益生菌發(fā)酵甘草對甘草酸含量及其抑菌活性的影響

樊梅娜，王麗榮，張國珍，陳盼盼，孟 潔，寧尚鍇，李 梅

（1.山東碧藍(lán)生物科技有限公司，山東泰安 271000；2.寧陽縣畜牧獸醫(yī)事業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東泰安 271000；3.泰安市中醫(yī)醫(yī)院，山東泰安 271000）

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194 號公告中提出，自2020 年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)將不能再生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑的商品飼料，這標(biāo)志著中國飼料端已全面禁抗。尋找飼用抗生素替代品成為飼料行業(yè)面臨的重要課題之一。以益生菌為代表的微生態(tài)制劑備受關(guān)注，其中枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌是我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的可直接飼喂動(dòng)物且允許使用的常用益生菌，具有調(diào)節(jié)動(dòng)物胃腸道菌群、促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和提高動(dòng)物機(jī)體免疫力等益生功能。中藥甘草及其主要活性成分甘草酸能夠發(fā)揮抗炎、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能。近期研究表明，甘草酸具有潛在的抗SARS-CoV-2 作用，有望成為COVID-19 的潛在治療藥物，更加凸顯出甘草的重要應(yīng)用價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌（）NBL-B11027 及植物乳桿菌（）NBL-B3003 已被證實(shí)能夠抑制動(dòng)物腸道病原菌增殖（未發(fā)表）。本試驗(yàn)旨在研究枯草芽孢桿菌 NBL-B11027和植物乳桿菌NBL-B3003 與中藥甘草共發(fā)酵對甘草酸含量及其對飼用有害菌產(chǎn)氣莢膜梭菌（，CP）抑菌活性的影響，以期進(jìn)一步提高其抑菌活性并為益生菌與甘草在飼料行業(yè)協(xié)同應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 枯草芽孢桿菌NBL-B11027（分離自禽養(yǎng)殖場）和植物乳桿菌NBL-B3003（分離自健康人體的唾液）由山東碧藍(lán)生物科技有限公司研究院菌種室提供。

1.1.2 甘草 甘草購自泰安永春堂藥店，甘草酸標(biāo)準(zhǔn)品（HPLC ≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 MRS 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉提取物10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，檸檬酸三銨2.0 g/L，乙酸鈉5.0 g/L，MgSO0.1 g/L，MnSO0.05 g/L，KHPO2.0 g/L，吐溫80 1.0 g/L。

LB 培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，pH 7.0～7.2。

胰蛋白胨-亞硫酸鐵-環(huán)絲氨酸（TSC）培養(yǎng)基：胰蛋白胨15.0 g/L，大豆胨5.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，焦亞硫酸鈉1.0 g/L，檸檬酸鐵銨1.0 g/L，瓊脂15.0 g/L，pH 7.4～7.8。

液體硫乙醇酸鹽（FTG）培養(yǎng)基：胰酪胨15.0 g/L，-胱氨酸0.5 g/L，葡萄糖5.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 2.5 g/L，硫乙醇酸鈉0.5 g/L，刃天青0.001g/L，瓊脂0.75 g/L。

1.2 枯草芽孢桿菌NBL-B11027 和植物乳桿菌NBL-B3003種子液制備 分別配置MRS 液體培養(yǎng)基和LB 培養(yǎng)基，將枯草芽孢桿菌NBL-B11027 接入LB 培養(yǎng)基中37℃，180 r/mim，培養(yǎng)16 h，活菌數(shù)為1.0×10CFU/mL，植物乳桿菌NBL-B3003 接入MRS 培養(yǎng)基中37℃靜置培養(yǎng)16 h，活菌數(shù)為1.0×10CFU/mL。

1.3 益生菌發(fā)酵甘草 將甘草粉碎過80 目篩，以1.5%的中藥添加量添加到LB 和MRS 培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌25 min，以4% 的接種量分別接種枯草芽孢桿菌NBL-B11027 和植物乳桿菌NBL-B3003 種子液，NBL-B11027 于37℃，180 r/min 搖床發(fā)酵，NBL-B3003于37℃靜置發(fā)酵，以未添加中藥甘草的發(fā)酵組為對照，檢測甘草對益生菌發(fā)酵pH（德國賽多利斯酸度計(jì)PB-10）、活菌數(shù)及發(fā)酵液對產(chǎn)氣莢膜梭菌抑菌活性的影響；以未接菌的含甘草培養(yǎng)基為對照，檢測益生菌發(fā)酵甘草對甘草酸含量變化的影響。

甘草酸含量增率=（發(fā)酵液中的甘草酸含量-發(fā)酵0 h 甘草酸含量）/發(fā)酵0 h 甘草酸的含量×100%

1.4 活菌數(shù)測定 采用平板菌落計(jì)數(shù)法，發(fā)酵結(jié)束后，每瓶取1 mL 發(fā)酵液于含生理鹽水9 mL 試管中，充分震蕩均勻后取1 mL 于下一個(gè)試管中，以此倍比稀釋到合適的稀釋度，將每個(gè)稀釋度取1 mL 滴在滅菌平板上，設(shè)3 個(gè)重復(fù)，加入50℃ MRS 固體培養(yǎng)基或LB 固體培養(yǎng)基中，充分搖勻，37℃靜置培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.5 甘草酸含量測定

1.5.1 發(fā)酵液中甘草酸的提取 取發(fā)酵上清液用3 mol/L HCl 調(diào)至pH 2.0 后，用丁醇（色譜純）+乙酸乙酯（色譜純）（3+7）萃取，除去水溶性雜質(zhì)，再用1%氨水反萃取甘草酸，提取液用醋酸調(diào)至pH 中性后，加無水乙醇（色譜純）使溶液為20%的乙醇溶液，再經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，供測定。

1.5.2 甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 用20%乙醇將甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液溶解至1.0 mg/mL。

1.5.3 色譜分離條件 色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：水:乙腈:冰醋酸=63:37:0.15；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 準(zhǔn)確吸取甘草酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL 置于10 mL 容量瓶中，用20%的乙醇定容至刻度，混勻后分別取10 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液注入高效液相色譜儀（日本島津LC-20A），在色譜條件下進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.5 發(fā)酵液中甘草酸含量測定 準(zhǔn)確吸取發(fā)酵提取液10 μL 注入高效液相色譜儀分離測定，以對照品峰的保留時(shí)間定性，以峰面積外標(biāo)法定量。

1.6 產(chǎn)氣莢膜梭菌抑菌性測定

1.6.1 病原菌的活化、培養(yǎng)和計(jì)數(shù) 將產(chǎn)氣莢膜梭菌C8-0044 接入FTG 培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)過夜。吸取菌液1 mL 于9 mL 生理鹽水中，重復(fù)混勻后，再吸取1 mL 至另一只含9 mL 生理鹽水的試管中，依次10倍倍比稀釋至合適的稀釋度，取稀釋液1 mL 于平皿中，倒入（46±1）℃的TSC 培養(yǎng)基，待凝固后，倒置平皿于37℃厭氧培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，計(jì)算平板內(nèi)的細(xì)菌數(shù)。

1.6.2 抑菌試驗(yàn) 過夜培養(yǎng)的病原菌稀釋至濃度為1.0×10CFU/mL，取1 mL 稀釋液與20 mL 相應(yīng)的培養(yǎng)基混合后倒板，待凝固后用打孔器（直徑7 mm）打孔，在孔內(nèi)加入發(fā)酵液上清各80 μL，過夜培養(yǎng)，測定抑菌圈大小。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)對兩組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，以＜0.05 為差異顯著性，＜0.01 為差異極顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同益生菌發(fā)酵甘草對益生菌發(fā)酵液pH 及活菌數(shù)的影響 由表1 可知，相同發(fā)酵時(shí)間，添加甘草組益生菌發(fā)酵的活菌數(shù)高于對照組（＜0.01）?？莶菅挎邨U菌NBL-B11027 發(fā)酵過程中pH 呈先升高后穩(wěn)定的趨勢，枯草芽孢桿菌NBL-B11027 發(fā)酵甘草組28 h 活菌數(shù)較不添加甘草組增加了2.91 倍，發(fā)酵32 h 達(dá)到最大活菌數(shù)3.02×10CFU/mL，此時(shí)仍然沒有形成芽孢，而未添加甘草組發(fā)酵24 h 后芽孢桿菌成孢率已達(dá)100%；植物乳桿菌NBL-B3003 發(fā)酵過程中pH 呈先降低后穩(wěn)定的趨勢，發(fā)酵甘草24 h 達(dá)到最大活菌數(shù)1.98×10CFU/mL，較不添加甘草組活菌數(shù)增加了1.57 倍。由于較低pH 對植物乳桿菌NBL-B3003 生長亦有抑制作用，導(dǎo)致發(fā)酵28 h 活菌數(shù)呈下降趨勢。

表1 不同益生菌發(fā)酵甘草對益生菌發(fā)酵液pH 及活菌數(shù)的影響

2.2 不同益生菌發(fā)酵甘草對益生菌體外抑制病原菌效果的影響 如表2 和圖1 所示，發(fā)酵0 h 各處理對產(chǎn)氣莢膜梭菌均無抑菌性，抑菌圈直徑為0 mm；枯草芽孢桿菌NBL-B11027 在發(fā)酵28 h 達(dá)到最大抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)17.5 mm，抑菌圈直徑較對照組增加了4.5 mm；植物乳桿菌NBL-B3003 在發(fā)酵24 h 達(dá)到最大抑菌活性，抑菌圈直徑達(dá)15.5 mm，較對照組增加了3.0 mm。由于枯草芽孢桿菌NBL-B11027 在未添加甘草組發(fā)酵24 h 后芽孢桿菌成孢率已達(dá)100%，且在添加甘草組發(fā)酵28 h后達(dá)到最大抑菌活性，所以選擇發(fā)酵24 h 和28 h 測定甘草酸含量；而植物乳桿菌NBL-B3003 發(fā)酵20 h 進(jìn)入穩(wěn)定期，添加甘草發(fā)酵24 h 達(dá)到最大抑菌活性，所以選擇穩(wěn)定期之前的發(fā)酵16 h 和24 h 測定甘草酸含量。

圖1 不同益生菌發(fā)酵甘草對益生菌體外抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌效果的影響

表2 不同益生菌發(fā)酵甘草對益生菌體外抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌效果的影響 mm

2.3 不同益生菌發(fā)酵甘草對甘草酸含量的影響 以甘草酸對照品的進(jìn)樣濃度（C）對其峰面積（S）進(jìn)行線性回歸，回歸方程=2E+7-214723，=0.999，甘草酸在0.05～0.8 mg 呈良好的線性關(guān)系（圖2）。如表3 所示，枯草芽孢桿菌NBL-B11027 發(fā)酵甘草的發(fā)酵過程中甘草酸含量顯著增加，發(fā)酵28 h 的發(fā)酵液中甘草酸含量較發(fā)酵0 h 時(shí)增加154.31%，高于未添加益生菌組（＜0.01）；相反，植物乳桿菌NBL-B3003 發(fā)酵甘草的發(fā)酵過程中甘草酸含量顯著降低，發(fā)酵24 h 檢測甘草酸含量較發(fā)酵0 h 降低90.44%，低于未添加益生菌組（＜0.01）。

表3 不同益生菌發(fā)酵甘草對甘草酸含量的影響

圖2 甘草酸含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 討 論

隨著益生菌研究的不斷深入和現(xiàn)代中草藥研究的發(fā)展，益生菌發(fā)酵中草藥被廣泛應(yīng)用于飼料行業(yè)中。一方面，益生菌能夠提高中草藥的營養(yǎng)價(jià)值和活性成分含量，改善中草藥的適口性；另一方面，中草藥所含有的有機(jī)酸等成分能夠抑制有害菌繁殖，促進(jìn)益生菌生長。本研究結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌NBL-B11027 發(fā)酵甘草，不僅增加了益生菌活菌數(shù)，且發(fā)酵后甘草酸含量也增加154.31%，呈現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。王星懿等研究也表明，芽孢桿菌JM-11 發(fā)酵甘草，經(jīng)條件優(yōu)化發(fā)酵后甘草酸得率增加了33.20%。在共發(fā)酵過程中，枯草芽孢桿菌NBL-B11027 能夠產(chǎn)生胞外酶等大量次生代謝產(chǎn)物，降解甘草細(xì)胞壁，從而增加了甘草酸的溶出；而甘草所富含的營養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了枯草芽孢桿菌NBL-B11027的增殖。益生菌與中草藥的協(xié)同作用可為新型微生態(tài)制劑的研發(fā)提供方向。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是造成動(dòng)物壞死性腸炎的主要病原菌，飼料行業(yè)全面禁抗之前主要通過在飼糧中添加桿菌肽鋅等抗生素進(jìn)行抑制。本研究結(jié)果表明，發(fā)酵中藥甘草能夠進(jìn)一步增加枯草芽孢桿菌NBL-B11027 及植物乳桿菌NBL-B3003 對產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外抑制活性?？莶菅挎邨U菌分泌的細(xì)菌素、乳桿菌產(chǎn)生的乳酸等酸性物質(zhì)均具有較強(qiáng)的抗菌作用，還能夠通過生物屏障作用拮抗病原菌的吸附和定植；此外，添加甘草發(fā)酵可促進(jìn)益生菌的增殖速度變快，也更有利于發(fā)揮抗菌作用。與飼用抗生素相比，益生菌及中藥甘草具有天然、毒副作用小、不易在畜禽體內(nèi)殘留、長期使用不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，能有效解決我國飼料行業(yè)長期使用抗生素帶來的耐藥性、藥物殘留等問題。

甘草酸作為中藥甘草的主要活性成分，具有典型的腎上腺皮質(zhì)激素樣作用。研究表明，甘草酸能夠刺激體內(nèi)T 細(xì)胞產(chǎn)生-干擾素實(shí)現(xiàn)抗流感病毒活性，通過減少杯狀細(xì)胞增生和黏蛋白5AC mRNA 表達(dá)來發(fā)揮抗炎作用。本研究結(jié)果表明，利用枯草芽孢桿菌NBL-B11027 發(fā)酵甘草，能夠顯著增加甘草到甘草酸的生物轉(zhuǎn)化；但利用植物乳桿菌NBL-B3003 發(fā)酵甘草，發(fā)酵24 h 甘草酸含量卻較未發(fā)酵時(shí)下降90.44%。研究表明，甘草酸可在人腸內(nèi)細(xì)菌作用下轉(zhuǎn)化為甘草次酸進(jìn)入體循環(huán)；鼠李糖乳桿菌通過將大分子甘草酸去糖基化轉(zhuǎn)化為甘草次酸，從而提高肝硬化病人口服甘草酸的生物利用度。本研究中植物乳桿菌NBL-B3003 發(fā)酵甘草后甘草酸含量下降，推測亦可能是由于植物乳桿菌NBL-B3003 促進(jìn)了甘草酸的生物轉(zhuǎn)化引起的，需要結(jié)合HPLC 等試驗(yàn)進(jìn)一步加以明確。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，飼用益生菌枯草芽孢桿菌NBL-B11027 和植物乳桿菌NBL-B3003 發(fā)酵甘草，能夠增加其體外對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌活性；不同益生菌發(fā)酵中藥甘草能夠顯著影響發(fā)酵后甘草酸含量，NBL-B3003 發(fā)酵后甘草酸含量顯著降低，NBL-B11027 發(fā)酵甘草則顯著增加了甘草酸含量，表明利用枯草芽孢桿菌NBL-B11027和中藥甘草共發(fā)酵生產(chǎn)甘草酸具有可行性，對于甘草酸的深入研究和工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。