N-甲基吡咯烷酮降解菌株的篩選鑒定及應(yīng)用

司更花，楊傳倫，孫建忠，馮文娟，楊 麗，韓立霞

黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500

N-甲基吡咯烷酮（N-methyl pyrrolidinone，簡(jiǎn)稱NMP），由于其具有低揮發(fā)性、高極性、無腐蝕性及良好的水溶性等特點(diǎn)[1-3]，經(jīng)常作為一種典型的選擇性強(qiáng)和穩(wěn)定性好的有機(jī)物極性溶劑，是一種重要的化工原料[2-5]。N-甲基吡咯烷酮被廣泛應(yīng)用于鋰電池、染料、醫(yī)藥、洗滌劑和黏合劑等多種制造行業(yè)中[6-7]。因其良好的水混溶性特點(diǎn)，極易隨著廢水排放到環(huán)境中。但N-甲基吡咯烷酮本身結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、較差的可生化性及較強(qiáng)的生物毒性等特點(diǎn)[8]，使未達(dá)排放指標(biāo)的N-甲基吡咯烷酮被釋放到環(huán)境中，會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和水域環(huán)境造成不可彌補(bǔ)的傷害。因此如何快速、高效地消除N-甲基吡咯烷酮造成的環(huán)境污染，成為亟待解決的環(huán)境問題。

目前，含N-甲基吡咯烷酮廢水的處理方法主要為物理化學(xué)法，該方法不但成本較高，且極易造成環(huán)境二次污染；除此之外生物處理技術(shù)具有高效、經(jīng)濟(jì)且無二次污染等特點(diǎn)，能實(shí)現(xiàn)無毒無害的環(huán)境治理，是目前應(yīng)用較為廣泛的環(huán)境處理技術(shù)[9]。因此，在環(huán)境中篩選能夠消除N-甲基吡咯烷酮的有效菌株，是解決N-甲基吡咯烷酮環(huán)境污染問題最直接有效的方法。然而，目前對(duì)N-甲基吡咯烷酮的高效降解菌株鮮有研究，本文在某廢水處理的活性污泥中，通過馴化后，篩選出可降解N-甲基吡咯烷酮的有效菌株，經(jīng)鑒定地衣芽孢桿菌可對(duì)N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行高效降解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌源

活性污泥來自于山東某新材料股份有限公司廠區(qū)廢水生化處理裝置中的好氧曝氣池。

1.1.2 儀器和試劑

儀器：HZQ-X100 型振蕩培養(yǎng)箱，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；MQD-B3R 組合式全溫震蕩培養(yǎng)箱，上海旻泉儀器有限公司；PHS-3C 型精密pH 計(jì)，上海雷磁儀器廠；YXQ-50SI Ⅰ型高野滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SW-CJ-1D 型超凈工作臺(tái)，蘇州蘇凈凈化科技有限公司；PCR 儀，立康生物科技有限公司；Waters Arc 型高效液相色譜儀，上海沃特世科技有限公司。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L，pH 7.2；LB 固體培養(yǎng)基在上述LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%的瓊脂，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，20min）后制得。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：K2HPO40.6 g/L，KH2PO40.5 g/L，NaCl 0.1 g/L，MgSO40.06 g/L，CaCl20.08 g/L，F(xiàn)eSO40.008 g/L，MnSO40.008 g/L，pH 7.2，經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121 ℃，20 min）后制得。

上述二者，若需要加入N-甲基吡咯烷酮，可根據(jù)具體需求進(jìn)行添加，本文中其含量在200 mg/L～1 000 mg/L?；瘜W(xué)藥品均為分析純。

1.1.3 N-甲基吡咯烷酮的測(cè)定方法

采用Waters Arc 型高效液相色譜儀對(duì)N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行定性、定量測(cè)定[10-11]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 降解菌株的馴化與分離

從山東某新材料公司的好氧曝氣池中采集活性污泥，建立實(shí)驗(yàn)室好氧體系，添加N-甲基吡咯烷酮進(jìn)行污泥馴化，每24 h 添加1 次N-甲基吡咯烷酮，馴化30 d。

稱取馴化污泥1 g，加入經(jīng)過121 ℃高溫滅菌20 min 的100 mL0.9%氯化鈉溶液中，進(jìn)行搖床180 r/min 混勻30 min 后靜止2 h，吸取上清液用無菌水梯度稀釋103～1 010 倍，在加入N-甲基吡咯烷酮的LB 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行涂布，置于生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行35 ℃培養(yǎng)24 h。

挑選培養(yǎng)皿上具有明顯差異的單菌落，采用平板劃線分離的方法進(jìn)行純化培養(yǎng)，連續(xù)純化3～5次，經(jīng)過反復(fù)劃線分離純化得到的純菌株，經(jīng)試管斜面富集培養(yǎng)后，保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 降解菌株的篩選

將分離的菌株接種至新鮮的LB 培養(yǎng)基中，富集培養(yǎng)24 h，取1 mL 菌液用0.9%氯化鈉溶液重懸菌體3～5 次，接入100 mL 含200 mg/L N-甲基吡咯烷酮的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以不接菌株的無機(jī)鹽培養(yǎng)基作對(duì)照，所有處理及對(duì)照組均設(shè)3 次重復(fù)，降解24 h 后進(jìn)行測(cè)定N-甲基吡咯烷酮的含量，將具有良好降解能力的菌株進(jìn)行保存，選取降解能力穩(wěn)定、降解效率最高的菌株進(jìn)行后續(xù)研究及應(yīng)用。

1.2.3 降解菌的鑒定

降解菌株經(jīng)LB 培養(yǎng)基平板劃線培養(yǎng)24 h 后，觀察其菌落形態(tài)。

降解菌基因組DNA 采用試劑盒提取菌株的總DNA，用16S rDNA 通用引物（27F：AGAGTTTGATC CTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增[12-15]。PCR 反應(yīng)體系：5.0 uL 10X Taq緩沖液、1.0 uL 引物、1.0 uL 模板DNA、1.0 uL dNTP、1.0 uL DNA 聚合酶，用40 uL 的無菌水補(bǔ)足至50 uL 體系。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃引物延伸90 s、循環(huán)32次，72 ℃延伸10 min。最后將PCR 純化產(chǎn)物委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序產(chǎn)物經(jīng)由NCBI 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.4 降解菌的驗(yàn)證及應(yīng)用

采用無機(jī)鹽培養(yǎng)基，添加N-甲基吡咯烷酮作為唯一C 源和能源，N-甲基吡咯烷酮的質(zhì)量濃度為200～1 000 mg/L，菌劑添加量為1%，每2 h 取樣進(jìn)行N-甲基吡咯烷酮含量測(cè)定。

將篩選的高效降解菌添加至某芳綸紙生產(chǎn)廢水生化裝置，其受到N-甲基吡咯烷酮的沖擊，菌株發(fā)酵后的菌液添加量為0.1%。溫度為35 ℃，溶解氧為4 mg/L，pH 為7.2～7.8，水力停留時(shí)間為12 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的篩選

降解菌株經(jīng)過初篩純化后，得到6 株菌。采用無機(jī)鹽培養(yǎng)基，以N-甲基吡咯烷酮為唯一C 源和能源，在200 mg/L 的質(zhì)量濃度下，8 h 后不同菌株對(duì)N-甲基吡咯烷酮去除率見表1。其中N-3 對(duì)N-甲基吡咯烷酮的降解效果最好，對(duì)200 mg/L N-甲基吡咯烷酮的降解率為100%。

表1 不同菌株對(duì)N-甲基吡咯烷酮的降解效果

2.2 降解菌株的鑒定

降解菌株N-3 在LB 培養(yǎng)基上表現(xiàn)為菌落較小、呈松散狀態(tài)、表面光滑、有光澤（圖1）。

圖1 降解菌N-3 在LB 固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

對(duì)N-3 降解菌進(jìn)行16S rDNA 基因測(cè)序，將所獲得序列與GenBank 中已知序列進(jìn)行對(duì)比，其16S rDNA 的核苷酸序列與芽孢桿菌屬（Bacillus）不同菌株的核苷酸序列有大于99%的同源性，與其中明確標(biāo)記為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）的菌株有100%的同源性。結(jié)合該菌株的主要形態(tài)特征，確定其為地衣芽孢桿菌。

2.3 降解菌對(duì)N-甲基吡咯烷酮的降解性能

將降解菌N-3 經(jīng)過LB 液體培養(yǎng)及培養(yǎng)24 h后，接種至含200 mg/L N-甲基吡咯烷酮的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每2 h 進(jìn)行取樣測(cè)定，12 h 內(nèi)可得200 mg/L 的N-甲基吡咯烷酮完全降解，空白樣品中的N-甲基吡咯烷酮含量基本未發(fā)生變化（圖2）。

圖2 N-3 在12 h 內(nèi)對(duì)200 mg/LN-甲基吡咯烷酮的降解效果

將降解菌N-3 經(jīng)過LB 液體培養(yǎng)24 h 后，接種至含1 000 mg/L N-甲基吡咯烷酮的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，每2 h 進(jìn)行取樣測(cè)定，20 h 內(nèi)可對(duì)1 000 mg/L的N-甲基吡咯烷酮降解率達(dá)99.99%，而空白樣品中的N-甲基吡咯烷酮含量基本未發(fā)生變化（圖3）。

圖3 N-3 對(duì)1 000 mg/LN-甲基吡咯烷酮的降解效果

2.4 降解菌N-3 在工業(yè)廢水處理中的應(yīng)用

某芳綸紙生產(chǎn)廢水處理裝置受到N-甲基吡咯烷酮的沖擊，出水氨氮達(dá)到205.63 mg/L，COD 為1 053.69 mg/L，出水指標(biāo)不合格，經(jīng)測(cè)定，處理廢水中含有N-甲基吡咯烷酮256.92 mg/L。將N-3 菌株發(fā)酵后添加至此廢水裝置的好氧池中，菌劑添加量為0.1%，好氧池池溫為35 ℃，溶解氧為4 mg/L，pH 為7.0～7.8，水力停留時(shí)間為12 h，菌劑添加3 h，出水氨氮降至50.27 mg/L，COD 為598.23 mg/L，經(jīng)測(cè)定，菌劑添加5 h 后，出水氨氮為0 mg/L，COD 為105.23 mg/L，出水指標(biāo)合格，出水中N-甲基吡咯烷酮的含量為0 mg/L。

3 結(jié)論

本文從活性污泥中獲得一株可高效降解N-甲基吡咯烷酮的菌株，該菌株為好氧菌，可以N-甲基吡咯烷酮為唯一C 源和能源穩(wěn)定生長(zhǎng)，經(jīng)16S rDNA 測(cè)序比對(duì)鑒定出此菌株為地衣芽孢桿菌。

在12 h 內(nèi)，該菌株可對(duì)200 mg/L 的N-甲基吡咯烷酮完全降解；在20 h 內(nèi)，該菌株對(duì)1 000 ppm的N-甲基吡咯烷酮的降解率達(dá)99.99%。本試驗(yàn)所獲得的N-甲基吡咯烷酮高效降解菌株，彌補(bǔ)了N-甲基吡咯烷酮生物處理有效菌劑的空白，為工業(yè)廢水中N-甲基吡咯烷酮生物處理提供了可能，為進(jìn)一步研究N-甲基吡咯烷酮生物處理途徑奠定了基礎(chǔ)。