基于自噬相關(guān)基因構(gòu)建的預(yù)后模型對腦膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的影響

喬秋江，龐 琦

（山東大學(xué)附屬山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 濟(jì)南 250021）

腦膠質(zhì)瘤（glioma）是當(dāng)前中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，預(yù)后較差[1]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Ⅳ級）是其中惡性程度最高的一種，中位生存期不足15 個(gè)月[2]。異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變狀態(tài)、1p/19q 共缺失和O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（O-6-Methylguanine-DNA Methyltransferase，MGMT）啟動(dòng)子甲基化等被證明可以預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的藥物反應(yīng)及預(yù)后[3，4]。也有研究發(fā)現(xiàn)[5-7]，不同類型膠質(zhì)瘤中DNA 修復(fù)通路的激活、抗凋亡潛能或保護(hù)性自噬及膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）的差異同樣導(dǎo)致了預(yù)后的不同。由于惡性膠質(zhì)瘤的腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性，目前治療仍未見明顯進(jìn)展，探究影響膠質(zhì)瘤腫瘤預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物對臨床治療有重要意義。自噬是一種高度保守的細(xì)胞動(dòng)態(tài)自我消化過程，主要包括自噬體的形成以及自噬體與溶酶體的融合和降解[8]。自噬有助于維持細(xì)胞的能量代謝，也可消除受損細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。而過度自噬的發(fā)生，可引起細(xì)胞死亡，這種死亡方式稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[9]。自噬對于腫瘤微環(huán)境中抗腫瘤免疫中也有重要作用[10]，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生存的潛在能力使其成為癌癥治療的目標(biāo)。缺氧是影響膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境的重要因素，可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)不足和基因表達(dá)的改變，也影響著細(xì)胞內(nèi)自噬水平的改變[11]。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）是細(xì)胞缺氧反應(yīng)中的重要調(diào)控因子，能夠影響細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的免疫微環(huán)境。有研究表示[12]，缺氧可以激活HIF-1α 依賴的自噬，從而通過抵消細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞和NK 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存。而本研究旨在通過公共數(shù)據(jù)庫挖掘腦膠質(zhì)瘤缺氧與自噬相關(guān)基因的關(guān)系，并建立模型預(yù)測患者預(yù)后和免疫微環(huán)境，以期為腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療提供更可靠的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及數(shù)據(jù)處理 在Human Autophagy Database（HADb）（http://www.autophagy.lu/）下載232個(gè)自噬相關(guān)基因。通過The Cancer Genome Atlas（TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）和 Chinese Glioma Genome Atlas（CGGA）（http://www.cgga.org.cn/）數(shù)據(jù)庫分別收集610 例和658 例膠質(zhì)瘤患者臨床信息和基因表達(dá)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析過程中去除臨床信息不完整的樣本。

1.2 基因相關(guān)性分析 利用R4.1 軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，并挑選出|與HIF-1α 相關(guān)性值|＞0.3，P＜0.05 的基因。通過與已下載的232 個(gè)自噬相關(guān)基因（ARGs）對比，篩選出與缺氧相關(guān)的ARGs。

1.3 差異表達(dá)基因功能分析 使用org.Hs.eg.db，cluster Profiler，ggplot2 等R 包對已篩選出的ARGs進(jìn)行GO[生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）]和KEGG 功能富集分析，F(xiàn)DR＜0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。富集分析篩選出與缺氧相關(guān)的ARGs 潛在分子機(jī)制和信號通路。

1.4 預(yù)后分析 對以上篩選出的ARGs 使用單因素Cox 回歸分析，選出與預(yù)后相關(guān)的基因，篩選閾值為：風(fēng)險(xiǎn)比HR≠1，P＜0.05。對預(yù)后相關(guān)基因進(jìn)行多因素Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，獲得預(yù)后相關(guān)基因的回歸系數(shù)。使用基因的表達(dá)水平和回歸系數(shù)計(jì)算患者的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評分中位數(shù)將以上患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。使用K-M 生存曲線評估兩組之間生存預(yù)后的差異；繪制ROC 曲線，計(jì)算AUC值，引入CGGA 數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證集評估該風(fēng)險(xiǎn)評分模型效能。

1.5 構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型與腫瘤免疫微環(huán)境的關(guān)系分析 使用R 語言分別通過ESITMATE 算法和Cibersort 算法計(jì)算高、低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫浸潤分?jǐn)?shù)和22 種免疫細(xì)胞浸潤的差別，利用兩組中抑制性免疫檢查點(diǎn)的表達(dá)差異推測其對免疫治療的反應(yīng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用R4.1、Adobe Illustrator 2019進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。生存曲線使用Log-rank 檢驗(yàn)，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)相關(guān)性分析 共篩選出2370 個(gè)基因與HIF-1α 存在相關(guān)性（圖1A）。通過與從HADb 下載的232 個(gè)ARGs 比較，結(jié)果篩選出40 個(gè)HIF-1α 表達(dá)相關(guān)的ARGs，見圖1B。

圖1 基因表達(dá)相關(guān)性分析

2.2 GO 和KEGG 富集分析 GO 分析顯示，BP 中主要包括對外界刺激的反應(yīng)、自噬的調(diào)控和對營養(yǎng)水平的反應(yīng)；CC 中主要為膜筏、自噬體以及死亡誘導(dǎo)復(fù)合體；MF 中主要為半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性參與的凋亡信通路，見圖2A；KEGG 富集分析顯示，上述ARGs 主要富集于自噬、凋亡、多種神經(jīng)退行性疾病以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等，見圖2B。

圖2 HIF-1α 相關(guān)性ARGs 的GO 和KEGG 富集分析

2.3 風(fēng)險(xiǎn)評估模型的建立 通過單因素Cox 回歸分析，在40 個(gè)與HIF-1α 相關(guān)的ARGs 中有36 個(gè)與患者生存預(yù)后密切相關(guān)（圖3A）。對其進(jìn)行多元Cox回歸分析，篩選出4 個(gè)ARGs（CASP3、MAPK9、NAMPT、CAMKK2）以構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評估模型（圖3B）。通過所選基因的回歸系數(shù)系數(shù)及相對表達(dá)量構(gòu)建膠質(zhì)瘤患者的風(fēng)險(xiǎn)評分，并以中位風(fēng)險(xiǎn)評分將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組，散點(diǎn)圖顯示高風(fēng)險(xiǎn)組死亡率高于低風(fēng)險(xiǎn)組，熱圖顯示隨著風(fēng)險(xiǎn)評分的升高，CASP3 和NAMPT 在高風(fēng)險(xiǎn)組中表達(dá)升高，與不良預(yù)后相關(guān)；MAPK9 與CAMKK2 在高風(fēng)險(xiǎn)組中表達(dá)降低，其低表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)，為保護(hù)性因素（圖3C）。

圖3 構(gòu)建基于HIF-1α 相關(guān)的ARGs 的風(fēng)險(xiǎn)評分預(yù)后模型

2.4 預(yù)后模型的驗(yàn)證 使用R 語言的survival ROC包，制作不同時(shí)間點(diǎn)的ROC 曲線，并計(jì)算AUC，結(jié)果顯示該風(fēng)險(xiǎn)模型可預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的效果，其中3 年時(shí)AUC 最大，為0.89（圖4A）。K-M 生存曲線顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組生存率高于高風(fēng)險(xiǎn)組（圖4B）。隨著風(fēng)險(xiǎn)評分的升高，死亡患者隨之增加，4 個(gè)ARGs 表達(dá)情況與上述結(jié)果基本一致，K-M 生存曲線同樣驗(yàn)證了該風(fēng)險(xiǎn)評估模型在預(yù)測膠質(zhì)瘤患者的良好表現(xiàn)（圖4C、4D）。

圖4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型效能的評價(jià)

圖4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型效能的評價(jià)（續(xù)）

2.5 風(fēng)險(xiǎn)評估模型與免疫微環(huán)境的關(guān)系 ESITMATE算法顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組免疫浸潤評分高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖5A）；免疫檢查點(diǎn)基因結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組PD1、PDL1、PDL2、LAG3、B7H3、TIM3、CTLA4 高于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖5B）；免疫細(xì)胞浸潤結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組單核細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞和漿細(xì)胞低于低風(fēng)險(xiǎn)組（圖5C）。

圖5 風(fēng)險(xiǎn)評估模型與免疫微環(huán)境的關(guān)系

3 討論

膠質(zhì)瘤具有很強(qiáng)的腫瘤異質(zhì)性，相比肺癌、乳腺癌等其他惡性腫瘤，目前針對膠質(zhì)瘤的靶向治療仍未取得較大進(jìn)展。惡性膠質(zhì)瘤的遺傳不穩(wěn)定性和不均一性明顯，相關(guān)信號通路作用及相互調(diào)節(jié)機(jī)制尚未清楚，多靶點(diǎn)聯(lián)合分析并構(gòu)建相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)模型是膠質(zhì)瘤治療中重要的研究思路。缺氧在膠質(zhì)瘤腫瘤微環(huán)境起重要作用，參與了血管生成、轉(zhuǎn)移、耐藥、免疫逃逸等在內(nèi)的多個(gè)方面。同時(shí)研究證明[13]，缺氧與腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生密切相關(guān)，自噬可以通過缺氧環(huán)境依賴的方式抑制或驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展。HIF-1α是腫瘤缺氧環(huán)境的重要調(diào)控因子，也是腫瘤微環(huán)境中免疫逃逸的重要組成部分。研究報(bào)道[14]，HIF-1α 通過誘導(dǎo)自噬促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃避。

本研究中用于構(gòu)建風(fēng)險(xiǎn)評估模型的4 個(gè)ARGs，包 括 CASP3、MAPK9、NAMPT、CAMKK2。NAMPT 是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）合成的重要限速酶，在調(diào)節(jié)腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，可以驅(qū)動(dòng)IFN-γ 誘導(dǎo)PD-L1 的表達(dá)，并以CD8+T 細(xì)胞依賴的方式調(diào)控腫瘤免疫逃避，進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究證明[15]，抑制NAMPT 可以通過激活線粒體功能障礙有效地靶向調(diào)控膠質(zhì)瘤的遺傳異質(zhì)性。另有研究報(bào)道[16]，CAMKK2 抑制劑可以CD8+T 細(xì)胞依賴的方式抑制乳腺癌細(xì)胞生長，并促進(jìn)免疫細(xì)胞的重新編程。MAPK9 是MAP 激酶家族的一員，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)生物功能中起關(guān)鍵作用。有研究證明[17]，MAPK9 在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮作用。

腫瘤細(xì)胞具有多種免疫逃避的機(jī)制，但其受限于患者腫瘤免疫微環(huán)境的區(qū)別，存在應(yīng)用局限性。通過此風(fēng)險(xiǎn)評估模型判斷膠質(zhì)瘤患者免疫微環(huán)境差異有助于免疫治療的臨床應(yīng)用。腫瘤細(xì)胞通過產(chǎn)生異常的免疫檢查點(diǎn)信號來減弱免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)免疫逃逸[18]。PD1 是重要的T 細(xì)胞抑制因子，其與腫瘤細(xì)胞的PD-L1 結(jié)合可以明顯抑制細(xì)胞毒性T 細(xì)胞的增殖和活性，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，且抑制性免疫檢測點(diǎn)的阻斷治療方法已經(jīng)在多種腫瘤治療中展現(xiàn)了良好的效果。有研究證明[19]，HIF-1α 在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中通過表皮生長因子受體突變調(diào)控程序性細(xì)胞死亡配體1 的表達(dá)。PD1、PDL1、LAG3、TIM3、B7H3 等免疫檢查點(diǎn)的高表達(dá)通常代表腫瘤細(xì)胞對免疫檢查點(diǎn)抑制劑的反應(yīng)較好。本研究中高風(fēng)險(xiǎn)組PD1、PDL1、PDL2、LAG3、B7H3、TIM3、CTLA4 高于低風(fēng)險(xiǎn)組，提示本預(yù)后模型可以用于判斷膠質(zhì)瘤免疫治療的效果。而免疫細(xì)胞浸潤結(jié)果顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組單核細(xì)胞、活化自然殺傷細(xì)胞和漿細(xì)胞低于低風(fēng)險(xiǎn)組；同時(shí)高風(fēng)險(xiǎn)組免疫浸潤評分高于低風(fēng)險(xiǎn)組，以上結(jié)果說明該風(fēng)險(xiǎn)評估模型可以用于判斷膠質(zhì)瘤免疫微環(huán)境的改變。

基于生物信息學(xué)構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評估模型仍具有一定的局限性，使用公共數(shù)據(jù)庫構(gòu)建預(yù)后模型的基因僅有具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)，暫不能肯定其相互作用。本研究中基因的生物學(xué)功能及作用的信號通路仍需在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證，其臨床意義也需在大規(guī)模多中心臨床隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。總之，本研究提供了一種通過構(gòu)建基于缺氧這一重要腫瘤微環(huán)境相關(guān)ARGs 的模型來預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的方法，為膠質(zhì)瘤提供了研究方向和靶點(diǎn)。