單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在畜禽遺傳育種中的應(yīng)用研究新進(jìn)展

彭 巍，賈可欣，張子敬，劉 賢，蔡翠翠，李欣淼，雷初朝，陳 宏，黃永震*

（1.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海大學(xué)，青海西寧 810016；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西楊凌 712100；3.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002；4.河南省畜牧總站，河南鄭州 450008）

1665 年Hooke 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞，打開了從細(xì)胞水平認(rèn)識(shí)生物個(gè)體的大門；1975 年Sanger 發(fā)明了第1 代基因測(cè)序技術(shù)，使人們能夠從分子水平上探索細(xì)胞的遺傳物質(zhì)；21 世紀(jì)以來，人類基因組計(jì)劃完成，人類對(duì)遺傳物質(zhì)的研究更進(jìn)一步，測(cè)序技術(shù)也得到很大提高，但這些測(cè)序技術(shù)以及對(duì)細(xì)胞遺傳物質(zhì)的研究總是基于大量的細(xì)胞，所測(cè)得的數(shù)據(jù)為細(xì)胞群體的平均水平，無法獲得精確的單個(gè)細(xì)胞的遺傳信息，體現(xiàn)不出細(xì)胞間的異質(zhì)性。2009 年，Tang 等在Nature Methods 雜志上初次發(fā)表了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的文章，開啟了單細(xì)胞測(cè)序的大門。隨著單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞測(cè)序與動(dòng)物遺傳育種的聯(lián)系越來越緊密，為家畜家禽的早期選種及生長(zhǎng)性狀的選擇提供重要依據(jù)。本文對(duì)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)及其在畜禽遺傳育種中的應(yīng)用展開綜述，以期為后續(xù)家畜家禽遺傳育種的研究提供參考。

1 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)包括單細(xì)胞樣本的制備、單細(xì)胞分離技術(shù)、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)以及數(shù)據(jù)處理與分析。

1.1 單細(xì)胞樣本制備 單細(xì)胞樣本質(zhì)量的好壞直接關(guān)乎到測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確與否，在單細(xì)胞測(cè)序中通常采用新鮮組織樣本分離的細(xì)胞，以此避免離體組織缺血缺氧對(duì)細(xì)胞造成損害。首先對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行機(jī)械剪切，再根據(jù)樣本的差別加入不同的酶處理，過濾掉沒有被酶消化的大塊組織，對(duì)細(xì)胞重懸，防止細(xì)胞聚集，影響測(cè)序結(jié)果。

1.2 單細(xì)胞分離與提取 隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞分離提取方法已從原始的、低通量的連續(xù)稀釋法發(fā)展為今天的具有高通量的熒光活化細(xì)胞分選技術(shù)、微流體技術(shù)等。連續(xù)稀釋法是指在細(xì)胞懸液中不斷稀釋細(xì)胞群體，直至懸液中細(xì)胞個(gè)數(shù)僅為1 個(gè)或極少數(shù)時(shí)停止，該方法成本低廉，操作簡(jiǎn)便，但無法辨別細(xì)胞，且可能造成DNA 污染。顯微操作法是在顯微鏡下通過觀察細(xì)胞形態(tài)或細(xì)胞著色情況辨別細(xì)胞并分離，該方法的優(yōu)點(diǎn)同連續(xù)稀釋法，缺點(diǎn)為靠人眼辨識(shí)細(xì)胞易發(fā)生錯(cuò)誤，且通量低。激光捕獲顯微切割技術(shù)（Laser Capture Microdissection，LCM）是在顯微鏡下選擇要操作的細(xì)胞，利用激光捕獲并分離細(xì)胞，為低通量的技術(shù)，可對(duì)用石蠟包埋、福爾馬林固定的組織操作，缺點(diǎn)是激光容易損傷細(xì)胞及所含的遺傳物質(zhì)。熒光活化細(xì)胞分選（Fluorescent-Activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS）使 用熒光色素與細(xì)胞表面受體特異性結(jié)合，對(duì)細(xì)胞做標(biāo)記，基于標(biāo)記和激光對(duì)細(xì)胞選擇，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的高通量選擇，不足之處在于此方法需要從大量的懸浮細(xì)胞中檢測(cè)，對(duì)數(shù)量較少的細(xì)胞可能會(huì)造成損害以致結(jié)果不準(zhǔn)確。磁活化細(xì)胞分選（Magnetic-Activated Cell Sorting，MACS）與FACS 差異之處在于以帶有特異抗原的磁珠與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，相比于FACS 作用時(shí)間更短，但不如FACS 特異性強(qiáng)。微流控技術(shù)（Microfluidic Control）是在1 個(gè)微芯片上集樣本制備、細(xì)胞分離為一體，通過計(jì)算機(jī)控制細(xì)胞的分選，可以對(duì)細(xì)胞精確篩選，靈敏度高，通量高，由于使用芯片作為生物化學(xué)功能的集成，該技術(shù)成本較高。拉曼鑷子技術(shù)（Raman Tweezers）是將光鑷與拉曼顯微光譜結(jié)合起來，光鑷用于對(duì)單個(gè)細(xì)胞的固定，拉曼顯微光譜用于檢測(cè)細(xì)胞信息，這項(xiàng)技術(shù)對(duì)細(xì)胞無直接接觸，不會(huì)損傷細(xì)胞，而且提高了對(duì)細(xì)胞的辨識(shí)能力。

1.3 單細(xì)胞測(cè)序

1.3.1 單細(xì)胞基因組測(cè)序 單細(xì)胞分離成功后，因?yàn)閱蝹€(gè)細(xì)胞的基因組DNA 含量過少，所以需要對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，以便完成高通量的測(cè)序。目前已知對(duì)基因組擴(kuò)增方法有基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）的技術(shù)、多重置換擴(kuò)增（Multiple Displacement Amplification，MDA）技術(shù)、多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增（Multiple Annealing And Looping-based Amplification Cycles，MALBAC）和轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因組線性擴(kuò)增技術(shù)（Linear Amplification Via Transposon Insertion）。

具體地，隨機(jī)寡核苷酸引物PCR（Primer-extension Preamplification PCR，PEP-PCR）和退變寡核苷酸引 物PCR（Degenerate Oligonucleotide-primed PCR，DOP-PCR）都是將短片段引物隨機(jī)結(jié)合在基因組上，在酶的作用下擴(kuò)增。接頭介導(dǎo)的PCR（Ligationmediated PCR）是先用限制性核酸內(nèi)切酶剪切DNA片段，之后在DNA 片段末端添加擴(kuò)增引物，隨即擴(kuò)增DNA。使用PCR 技術(shù)對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增有許多不足之處，非特異性擴(kuò)增強(qiáng)，擴(kuò)增效率低，擴(kuò)增產(chǎn)物的基因組覆蓋率低，不足10%。MDA 的擴(kuò)增原理是鏈置換，使用DNA 聚合酶如phi29 和耐核酸外切酶的引物在DNA片段上隨機(jī)結(jié)合并擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物取代原先的互補(bǔ)鏈成為新的模板，擴(kuò)增產(chǎn)物為高相對(duì)分子質(zhì)量的DNA。MDA 技術(shù)在恒溫30℃下即可完成，具有較高通量，可獲得大量擴(kuò)增產(chǎn)物，phi29 聚合酶保真性好，全基因組覆蓋率高。MALBAC 將PCR 技術(shù)和MDA 技術(shù)聯(lián)合使用，前5 個(gè)循環(huán)使用Bst DNA 聚合酶完成MDA 部分，擴(kuò)增產(chǎn)物兩端加入互補(bǔ)序列形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，防止MDA的基因指數(shù)型增長(zhǎng)，此后PCR 擴(kuò)增，高溫變性使環(huán)狀鏈斷開變?yōu)榫€性結(jié)構(gòu)，大量擴(kuò)增。MALBAC 技術(shù)既克服了PCR 技術(shù)錯(cuò)配率高的缺點(diǎn)，也克服了MDA 技術(shù)指數(shù)擴(kuò)增基因組的不足之處，具有高通量，全基因組覆蓋率達(dá)90%。轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的線性擴(kuò)增技術(shù)通過Tn5轉(zhuǎn)座酶切開DNA，插入1 個(gè)T7 啟動(dòng)子，在體外條件下把DNA 轉(zhuǎn)錄為mRNA，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，降低了擴(kuò)增過程的錯(cuò)誤率，全基因組覆蓋度高達(dá)97%。

1.3.2 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序主要是將DNA 轉(zhuǎn)錄為mRNA 再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，可以分為基于全長(zhǎng)的測(cè)序和基于特殊分子標(biāo)記的測(cè)序。基于全長(zhǎng)的測(cè)序包括同聚物末端加尾法、Smart-seq、CEL-seq。同聚物末端加尾法和Smartseq都是利用多個(gè)單核苷酸聚合物捕獲RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 并擴(kuò)增。CEL-seq結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù)，在Oligo（dT）引物中添加T7 啟動(dòng)子，cDNA 合成后即可體外擴(kuò)增。這些方法有通量低或錯(cuò)誤率高的不足，而帶有獨(dú)特分子標(biāo)記的測(cè)序則可解決這些問題。基于特殊分子標(biāo)記的測(cè)序有STRT-seq 和Drop-seq，STRT-seq將分子標(biāo)記與微流控技術(shù)結(jié)合，可對(duì)mRNA 的表達(dá)定量檢測(cè)；Drop-seq是對(duì)每個(gè)cDNA 分子特殊標(biāo)記并建庫，可以進(jìn)行高通量的測(cè)序。

1.3.3 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組測(cè)序 蛋白質(zhì)組測(cè)序首次出現(xiàn)時(shí)間較晚，在2004 年由Nolan 和Dovichi 提出，Nolan 的方法是采用流式細(xì)胞儀技術(shù)分析細(xì)胞信號(hào)，構(gòu)建信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。Dovichi 的方法側(cè)重于化學(xué)細(xì)胞術(shù)，熒光標(biāo)記蛋白質(zhì)，毛細(xì)管電泳分離獲得整個(gè)細(xì)胞的蛋白質(zhì)指紋圖譜。隨著科技的發(fā)展，近幾年對(duì)蛋白質(zhì)組的測(cè)序方法也有了更新，如Proximity Ligation Assay for RNA（PLAYR）用不同探針和金屬元素的同位素分別標(biāo)記RNA 和蛋白質(zhì)，用質(zhì)譜流式細(xì)胞儀分析RNA 和蛋白質(zhì)。Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing（CITE）用被寡核苷酸片段標(biāo)記的抗體和磁珠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)和RNA，根據(jù)分子質(zhì)量大小不同分離，測(cè)序分析RNA 和蛋白質(zhì)。

1.3.4 單細(xì)胞表觀遺傳測(cè)序 表觀遺傳是指基因組DNA核苷酸序列不發(fā)生變化而基因、蛋白質(zhì)的表達(dá)發(fā)生變化，導(dǎo)致表型改變的可遺傳現(xiàn)象，包括DNA 甲基化，組蛋白乙?；⒓谆痊F(xiàn)象。單細(xì)胞表觀遺傳測(cè)序最早提出的方法是Hi-C 法，Hi-C 法是將染色質(zhì)區(qū)域捕獲（Chromosome Conformation Capture）與高通量測(cè)序技術(shù)（High-throughout sequencing）結(jié)合起來的技術(shù)，使用甲醛將DNA 與蛋白質(zhì)鍵合交聯(lián)從而穩(wěn)定DNA 構(gòu)象，之后經(jīng)過酶切、加入生物素、酶連、提取一系列步驟，構(gòu)建新文庫、高通量測(cè)序，通過測(cè)序結(jié)果觀察染色質(zhì)間的相互作用。此外，亞硫酸鹽測(cè)序法也是表觀遺傳測(cè)序中應(yīng)用較多的方法，主要是對(duì)DNA 甲基化檢測(cè)，亞硫酸鹽使未甲基化的胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏?，?jīng)過PCR擴(kuò)增技術(shù)轉(zhuǎn)為胸腺嘧啶，而已經(jīng)甲基化的胞嘧啶不受此干擾。此種方法與新一代高通量測(cè)序結(jié)合，可以對(duì)全基因組的DNA 甲基化剖析。ATAC-seq是表觀遺傳組測(cè)序的一大提高，僅需要少量細(xì)胞就可以獲知全基因組范圍內(nèi)的基因調(diào)控序列，實(shí)現(xiàn)開放性染色質(zhì)測(cè)序，繪制染色質(zhì)可及性圖譜，顯示染色質(zhì)中各位點(diǎn)的位置；這種方法利用單細(xì)胞微滴制備系統(tǒng)分離細(xì)胞核并使其處于各微滴中，使用活性很高的Tn5 轉(zhuǎn)座酶將細(xì)胞核中的核小體切割為很小的片段，測(cè)序分析。

1.3.5 多組學(xué)聯(lián)合分析 對(duì)單個(gè)細(xì)胞的測(cè)序可以了解到該細(xì)胞的異質(zhì)性及其在遺傳內(nèi)在機(jī)理中的差別，有些細(xì)胞數(shù)量少、不易捕獲、在測(cè)序過程中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞損失，因而若對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多組學(xué)測(cè)序分析，則可以全面充分地了解到細(xì)胞信息和行為。目前具有代表性的多組學(xué)測(cè)序方法包括如下幾種：DR-seq對(duì)DNA 和RNA測(cè)序，細(xì)胞裂解后同時(shí)擴(kuò)增基因組DNA 和RNA，分離測(cè)序，但此種方法存在一定的不足，分離DNA 和RNA 時(shí)存在有分離不全的問題，導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確。G&T-seq也是對(duì)基因組和轉(zhuǎn)錄組的平行測(cè)序，通過帶有短寡核苷酸鏈的磁珠分離RNA 和DNA，分別測(cè)序。scM&T-seq基于G&T-seq，對(duì)分離后的DNA 用亞硫酸鹽測(cè)序甲基化，可以平行測(cè)序甲基化和轉(zhuǎn)錄組。3 組學(xué)測(cè)序方法為對(duì)細(xì)胞裂解物的上清液轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)裂解沉淀物基因組測(cè)序和甲基化測(cè)序；此外，scTrioseq可以對(duì)基因組、甲基化組、轉(zhuǎn)錄組平行測(cè)序，通過離心分離出細(xì)胞核，對(duì)細(xì)胞質(zhì)選擇性裂解，分離細(xì)胞質(zhì)中的mRNA 與細(xì)胞核中的基因組DNA，可對(duì)基因組直接測(cè)序，也可以亞硫酸鹽測(cè)甲基化。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 單細(xì)胞測(cè)序后的原始數(shù)據(jù)首先應(yīng)轉(zhuǎn)化為FATSQ 格式，便于數(shù)據(jù)比對(duì)；其次要對(duì)數(shù)據(jù)有質(zhì)量控制，基于FASTQC 執(zhí)行數(shù)據(jù)質(zhì)量檢驗(yàn)，由QC值決定數(shù)據(jù)的好壞；第三對(duì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，此步為數(shù)據(jù)處理部分中最重要的步驟，標(biāo)準(zhǔn)化是為消除在前面的實(shí)驗(yàn)操作中由非生物因素導(dǎo)致的數(shù)據(jù)偏差，如在樣本制備過程中樣本的損失、擴(kuò)增偏差以及測(cè)序的不完整等。標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)分析應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行不同的設(shè)置，目前常用的有主成分分析法（Principal Components Analysis，PCA）和t-分布隨機(jī)鄰域嵌入法（t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding，t-SNE），二者都可將高維數(shù)據(jù)降維處理，捕獲細(xì)胞間的差別，不同之處在于PCA 無法將數(shù)據(jù)可視化，而t-SNE 則彌補(bǔ)了此不足。

2 單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)近來在臨床醫(yī)學(xué)、微生物、神經(jīng)科學(xué)、家畜育種等方面研究迅速，為研究的深入開展提供了理論和實(shí)踐依據(jù)，本部分對(duì)近年來單細(xì)胞測(cè)序在家畜家禽育種上的應(yīng)用展開介紹。

畜禽生產(chǎn)中，育種技術(shù)為核心技術(shù)，提高育種效率、縮短育種年限、對(duì)遺傳資源的改良等都是育種過程中的關(guān)鍵問題。隨著生物分子技術(shù)的發(fā)展，動(dòng)物遺傳育種與分子技術(shù)結(jié)合日漸緊密，全基因組育種、基因編輯育種、分子設(shè)計(jì)育種凸顯出來，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用更是為育種實(shí)踐提供了新的技術(shù)方法。

2.1 在牛上的應(yīng)用 有研究使用全基因組甲基化測(cè)序檢測(cè)牛體內(nèi)、體外囊胚細(xì)胞，以尋找體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)與體內(nèi)差異的原因，進(jìn)而改進(jìn)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)。該研究通過對(duì)體內(nèi)、體外囊胚的單細(xì)胞全基因組甲基化測(cè)序，篩選出差異甲基化基因，從而改進(jìn)體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)，使其在引進(jìn)優(yōu)良品種、縮短育種進(jìn)程、提高育種繁殖效率等方面發(fā)揮出巨大潛能。Soto 等用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫熒光分析對(duì)牛性腺發(fā)育過程中原始生殖細(xì)胞的分子特征做了研究，分析早期發(fā)育階段原始生殖細(xì)胞的基因表達(dá)，闡釋了牛原始生殖細(xì)胞的發(fā)育機(jī)制，并表明牛的生殖系和人類有相似性。

2.2 在豬上的應(yīng)用 在豬上，對(duì)豬早期胚胎進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，構(gòu)建豬早期胚胎轉(zhuǎn)錄組圖譜，發(fā)現(xiàn)眾多還未進(jìn)行功能研究的基因，可以擴(kuò)大豬品種遺傳資源，改良豬的重要性狀。如有研究利用單細(xì)胞RNA 測(cè)序技術(shù)對(duì)瘦肉型豬和肥胖型豬的肌肉分析，發(fā)現(xiàn)在瘦肉型豬中具有比肥胖型豬明顯多的肌系細(xì)胞，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)分析，瘦肉型豬中的鈣離子含量更少，研究顯示鈣離子含量少有助于維持肌系細(xì)胞的分化潛能，這2 個(gè)因素成為瘦肉型豬脂肪沉積少的重要原因，因此，根據(jù)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)能夠發(fā)現(xiàn)控制豬優(yōu)良性狀的基因本質(zhì)，可從DNA 上開展對(duì)豬的選育。

2.3 在羊上的應(yīng)用 在綿羊上，有研究對(duì)小尾寒羊的產(chǎn)多羔基因進(jìn)行卵巢相關(guān)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，篩選出相關(guān)的差異基因和差異蛋白，對(duì)這些基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，闡明多羔性狀的分子遺傳機(jī)制，為提高羊的繁殖效率、遺傳性狀改良及分子育種提供了理論基礎(chǔ)。在山羊上，Yin 等通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較羔羊和母山羊成熟卵母細(xì)胞的基因表達(dá)，鑒定出1 086個(gè)差異表達(dá)基因，闡明了幼山羊的成熟卵母細(xì)胞在體外發(fā)育過程中不如成熟母山羊的卵母細(xì)胞發(fā)育良好的原因，為提高幼畜體外胚胎移植的效率提供了理論依據(jù)，對(duì)提升山羊的繁殖性能、縮短世代間隔具有重要意義。

2.4 在家禽上的應(yīng)用 在肉雞上，可以應(yīng)用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)找尋影響肉雞肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和脂肪沉積的相關(guān)基因，以此作為分子標(biāo)記，對(duì)肉雞進(jìn)行輔助選育。有研究以京星黃雞不同發(fā)育階段（5 日齡和100 日齡）的胸肌組織中原代肌細(xì)胞和IMF 細(xì)胞為對(duì)象，應(yīng)用單細(xì)胞RNA 測(cè)序技術(shù)，分析二者中的細(xì)胞組成及異質(zhì)性，根據(jù)測(cè)序結(jié)果中基因表達(dá)的相似性分為成肌細(xì)胞群和脂肪細(xì)胞群，比較分析這兩個(gè)細(xì)胞群，發(fā)現(xiàn)與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育、肌內(nèi)脂肪代謝轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因，這些基因可作為分子標(biāo)記對(duì)成肌細(xì)胞、IMF 細(xì)胞進(jìn)行選擇，為肉雞肌肉生長(zhǎng)、脂肪沉積等性狀的選育提供幫助。

3 總結(jié)展望

單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)是近年來發(fā)展較快、與生命科學(xué)領(lǐng)域結(jié)合緊密的一項(xiàng)技術(shù)，在醫(yī)學(xué)方面為腫瘤、心臟疾病、肝臟疾病的研究與治療做出了巨大貢獻(xiàn)，如探究腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境、分析腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性為腫瘤疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)；在育種方面，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)與植物育種和動(dòng)物育種結(jié)合加快了分子育種進(jìn)程。單細(xì)胞測(cè)序具有高通量、高精確度等特點(diǎn)，可在細(xì)胞水平上鑒定分析細(xì)胞行為、內(nèi)在機(jī)制，可以檢測(cè)新細(xì)胞，通過多組學(xué)聯(lián)合分析可以獲知細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的相互作用機(jī)制，但單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)還有一定的不足，如較高的成本，無法做到大規(guī)模大批量推廣使用，且在單細(xì)胞樣本的分離制備上有一定的難度，對(duì)于樣本量較少、不易獲取的細(xì)胞，若在實(shí)驗(yàn)過程中造成一定損失，則會(huì)導(dǎo)致所得數(shù)據(jù)不精確，故單細(xì)胞測(cè)序的各分步驟還有待完善。目前所有的單細(xì)胞組測(cè)序技術(shù)沒有對(duì)microRNA、lncRNA 等非mRNA的檢測(cè)，有些重要的功能也未發(fā)覺，這也是未來單細(xì)胞測(cè)序發(fā)展的重點(diǎn)。