頂空氣相色譜法同時(shí)測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量

趙國敏，劉彩霞，盧守舟，孫 清，任文杰，孫 玲*

（1.山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.山東省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，山東 濟(jì)南 250101）

索拉非尼（sorafenib）是一種新型多靶向性治療腫瘤的口服藥物，是全球公認(rèn)的肝癌一線靶向藥物，具有雙重抗腫瘤作用，一方面，可通過抑制RAF/MEK/ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路，直接抑制腫瘤生長；另一方面，又可通過抑制血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）和血小板源生長因子受體（PDGFR）而阻斷腫瘤新生血管的形成，間接抑制腫瘤細(xì)胞生長，臨床上主要用于治療腎癌和肝癌[1-10]。

索拉非尼在合成過程中易殘留甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮和甲苯，根據(jù)《中國藥典》2020年版四部限量檢查法中殘留溶劑測定法[11]及國際人用藥品注冊技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)ICH Q3C（R8）規(guī)定，應(yīng)對這些有機(jī)溶劑殘留進(jìn)行測定。目前，國內(nèi)外藥典尚未收載該品種，文獻(xiàn)報(bào)道的相關(guān)分析方法較少，有研究對甲苯磺酸索拉非尼中二氯甲烷等殘留溶劑進(jìn)行測定[12-15]，富馬酸沃羅拉贊中乙酸乙酯等殘留溶劑進(jìn)行測定[16]，由于生產(chǎn)工藝中使用有機(jī)溶劑種類不同，殘留溶劑測定方法不同，未見同時(shí)測定此8種殘留溶劑的報(bào)道。本文建立了頂空氣相色譜法準(zhǔn)確測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 7890B氣相色譜儀，7697A頂空進(jìn)樣器（美國安捷倫科技有限公司）；氮?dú)猓?jì)南德洋特種氣體有限公司，純度≥99.999 %）；XS-205型電子分析天平（十萬分之一天平，瑞士Mettler-Toledo公司）；氣相色譜柱（DB-624，30 m×530 μm×3 μm）。

1.2 試藥

索拉非尼（自制，批號(hào)：20210610，20210625，20210707，純度≥99.5 %），甲醇（批號(hào)：200803）、四氫呋喃（批號(hào)：201006）（均為色譜純，天津康科德，含量均≥99.9 %），丙酮（批號(hào)：20191209）、甲苯（批號(hào)：20180209）、乙酸甲酯（批號(hào)：20200801）（均為分析純，國藥集團(tuán)，含量均≥99.9 %），叔丁醇（分析純，上海麥克林生化，含量≥99.0 %），乙酸乙酯（批號(hào)：200401，分析純，西隴化工，含量≥99.5 %），甲基異丁基酮（批號(hào)：191105，分析純，天津廣成，含量≥99.5 %），N-甲基吡咯烷酮（批號(hào)：20201105，分析純，天津科密歐，含量≥99.5 %）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：DB-624毛細(xì)管柱（30 m×530 μm×3 μm）；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min速率升溫至100 ℃，再以20 ℃/min速率升溫至200 ℃，保持5 min；進(jìn)樣口溫度為230 ℃；采用氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為250 ℃；載氣為氮?dú)猓魉贋?.0 ml/min；頂空平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為20 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 空白溶劑 精密量取N-甲基吡咯烷酮2 ml，置入10 ml頂空瓶，密封。

2.2.2 供試品溶液 取索拉非尼約0.1 g，精密稱定，置入10 ml頂空瓶，精密加入2 ml N-甲基吡咯烷酮，緩緩振搖使其溶解，密封。

2.2.3 對照品溶液 分別精密稱取甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯各適量置入于含有N-甲基吡咯烷酮的量瓶，并用N-甲基吡咯烷酮稀釋至刻度，制成每1 ml中含甲醇0.15 mg、丙酮0.25 mg、乙酸甲酯0.25 mg、叔丁醇0.25 mg、乙酸乙酯0.25 mg、四氫呋喃0.036 mg、甲基異丁基酮0.25 mg、甲苯0.044 mg的混合溶液，搖勻，精密量取此混合對照品溶液2 ml，置入10 ml頂空瓶，密封。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密量取空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液2 ml，置入10 ml頂空瓶，密封，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果表明，空白溶劑不影響樣品測定，對照品溶液中各主成分峰的出峰順序依次為甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯，且各峰之間分離度均大于1.5，表明專屬性良好。

圖1 氣相色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取甲醇61.15 mg、丙酮103.10 mg、乙酸甲酯103.47 mg、叔丁醇103.65 mg、乙酸乙酯104.21 mg、四氫呋喃15.08 mg、甲基異丁基酮104.69 mg和甲苯18.29 mg置入50 ml量瓶，加N-甲基吡咯烷酮溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液；分別精密量取1.0，2.0，3.0，5.0，7.0 ml，置入25 ml量瓶，加N-甲基吡咯烷酮溶解并定容至刻度，搖勻，作為線性1#～5#號(hào)溶液。分別精密量取2.0 ml，置入10 ml頂空瓶，密封。照上述色譜條件進(jìn)行測定，以峰面積（Y）對濃度（X，μg/ml）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。在表1所示線性范圍內(nèi)，各溶劑峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系。

表1 各組分線性方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.5 定量限和檢出限

取對照品溶液，加N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行稀釋，當(dāng)甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯的濃度分別為1.42，0.40，0.56，1.35，0.60，0.33，0.90，0.63 μg/ml時(shí)，其信噪比約為10，即為其定量限；當(dāng)甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯的濃度分別為0.43，0.12，0.17，0.41，0.18，0.10，0.27，0.19 μg/ml時(shí)，其信噪比約為3，即為其檢測限。

2.6 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)

精密量取6份線性1#溶液各2.0 ml，分別置入10 ml頂空瓶，密封，按上述色譜條件進(jìn)行測定，記錄色譜圖，分別計(jì)算甲醇、丙酮、乙酸甲酯、叔丁醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、甲基異丁基酮、甲苯峰面積的RSD分別為2.34 %，1.32 %，1.13 %，2.99 %，1.63 %，2.32 %，2.89 %，2.91 %（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

精密量取線性試驗(yàn)項(xiàng)下貯備液2.4，3.0，3.6 ml（各3份），分別置入25 ml量瓶，加入N-甲基吡咯烷酮定容至刻度，搖勻，作為準(zhǔn)確度試驗(yàn)配樣溶液。精密稱取約0.1 g索拉非尼（9份，批號(hào)為20210610），每份加入上述配樣溶液各2 ml，振搖溶解后，作為準(zhǔn)確度試驗(yàn)供試品溶液。按上述殘留溶劑測定方法進(jìn)行測定，扣除已知溶劑殘留量，以測得加入量與加入量計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.8 耐用性試驗(yàn)

取對照品溶液2 ml，分別置入10 ml頂空瓶，密封，在2.1項(xiàng)下色譜條件基礎(chǔ)上，分別調(diào)整程序升溫中初始溫度、載氣流速、檢測器溫度、進(jìn)樣口溫度、程序升溫速率等條件，考察各峰之間分離度，均能完全分離，結(jié)果表明該法耐用性良好。

2.9 樣品測定

分別取2.2項(xiàng)下供試品溶液和對照品溶液各2 ml，分別置入10 ml頂空瓶，密封，進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各有機(jī)溶劑殘留量，測定結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 殘留溶劑的選擇

本品在合成和精制過程中，涉及到ICH規(guī)定限制使用和藥品GMP或其他質(zhì)量要求限制使用的第二類溶劑四氫呋喃（限度0.072 %）、甲苯（限度0.089 %）、N,N-二甲基乙酰胺（限度0.109 %）、甲醇（限度0.3 %），第三類溶劑丙酮（限度0.5 %）、甲基異丁基酮（限度0.5 %）、乙酸乙酯（限度0.5 %）。同時(shí)，在合成過程中使用叔丁醇鉀，可能生成叔丁醇；合成過程中同時(shí)使用乙酰氯和甲醇，可能生成乙酸甲酯，故對叔丁醇（限度0.5 %）和乙酸甲酯（限度0.5 %）進(jìn)行檢測。

3.2 色譜柱的選擇

分別選用DB-INNOWAX、HP-5、DB-624及DB-17毛細(xì)管柱進(jìn)行測定，通過對比結(jié)果，采用DB-624作為測定色譜柱，同時(shí)對程序升溫進(jìn)行優(yōu)化，最終采用初始溫度40 ℃，保持5 min，然后以10 ℃/min速率升溫至100 ℃，再以每 20 ℃/min速率升溫至200 ℃，保持5 min，在此條件下，各組分峰形較好，分離度符合要求。

3.3 瓶平衡溫度及平衡時(shí)間的選擇

本試驗(yàn)考察了頂空瓶在不同平衡溫度（70，80，90，100 ℃）和不同平衡時(shí)間（10，20，30，45 min）條件下各主成分峰峰面積，結(jié)果表明，平衡溫度為80 ℃，平衡時(shí)間為20 min時(shí)，各峰峰面積達(dá)到最大值。溫度繼續(xù)升高、平衡時(shí)間繼續(xù)延長，各主成分峰峰面積不再增加，最終選擇平衡溫度為110 ℃，平衡時(shí)間為20 min，在此條件下，即達(dá)到測定效果，又能節(jié)約成本。

本實(shí)驗(yàn)首次采用頂空毛細(xì)管氣相色譜法測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量，經(jīng)過方法學(xué)驗(yàn)證和樣品的測定，結(jié)果表明，所建立的方法靈敏度高、操作簡便、準(zhǔn)確可靠，能準(zhǔn)確測定索拉非尼中8種殘留溶劑的含量，為提升索拉非尼的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和全面評價(jià)其內(nèi)在產(chǎn)品質(zhì)量提供了依據(jù)。