WHO—ECAMM標(biāo)準(zhǔn)在瘧原蟲感染效能檢測(cè)中的應(yīng)用研究

王小梅 梁志超 杜 丹 任海林 李 旭 張代濤 何戰(zhàn)英

(北京市疾病預(yù)防控制中心，北京市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100013)

瘧疾(malaria)是由瘧原蟲Plasmodiumspp.所致的蚊媒傳染病，是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題之一。2018年，全世界估計(jì)發(fā)生2.28億瘧疾病例(WHO, 2019)。近年來，全球消除瘧疾的范圍正在擴(kuò)大，越來越多國(guó)家接近本土病例為零。本土病例少于100的國(guó)家數(shù)量從2010年的17個(gè)增加到2017年的25個(gè)和2018年的27個(gè)；表明，全球消除瘧疾已勝利在望。2010年我國(guó)提出“全國(guó)瘧疾消除計(jì)劃”，總目標(biāo)為到2015年除云南邊境地區(qū)外，其他地區(qū)無瘧疾當(dāng)?shù)夭±齻鞑?；?020年全國(guó)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)消除目標(biāo)，即連續(xù)3年無本土感染病例傳播。2017年，我國(guó)首次實(shí)現(xiàn)本地病例零報(bào)告(豐俊，2019；張麗，2019)。

北京市屬于消除計(jì)劃中的四類地域，需及時(shí)做好輸入病例的處置工作?？焖佟?zhǔn)確的診斷是有效防治瘧疾的關(guān)鍵因素，為此，國(guó)家疾控管理部門有計(jì)劃地從各省市抽調(diào)工作人員參加WHO—ECAMM(WHO External Competency Assessment for Malaria Microscopists)培訓(xùn)及考核。盡管多種檢測(cè)方法發(fā)展迅速，厚、薄血膜涂片鏡檢法仍然是瘧疾檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但原蟲形態(tài)多變，影響因素較多，對(duì)鏡檢人員的要求較高。2011—2017年，本實(shí)驗(yàn)室主要以實(shí)時(shí)熒光定量PCR、巢式PCR和鏡檢3種方法同時(shí)進(jìn)行樣本復(fù)核檢測(cè)，間或以RDT作為輔助，實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)鏡檢陽性率最高，巢式PCR陽性率高于實(shí)時(shí)熒光PCR，但差距不大，與鏡檢相比均有“假陰性”情況出現(xiàn)，RDT陽性率相對(duì)最低，與國(guó)內(nèi)同行結(jié)論有所不同(營(yíng)亞茹，2014；王真瑜，2017)。因此，本文選取2018—2019年全部樣本，從血片制作到鏡檢嚴(yán)格按照我國(guó)現(xiàn)行診斷標(biāo)準(zhǔn)，并參照WHO—ECAMM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)效能比較，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 WHO—ECAMM考核評(píng)估

WHO—ECAMM總計(jì)考核56張血片，考核血片全部來源于WHO，考官由WHO官員擔(dān)任(Li, 2019)。每張血片計(jì)時(shí)10 min，結(jié)果判定包括原蟲識(shí)別、蟲種鑒定及原蟲計(jì)數(shù)3部分。原蟲識(shí)別和蟲種鑒定計(jì)42張血片，結(jié)果判定為：陰性、惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、卵型瘧原蟲、三日瘧原蟲、混合感染(明確寫出原蟲型別，錯(cuò)誤不得分，漏寫扣一半分)。原蟲計(jì)數(shù)為指定14張惡性瘧血片，密度計(jì)算公式為：(原蟲數(shù)/白細(xì)胞數(shù))×8 000個(gè)/μL。密度計(jì)數(shù)考核范圍從<100至200 000～400 000個(gè)/μL。測(cè)評(píng)標(biāo)準(zhǔn)：原蟲識(shí)別(陰陽性判定)準(zhǔn)確率不低于90%(42張血片錯(cuò)誤小于4張血片)，原蟲型別鑒定準(zhǔn)確率不低于90%(42張血片錯(cuò)誤小于4張血片)，原蟲計(jì)數(shù)準(zhǔn)確率不低于50%(計(jì)數(shù)<標(biāo)準(zhǔn)參考值75%或>125%不得分，計(jì)數(shù)錯(cuò)誤<7張血片)，可以獲得WHO—ECAMM 一級(jí)證書，證書有效時(shí)限3年。

1.2 資料來源

收集2018—2019年北京市各區(qū)疾控中心送檢的臨床診斷或疑似瘧疾病例的抗凝血，共計(jì)227件。

1.3 鏡檢

血涂片的制作和瘧原蟲鏡檢方法參照《WS 259—2015 瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)》《瘧原蟲檢測(cè) 血涂片鏡檢法 WS/T 569—2017》(中華人民共共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)，2015, 2017)。血涂片制作符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，厚、薄血膜的形狀、大小、染色參照WHO—ECAMM考核用血片庫(kù)提供的血片樣式，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和WHO血片庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)一致。鏡檢以檢查厚血膜為主，薄血膜用于蟲種鑒別輔助，根據(jù)蟲體不同發(fā)育時(shí)期不同形態(tài)特征進(jìn)行蟲種鑒定。10 min內(nèi)或200視野以上，厚血膜未見瘧原蟲可判為陰性。由WHO—ECAMM一級(jí)鏡檢員在100倍油鏡下進(jìn)行，同時(shí)進(jìn)行原蟲計(jì)數(shù)。單一樣本從血涂片制作到鏡檢完成耗時(shí)30 min，其中，鏡檢在10 min內(nèi)完成。

1.4 瘧原蟲核酸檢測(cè)

采用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒提取待檢測(cè)核酸，采用上海之江公司惡性瘧/間日瘧/三日瘧/卵型瘧瘧原蟲核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。反應(yīng)總體積為40 μL，PCR擴(kuò)增參數(shù)：37 ℃ 2 min, 94 ℃ 2 min, 93 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 循環(huán)40次，60 ℃進(jìn)行熒光信號(hào)收集。依試劑盒說明書，Ct≤38可判為陽性。當(dāng)待檢測(cè)樣本中核酸濃度含量低于最低檢測(cè)限103copies/mL時(shí)，可能發(fā)生假陰性結(jié)果。因PCR技術(shù)發(fā)展迅速，每種的敏感性不盡相同(魯少平，2015；李軻，2013；李美，2015)，本文選用實(shí)驗(yàn)室常用的一種成品試劑盒作為定性比較，核酸檢測(cè)由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)具備分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)資質(zhì)的人員承擔(dān)。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

瘧原蟲顯微鏡檢與核酸檢測(cè)的計(jì)數(shù)資料差異采用χ2檢驗(yàn)和一致性分析方法。一致性檢驗(yàn)分析(李立明，2015)，數(shù)理統(tǒng)計(jì)的原理及公式如下：特異度(即真陰性度)=真陰性/(真陰性+假陽性)×100%，陽性預(yù)告值=真陽性/(真陽性+假陽性)×100%，陰性預(yù)告值=真陰性/(假陰性+真陰性)×100%。

2 結(jié)果

2.1 鏡檢及熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果

收集的227件樣本，鏡檢結(jié)果為：惡性瘧129件、間日瘧12件、三日瘧9件、卵型瘧17件、混合感染10件、陰性50件；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為：惡性瘧110件、間日瘧6件、三日瘧7件、卵型瘧12件、混合感染6件、陰性86件。兩種瘧疾檢測(cè)方法效果比較，詳見表1。

表1 兩種方法檢驗(yàn)瘧原蟲效果比較

兩種方法檢測(cè)同一份樣品，都取得了較高陽性率，總體陽性率在70%左右。但顯微鏡檢高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，P<0.005，其差異有非常顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？梢钥闯?，獲得WHO—ECAMM資質(zhì)的顯微鏡檢的靈敏性更優(yōu)越。在不同型別瘧原蟲檢出效果上，亦顯示出同樣趨勢(shì)，特別是對(duì)于間日瘧和混合瘧，顯微鏡檢的辨識(shí)力更強(qiáng)。

2.2 兩種檢測(cè)方法一致性分析

按照顯微鏡檢和實(shí)時(shí)熒光定量PCR均陽性、顯微鏡檢陽性而實(shí)時(shí)熒光PCR陰性、顯微鏡檢陰性而實(shí)時(shí)熒光PCR陽性、顯微鏡檢和實(shí)時(shí)熒光PCR均陰性4種狀態(tài)列表(表2)。

表2 兩種檢測(cè)方法一致性分析

顯微鏡檢和實(shí)時(shí)熒光定量PCR一致性為84.1%，實(shí)時(shí)熒光定量PCR靈敏度為79.7%，假陰性為20.3%。特異度和陽性預(yù)告值均為100%，陰性預(yù)告值為58.1%。顯微鏡檢和實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷瘧原蟲感染，一致性達(dá)到88.1%，相互驗(yàn)證了兩種方法的可靠性和準(zhǔn)確性，都是檢測(cè)瘧原蟲感染的優(yōu)選技術(shù)，都可以作為診斷瘧疾“金標(biāo)準(zhǔn)”。和顯微鏡檢相比，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)瘧原蟲感染靈敏度為79.7%，雖也靈敏，但有差距，其特異度和陰、陽性預(yù)告值達(dá)到100%，診斷瘧原蟲感染極少出現(xiàn)假陽性，但陰性預(yù)告值為58.1%，即實(shí)時(shí)熒光PCR判斷為陰性，其真正陰性的幾率為58.1%。表明在瘧原蟲感染狀態(tài)中，實(shí)時(shí)熒光PCR報(bào)告陰性，未必是真的陰性，經(jīng)計(jì)算假陰性率為20.3%，不可忽視。經(jīng)此比較后，顯微鏡檢診斷瘧原蟲感染，效能確實(shí)精準(zhǔn)高效，金標(biāo)準(zhǔn)地位牢靠。

3 討論

北京市瘧疾防控情況特殊，90%左右的樣本來源于三家綜合性傳染病醫(yī)院，其余樣本多來源于大型綜合性醫(yī)院。輸入性瘧疾與境外多種烈性傳染病具有相同的疫源地，如基孔肯雅熱、黃熱病、埃博拉等(孫玉蘭等，2020)，在疫情處理過程中，快速明確診斷尤為關(guān)鍵。

顯微鏡檢是最為經(jīng)典的瘧原蟲病原學(xué)檢測(cè)方法，快捷且廉價(jià)。血片涂制在3～5 min內(nèi)可以完成，待厚血膜完全干燥后染色10 min，自然晾干后即可進(jìn)行鏡檢。受空氣濕度影響，厚血膜干燥的時(shí)間略有不同。經(jīng)過訓(xùn)練的鏡檢人員可在10 min內(nèi)做出明確判斷，準(zhǔn)確率可大于90%。顯微鏡檢從樣本制作到明確判斷結(jié)果，檢測(cè)全程可在30 min內(nèi)完成。能夠更有效地節(jié)約時(shí)間、人力、物力、財(cái)力。同時(shí)，瘧疾(特別是惡性瘧)病情發(fā)展迅速，診斷越快，越能降低感染者的危險(xiǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種相對(duì)省時(shí)的分子生物學(xué)方法。瘧原蟲核酸提取可以有多種方法，最快可在30 min內(nèi)完成。不同試劑盒的實(shí)時(shí)熒光PCR所需時(shí)間也有差距，本文所選試劑可在90 min內(nèi)完成。檢測(cè)全程最少需要2 h。巢式PCR以及基因測(cè)序等更為精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，用時(shí)則更長(zhǎng)。

WHO—ECAMM考核是對(duì)鏡檢人員的綜合評(píng)定，從精力、心理、能力全方位考核，充分考慮多種影響因素，最大限度的保持公正公平客觀。經(jīng)過WHO—ECAMM認(rèn)證，鏡檢員技術(shù)水平穩(wěn)定提高(Li，2019)。本文結(jié)果顯示，在平行樣品檢測(cè)中，顯微鏡檢測(cè)敏感性高于實(shí)時(shí)熒光定量PCR，展示了優(yōu)秀效能。在惡性瘧、間日瘧、三日瘧、卵型瘧、混合感染的型別鑒定中，一致性亦優(yōu)于實(shí)時(shí)熒光定量PCR?？茖W(xué)地印證了顯微鏡檢和實(shí)時(shí)熒光定量PCR總體一致性達(dá)到84.1%，都是檢測(cè)瘧疾感染的先進(jìn)手段。

巢式PCR檢測(cè)瘧原蟲靈敏度可達(dá)10個(gè)/μL以下(李軻，2013)，更高者可達(dá)1個(gè)/μL(Han，2007)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR、巢式PCR等分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域和其他生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮了不可替代的功用(馮霞，2020；王愛梅，2020)，技術(shù)成熟，經(jīng)過培訓(xùn)的工作人員可掌握基本技能且重復(fù)性好(張耀光，2021)。在瘧疾感染的PCR檢測(cè)中，由于受不同廠家、試劑、生產(chǎn)批次、特異基因片段的影響(李軻，2013；李美，2015)，靈敏度和穩(wěn)定性也受到一定影響。本文僅比較了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR成品試劑和顯微鏡檢的檢測(cè)效能，表明鏡檢人員通過嚴(yán)格長(zhǎng)期培訓(xùn)后，可達(dá)到快速準(zhǔn)確診斷瘧疾的目的。但由于人員差異明顯，實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性和穩(wěn)定性達(dá)不到PCR的水準(zhǔn)。應(yīng)對(duì)更多新的傳染病疫情和突發(fā)公共衛(wèi)生事件，PCR有較多的應(yīng)用場(chǎng)景和提升空間。

在227件樣本的檢測(cè)過程中，由于樣本采集時(shí)間的不同，原蟲形態(tài)受藥物、采集時(shí)間、送檢時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間影響很大，較WHO—ECAMM提供的考核血片更為復(fù)雜，需要不斷積累大量經(jīng)驗(yàn)才能做出準(zhǔn)確判斷。在操作實(shí)踐中，部分樣本采集時(shí)間可能在病人已經(jīng)服藥之后，血中原蟲很有可能已經(jīng)降至很低水平甚至消失，惡性瘧患者配子體少見或偶見其他時(shí)期形態(tài)，都嚴(yán)重影響鏡檢結(jié)果，而送檢時(shí)間延誤，有可能導(dǎo)致的血樣溶血，也會(huì)使鏡檢判別非常困難(王小梅，2021)而對(duì)于混合感染的樣本，即使兩種瘧原蟲存在同一病例體內(nèi)，也會(huì)有感染密度不同的情況出現(xiàn)，(李仁清，2019)。在國(guó)內(nèi)報(bào)道中，曾有卵型瘧不同亞型的出現(xiàn)，依據(jù)不同引物的PCR結(jié)果可以判斷亞型的具體型別(李美，2014)。而對(duì)于卵型瘧的不同亞型，形態(tài)學(xué)并無差別，鏡檢無法第一時(shí)間進(jìn)行評(píng)判。

經(jīng)多年的防控，北京市各種寄生蟲疾病的感染率大幅下降，醫(yī)務(wù)人員對(duì)于寄生蟲病的重視程度也隨之下降，大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)人員崗位流動(dòng)性大，從事鏡檢的專職人員少，技術(shù)儲(chǔ)備不足日益凸顯。服藥后或者密度極低感染者樣本的出現(xiàn)，給檢測(cè)增加了難度?？焖俅_診成為輸入性傳染病防控的最基本要求。在引進(jìn)新技術(shù)的同時(shí)，也要重視培訓(xùn)醫(yī)務(wù)人員的實(shí)驗(yàn)技能和操作水平；鏡檢除高效檢出瘧原蟲外，還能夠評(píng)判用藥效果。

當(dāng)下，中國(guó)本土無瘧疾病例報(bào)告，輸入性瘧疾卻不斷攀升。隨著全球化和旅游、物流頻繁猛進(jìn)，多種傳染病的境外輸入日益增多(李夫，2020)，瘧疾的輸入已經(jīng)成為常態(tài)。如何更高效準(zhǔn)確的進(jìn)行瘧疾診斷，與多種傳染病進(jìn)行快速鑒別診斷，是當(dāng)前傳染病防控工作的應(yīng)有之義。

綜上所述，以鏡檢為主的多種瘧疾檢測(cè)方法聯(lián)合應(yīng)用，能夠更好地服務(wù)于北京市瘧疾防控工作。