stamler JS. Protein denitrosylation: enzymatic mechanisms and cellular functions[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2009, 10(10):721-732.

    [2] Gusarov I, Nudler E. Protein-nitrosylation: enzymatically controlled, but intrinsically unstable, post-translational modification[J]. Mol Cell, 2018, 69(3):351-353.

    [3] Rizza S, Filomeni G. Chronicles of a reductase: biochemistry, genetics and physio-pathological role of GSNOR[J]. Free Radic Biol Med, 2017, 110:19-30.

    [4] Fernando V, Zheng X, Walia Y, et al.-nitrosylation: an emerging paradigm of redox signaling[J]. Antioxidants (Basel), 2019, 8(9):404-435.

    [5] Wu K, Ren R, Su W, et al. A novel suppressive effect of alcohol dehydrogenase 5 in neuronal differentiation[J]. J Biol Chem, 2014, 289(29):20193-20199.

    [6] Wu K, Zhang Y, Wang P, et al. Activation of GSNOR transcription by NF-κB negatively regulates NGF-induced PC12 differentiation[J]. Free Radic Res, 2014, 48(9):1011-1017.

    [7] Zhang J, Zhou R, Cao G, et al. Guhong injection prevents ischemic stroke-induced neuro-inflammation and neuron loss through regulation of C5ar1[J]. Front Pharmacol, 2022, 13:818245-818257.

    [8] Cirotti C, Rizza S, Giglio P, et al. Redox activation of ATM enhances GSNOR translation to sustain mitophagy and tolerance to oxidative stress[J]. EMBO Rep, 2021:22(1):e50500.

    [9] Montagna C, Cirotti C, Rizza S, et al. When-nitrosylation gets to mitochondria: from signaling to age-related diseases[J]. Antioxid Redox Signal, 2020, 32(12):884-905.

    [10] Rizza S, Cardaci S, Montagna C, et al.-nitrosylation drives cell senescence and aging in mammals by controlling mitochondrial dynamics and mitophagy[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2018, 115(15):3388-3397.

    [11] Zhang Y, Wu K, Su W, et al. Increased GSNOR expression during aging impairs cognitive function and decreases-nitrosation of CaMKIIα[J]. J Neurosci, 2017, 37(40):9741-9758.

    [12] Cho DH, Nakamura T, Fang J, et al.-nitrosylation of Drp1 mediates β-amyloid-related mitochondrial fission and neuronal injury[J]. Science, 2009, 324(5923):102-105.

    [13] Zhang Z, Liu L, Jiang X, et al. The essential role of Drp-1 and its regulation by-nitrosylation of Parkin in dopaminergic neurodegeneration: implications for Parkinson's disease[J]. Antioxid Redox Signal, 2016, 25(11):609-622.

    [14] Rizza S, Cirotti C, Montagna C, et al.-nitrosoglutathione reductase plays opposite roles in SH-SY5Y models of Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015:536238.

    [15] 鐘娃, 夏忠勝, 于濤, 等. 利用Tet-On系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的小鼠ESC細(xì)胞株[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2021, 37(1):187-192.

    Zhong W, Xia ZS, Yu T, et al. Construction of mouse ESC line stably expressingby Tet-On system[J]. Chin J Pathophysiol, 2021, 37(1):187-192.

    [16] 趙良淵, 候曉敏, 秦小江. 慢病毒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因shRNA對(duì)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞鈣離子和鈣調(diào)蛋白的影響[J]. 中國(guó)病理生理雜志, 2018, 34(7):1306-1310.

    Zhao LY, Hou XM, Qin XJ. Effects of lentivirus-mediated transfection of shRNA targetinggene on calcium and calmodulin in rat aortic vascular smooth muscle cells[J]. Chin J Pathophysiol, 2018, 34(7):1306-1310.

    [17] Khan M, Kumar P, Qiao F, et al. Targeting GSNOR for functional recovery in a middle-aged mouse model of stroke[J]. Brain Res, 2020, 1741:146879-146886.

    [18] Dyer RR, Ford KI, Robinson RAS. The roles of-nitrosylation and-glutathionylation in Alzheimer's disease[J]. Methods Enzymol, 2019, 626:499-538.

    Construction ofknockdown stable Neuro-2a cell line and its effect on-nitrosylation

    YAN Jie-ping1,2,3△, HAN Zhen-ping1, LI Ting-ting2, WANG Si-yi1, GAO Li2, LUO Shuang2, LI Han-bing1, Huang Ping2,3

    (1,,,310014,2,,,,310014,3,310014,)

    To construct a mouse neuroblastoma Neuro-2a cell line with stable knockdown of-nitrosoglutathione reductase (), and to investigate its effect on-nitrosylation.The Neuro-2a cells were transfected with lentivirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) targetingby LipoFiter? liposomes, and those with stable knockdown ofwere screened with puromycin. Morphological changes of the cells were observed by light microscopy. The cell viability was detected by CCK-8 assay. The mRNA and protein expression levels of GSNOR were revealed by RT-qPCR and Western blot. Biotin switch method was used to detect the intracellular total-nitrosylation level in the cells.The fragment sequence inserted in the recombinant lentivirus was identical to the designed oligo sequence, and the HBLV-m-ADH5-shRNA1-PURO lentiviral vector was successfully constructed. After puromycin screening, transfected Neuro-2a cells were observed with normal morphological characteristics under light microscope. No significant difference in cell viability was observed at the time points of 24, 48, 72 and 96 h. The mRNA levels of GSNOR at the 2nd, 4th and 6th passages were 37.02%, 40.66% and 30.13% of those in the scrambled group, respectively (<0.01), and GSNOR protein expression was significantly lower than that in the scrambled group (<0.01). Moreover,shRNA significantly increased intracellular-nitrosylation levels in Neuro-2a cells (<0.01).The Neuro-2a cell line with stable low expression ofwas successfully constructed. Knockdown ofin Neuro-2a cells increased-nitrosylation levels of intracellular total protein.

    -Nitrosoglutathione reductase; Lentivirus; Neuro-2a cells;-Nitrosylation

    1000-4718(2022)09-1547-06

    2022-04-24

    2022-06-23

    0571-85893117; E-mail: yanjieping@hmc.edu.cn

    R741.02; R363.2

    A

    10.3969/j.issn.1000-4718.2022.09.002

    [基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81903597);浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. LQ16H310003);浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目(No. 2021KY016; No. 2022KY061)

    (責(zé)任編輯:宋延君,李淑媛)

    猜你喜歡
    亞硝基谷胱甘肽細(xì)胞系
    內(nèi)源性NO介導(dǎo)的Stargazin亞硝基化修飾在腦缺血再灌注后突觸可塑性中的作用及機(jī)制
    蚯蚓谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶分離純化的初步研究
    分光光度法結(jié)合抗干擾補(bǔ)償檢測(cè)谷胱甘肽
    STAT3對(duì)人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響
    抑制miR-31表達(dá)對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞系遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制
    E3泛素連接酶對(duì)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    TBBPA對(duì)美洲鰻鱺谷胱甘肽代謝相關(guān)指標(biāo)的影響
    L-精氨酸高產(chǎn)菌株的亞硝基胍誘變選育和種子培養(yǎng)基的優(yōu)化研究
    乙烷基亞硝基脲誘變獲得一例小眼畸形小鼠及其遺傳實(shí)驗(yàn)
    七葉皂苷鈉與化療藥聯(lián)合對(duì)HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用
    一a级毛片在线观看| 丁香欧美五月| 亚洲精品亚洲一区二区| 波多野结衣高清作品| 观看美女的网站| 色播亚洲综合网| 一本久久中文字幕| 最近视频中文字幕2019在线8| 国产老妇女一区| 一区二区三区高清视频在线| 国产三级在线视频| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 中文字幕免费在线视频6| 色综合欧美亚洲国产小说| 十八禁国产超污无遮挡网站| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 精品久久国产蜜桃| 成人午夜高清在线视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久午夜福利片| 亚洲人成电影免费在线| 俺也久久电影网| 美女cb高潮喷水在线观看| xxxwww97欧美| 亚洲第一电影网av| 老司机午夜福利在线观看视频| 久久九九热精品免费| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产综合懂色| 很黄的视频免费| 欧美色欧美亚洲另类二区| 精品人妻熟女av久视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 欧美在线黄色| 3wmmmm亚洲av在线观看| 国产高清有码在线观看视频| 很黄的视频免费| 免费黄网站久久成人精品 | 久久久久久九九精品二区国产| 免费观看精品视频网站| 国产视频内射| 国产69精品久久久久777片| 国内精品久久久久久久电影| 在线看三级毛片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲最大成人中文| 亚洲最大成人手机在线| 久久亚洲真实| 国产人妻一区二区三区在| 毛片女人毛片| 国产真实乱freesex| 亚洲人与动物交配视频| 成人亚洲精品av一区二区| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产精品电影一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产午夜精品论理片| 成年版毛片免费区| 黄色配什么色好看| 精品国产亚洲在线| 日韩欧美精品v在线| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 高清在线国产一区| 亚洲成av人片在线播放无| 一级黄色大片毛片| 男人舔奶头视频| 在线观看免费视频日本深夜| 国语自产精品视频在线第100页| 757午夜福利合集在线观看| 成人国产综合亚洲| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲经典国产精华液单 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 女人被狂操c到高潮| 观看免费一级毛片| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 国产免费男女视频| 日本黄大片高清| 欧美bdsm另类| 哪里可以看免费的av片| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲,欧美精品.| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产真实伦视频高清在线观看 | 村上凉子中文字幕在线| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产不卡一卡二| 丁香欧美五月| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲自偷自拍三级| 一级毛片久久久久久久久女| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 97热精品久久久久久| 国产成人影院久久av| 99精品久久久久人妻精品| 欧美黄色淫秽网站| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 嫩草影院精品99| 亚洲精品久久国产高清桃花| 精品午夜福利视频在线观看一区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品电影一区二区三区| 国产精品亚洲美女久久久| 在线天堂最新版资源| 国产av在哪里看| 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲黑人精品在线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 韩国av一区二区三区四区| 在线天堂最新版资源| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产视频内射| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲片人在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品不卡视频一区二区 | 在线播放国产精品三级| 三级国产精品欧美在线观看| or卡值多少钱| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久久久久久成人| 一进一出好大好爽视频| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品国产高清国产av| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 欧美在线一区亚洲| 成年女人毛片免费观看观看9| 窝窝影院91人妻| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 中文资源天堂在线| 搞女人的毛片| 女同久久另类99精品国产91| 村上凉子中文字幕在线| 88av欧美| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 99热这里只有精品一区| 看黄色毛片网站| 身体一侧抽搐| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲国产精品999在线| 亚洲精品日韩av片在线观看| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 91字幕亚洲| 亚洲激情在线av| 亚洲18禁久久av| 午夜福利在线观看吧| 成年免费大片在线观看| 国产伦精品一区二区三区四那| 精品国产亚洲在线| 丰满的人妻完整版| 69av精品久久久久久| 欧美黄色淫秽网站| 中文资源天堂在线| 97碰自拍视频| 欧美黑人欧美精品刺激| 中国美女看黄片| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 国产精品一区二区性色av| 久久久精品大字幕| av天堂中文字幕网| 久久精品国产自在天天线| 九九热线精品视视频播放| 免费观看的影片在线观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产成人av教育| 免费观看精品视频网站| 九九在线视频观看精品| 人人妻人人澡欧美一区二区| 国产精品av视频在线免费观看| 一级毛片久久久久久久久女| 国产中年淑女户外野战色| 欧美潮喷喷水| 悠悠久久av| 美女黄网站色视频| 免费人成视频x8x8入口观看| x7x7x7水蜜桃| 全区人妻精品视频| 我要搜黄色片| 99热这里只有是精品50| 日韩中字成人| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 亚洲色图av天堂| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲av电影不卡..在线观看| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 日本一本二区三区精品| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产69精品久久久久777片| 全区人妻精品视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 九色国产91popny在线| 亚洲av五月六月丁香网| 国产亚洲欧美98| 女人被狂操c到高潮| 搡老熟女国产l中国老女人| av在线观看视频网站免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美日韩乱码在线| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲不卡免费看| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲专区中文字幕在线| 长腿黑丝高跟| 久久九九热精品免费| 亚洲人成网站高清观看| 麻豆成人av在线观看| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 在现免费观看毛片| 国语自产精品视频在线第100页| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 最好的美女福利视频网| 午夜免费激情av| 国产精品人妻久久久久久| 男女下面进入的视频免费午夜| 简卡轻食公司| av福利片在线观看| 亚洲av电影在线进入| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 免费看光身美女| 久久中文看片网| 国产精品亚洲av一区麻豆| 人妻夜夜爽99麻豆av| 欧美在线一区亚洲| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久精品欧美日韩精品| 级片在线观看| 国产精品98久久久久久宅男小说| 日韩欧美三级三区| www.www免费av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产乱人伦免费视频| 国产精品久久久久久精品电影| 免费搜索国产男女视频| 国产精品久久久久久久久免 | 亚洲成人中文字幕在线播放| 欧美激情在线99| 内地一区二区视频在线| 亚洲最大成人中文| 中文字幕久久专区| 国产精品伦人一区二区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产高清三级在线| 又紧又爽又黄一区二区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| а√天堂www在线а√下载| 亚洲成a人片在线一区二区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 此物有八面人人有两片| 亚洲自偷自拍三级| 免费观看的影片在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 久久久久久大精品| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久精品国产自在天天线| 老司机午夜十八禁免费视频| 国产精品一区二区性色av| 日本 欧美在线| 欧美乱色亚洲激情| 18禁在线播放成人免费| 午夜视频国产福利| 有码 亚洲区| 老女人水多毛片| 美女免费视频网站| 亚洲欧美日韩高清专用| 成人国产综合亚洲| av视频在线观看入口| 亚洲午夜理论影院| 亚洲熟妇熟女久久| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 午夜精品在线福利| 麻豆成人av在线观看| 最近中文字幕高清免费大全6 | 少妇高潮的动态图| 性色av乱码一区二区三区2| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 香蕉av资源在线| 精品午夜福利视频在线观看一区| 日本与韩国留学比较| 亚洲人成电影免费在线| 国内精品美女久久久久久| 国模一区二区三区四区视频| 欧美最新免费一区二区三区 | netflix在线观看网站| 在线免费观看的www视频| 色av中文字幕| 美女大奶头视频| 成人性生交大片免费视频hd| 身体一侧抽搐| 麻豆国产av国片精品| 女同久久另类99精品国产91| 一区二区三区免费毛片| 婷婷亚洲欧美| 欧美成人性av电影在线观看| 国产精品乱码一区二三区的特点| 深爱激情五月婷婷| 少妇的逼水好多| 88av欧美| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美午夜高清在线| 亚洲第一电影网av| 亚洲激情在线av| 亚洲人成网站在线播| 亚洲精品一区av在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 日韩精品中文字幕看吧| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲国产精品合色在线| 69人妻影院| 亚洲,欧美,日韩| 乱人视频在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 久久久精品欧美日韩精品| 真人做人爱边吃奶动态| 九九热线精品视视频播放| 免费人成在线观看视频色| 五月玫瑰六月丁香| 国产探花在线观看一区二区| 精品久久国产蜜桃| 国产在线男女| 一个人免费在线观看的高清视频| 看片在线看免费视频| 99在线人妻在线中文字幕| av在线老鸭窝| 亚洲18禁久久av| 国产色爽女视频免费观看| www.色视频.com| 欧美另类亚洲清纯唯美| 午夜福利欧美成人| 日本三级黄在线观看| 亚洲片人在线观看| 99久久成人亚洲精品观看| 久久亚洲精品不卡| 直男gayav资源| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 夜夜爽天天搞| av天堂中文字幕网| 日本一二三区视频观看| 不卡一级毛片| 99精品久久久久人妻精品| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲成人久久爱视频| 日韩免费av在线播放| 久久久国产成人免费| 三级国产精品欧美在线观看| 国产美女午夜福利| av中文乱码字幕在线| 亚洲人成电影免费在线| 97碰自拍视频| 国产69精品久久久久777片| 久久人人精品亚洲av| 亚洲一区高清亚洲精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 色视频www国产| 午夜免费成人在线视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲国产精品sss在线观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 深爱激情五月婷婷| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 嫩草影院新地址| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 欧美性猛交黑人性爽| 人人妻人人看人人澡| or卡值多少钱| 伊人久久精品亚洲午夜| 毛片一级片免费看久久久久 | 午夜福利高清视频| 亚洲欧美激情综合另类| 亚洲自拍偷在线| 男人狂女人下面高潮的视频| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲综合色惰| 精品久久久久久久久久免费视频| 免费高清视频大片| 看片在线看免费视频| 久久久精品欧美日韩精品| 中文资源天堂在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品不卡国产一区二区三区| 亚洲成av人片免费观看| 精品人妻偷拍中文字幕| 麻豆av噜噜一区二区三区| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美午夜高清在线| 亚洲三级黄色毛片| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久久久久久成人| 毛片一级片免费看久久久久 | av天堂中文字幕网| 亚洲av熟女| 日本三级黄在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 动漫黄色视频在线观看| 免费大片18禁| 欧美另类亚洲清纯唯美| av在线观看视频网站免费| 国产亚洲精品久久久com| 黄色一级大片看看| 91在线精品国自产拍蜜月| 欧美激情久久久久久爽电影| 日韩欧美精品免费久久 | 免费人成视频x8x8入口观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 久久性视频一级片| 一区二区三区高清视频在线| 日本黄色片子视频| 国产不卡一卡二| 级片在线观看| 有码 亚洲区| 91九色精品人成在线观看| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品98久久久久久宅男小说| 成年人黄色毛片网站| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲欧美激情综合另类| 男女下面进入的视频免费午夜| 黄色丝袜av网址大全| 少妇丰满av| 91麻豆av在线| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 精品国产亚洲在线| a级毛片a级免费在线| 日本黄色片子视频| av在线蜜桃| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲专区国产一区二区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲av二区三区四区| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 有码 亚洲区| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 一本精品99久久精品77| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲无线观看免费| 欧美黑人巨大hd| 在线天堂最新版资源| 简卡轻食公司| 搡老岳熟女国产| 日韩欧美国产在线观看| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 午夜福利在线观看吧| 免费在线观看影片大全网站| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲在线观看片| 露出奶头的视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品久久视频播放| 久久热精品热| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产高清视频在线观看网站| 亚洲一区二区三区不卡视频| 在线观看午夜福利视频| 成人国产一区最新在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 久久久久久久久久黄片| 国产亚洲精品av在线| 老鸭窝网址在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 成年女人毛片免费观看观看9| 91麻豆精品激情在线观看国产| 窝窝影院91人妻| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品国产亚洲在线| 99热这里只有是精品在线观看 | 亚洲人成网站高清观看| 极品教师在线免费播放| 欧美区成人在线视频| 国产成人av教育| 一a级毛片在线观看| 午夜精品一区二区三区免费看| or卡值多少钱| 免费av不卡在线播放| 可以在线观看的亚洲视频| www日本黄色视频网| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 日本成人三级电影网站| 可以在线观看的亚洲视频| 美女免费视频网站| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲成人免费电影在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美午夜高清在线| netflix在线观看网站| 精品久久久久久久末码| 好男人电影高清在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产一区二区在线av高清观看| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 观看免费一级毛片| 99国产综合亚洲精品| 国产亚洲精品久久久久久毛片| bbb黄色大片| 一区福利在线观看| 天堂av国产一区二区熟女人妻| а√天堂www在线а√下载| 不卡一级毛片| 如何舔出高潮| 久久人人爽人人爽人人片va | 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产高潮美女av| 人妻久久中文字幕网| АⅤ资源中文在线天堂| 成人国产综合亚洲| 久99久视频精品免费| 少妇丰满av| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 色播亚洲综合网| 在线观看av片永久免费下载| 精品久久久久久成人av| 有码 亚洲区| 成年版毛片免费区| 热99re8久久精品国产| 草草在线视频免费看| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 久久久国产成人精品二区| 亚洲自偷自拍三级| 亚洲最大成人中文| 成人性生交大片免费视频hd| 婷婷六月久久综合丁香| netflix在线观看网站| 一本久久中文字幕| 少妇人妻一区二区三区视频| 免费观看精品视频网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 日韩欧美国产在线观看| 欧美日韩乱码在线| 1000部很黄的大片| 免费黄网站久久成人精品 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 51国产日韩欧美| www.色视频.com| 久久久久免费精品人妻一区二区| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲三级黄色毛片| 夜夜爽天天搞| av中文乱码字幕在线| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲七黄色美女视频| 日本免费一区二区三区高清不卡| 在线播放国产精品三级| 超碰av人人做人人爽久久| av在线蜜桃| 内地一区二区视频在线| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日本成人三级电影网站| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲av二区三区四区| 亚洲欧美清纯卡通| 久久精品人妻少妇| 一级av片app| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产高清三级在线| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲国产精品合色在线| 午夜老司机福利剧场| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 久久99热6这里只有精品| 一a级毛片在线观看| 亚洲在线自拍视频| 嫩草影院精品99| 激情在线观看视频在线高清| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜福利高清视频| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲天堂国产精品一区在线| 少妇的逼好多水| 91狼人影院| 一区二区三区免费毛片| 日韩欧美 国产精品| 久久99热6这里只有精品| 精品国产三级普通话版| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲无线在线观看| 日本熟妇午夜| 亚洲欧美清纯卡通| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 免费看a级黄色片| 一级黄片播放器| 欧美bdsm另类|