一種野外采集臭蟲種群實(shí)驗(yàn)室馴化飼養(yǎng)方法的研究*

李 靜 閻 婷 周小潔 佟 穎 曾曉芃

(北京市疾病預(yù)防控制中心，北京 100013)

臭蟲屬于半翅目(Hemiptera)臭蟲科(Cimicidae)，是一類專吸動(dòng)物血液的無(wú)翅昆蟲,在人居環(huán)境中嗜吸人血，人體被臭蟲叮咬后會(huì)出現(xiàn)皮膚紅腫、瘙癢等癥狀(Goddardetal.，2009)。此外，在熱帶臭蟲Cimexhemipterus體內(nèi)和糞便中均發(fā)現(xiàn)了與人類疾病相關(guān)的五日熱巴爾通體(Leulmietal., 2015);實(shí)驗(yàn)室條件下溫帶臭蟲C.lectularius可以攜帶克氏錐蟲Trypanosomacruzi，并能夠在小鼠間傳播恰加斯病( Salazaretal., 2015)。

20世紀(jì)40—50年代，臭蟲危害較為嚴(yán)重，隨著DDT等化學(xué)殺蟲劑的使用，臭蟲的發(fā)生數(shù)量大大降低。20世紀(jì)90年代臭蟲危害復(fù)現(xiàn)，進(jìn)入21世紀(jì)，臭蟲在51個(gè)國(guó)家和地區(qū)再猖獗，我國(guó)臭蟲危害也有明顯上升趨勢(shì)(Wangetal., 2013, 2015)。由于臭蟲的歷史危害及近期再猖獗嚴(yán)重，使得針對(duì)臭蟲的各項(xiàng)研究愈發(fā)得到各界重視，而許多如臭蟲生態(tài)學(xué)、抗藥性、藥效等研究的基礎(chǔ)是臭蟲種群的實(shí)驗(yàn)室維持與飼養(yǎng)，長(zhǎng)期馴化后的實(shí)驗(yàn)室敏感種群不能完全代表野外種群的生理狀態(tài)與習(xí)性。但野外臭蟲種群在實(shí)驗(yàn)室條件下的維持、飼養(yǎng)與馴化的難度較大，與試蟲采集數(shù)量、血源供應(yīng)、飼養(yǎng)環(huán)境等因素密切相關(guān)，逐漸成為限制許多研究的因素。為此，本研究建立一種臭蟲種群的實(shí)驗(yàn)室快速馴化飼養(yǎng)方法，為臭蟲的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲

溫帶臭蟲C.lectularius2020年9月采自北京市海淀區(qū)某集體宿舍。

1.2 設(shè)備耗材

人工氣候箱(三洋MLR-351 H)、加熱循環(huán)槽(bluepard MP-5 H)、玻璃標(biāo)本缸(直徑約20 cm，高約30 cm)、玻璃果醬瓶(180 mL，高約9.0 cm，底部直徑約5.6 cm，口徑約6.6 cm)、小鼠固定夾、Parafilm薄膜、玻璃喂血器(Montesetal.，2002)、定性濾紙(80 g/m2)。

1.3 飼養(yǎng)條件確定

通過(guò)Pubmed、Web of Science、中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“bed bug”“artificial feeding”“臭蟲”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，對(duì)檢索結(jié)果進(jìn)行手工篩選，獲取涉及臭蟲飼養(yǎng)方法的文獻(xiàn)，將文獻(xiàn)中相關(guān)飼養(yǎng)條件進(jìn)行比較分析，確定飼養(yǎng)環(huán)境、容器等參數(shù)，然后開展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 飼喂方法

小白鼠飼喂：用固定夾將小白鼠(KM系，體重為35～40 g雌鼠)固定，用腹部供臭蟲吸血。人工膜飼喂：采用無(wú)菌脫纖維兔血(Solarbio)經(jīng)水浴加熱后使用薄膜喂血器喂血。

1.5 試蟲分組

將上述野外采集的臭蟲分為對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組一直采用活體小白鼠飼喂；實(shí)驗(yàn)組馴化時(shí)每次優(yōu)先采用人工膜飼喂，隨后用小白鼠補(bǔ)充，以確保種群正常繁殖。每次喂血期間每隔1 h記錄試蟲的飽血情況，以觀察臭蟲腹部血液充盈、沒(méi)有可見的淺色區(qū)域?yàn)轱栄獦?biāo)準(zhǔn)。計(jì)算不同時(shí)間的臭蟲飽血率(%)，即飽血試蟲數(shù)占喂血試蟲總數(shù)的百分比。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)30只試蟲。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用 WPS Office表格對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組臭蟲飽血率的平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 環(huán)境參數(shù)

2.1.1溫濕度 文獻(xiàn)表明，實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的溫度主要介于26～28 ℃，相對(duì)濕度為40%～70%(表1)。因此，綜合考慮不同研究中所選取的溫濕度、飼養(yǎng)設(shè)備的維護(hù)與穩(wěn)定性，本研究將臭蟲飼養(yǎng)的溫濕度設(shè)置為26 ℃，50%RH。

表1 不同文獻(xiàn)中臭蟲飼養(yǎng)的溫濕度參數(shù)

2.1.2光周期 關(guān)于臭蟲實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的光照條件主要為12 L∶12 D(表2)。因此，將臭蟲飼養(yǎng)的光周期設(shè)置為12 L∶12 D。

表2 臭蟲人工飼養(yǎng)的光照條件

2.2 飼養(yǎng)容器

在國(guó)外的文獻(xiàn)中，臭蟲人工飼養(yǎng)多使用果醬瓶或塑料瓶等小型容器，紗網(wǎng)封口，臭蟲透過(guò)紗網(wǎng)吸血(Gilbertetal.，1964; Montesetal.，2002; Chin-Headyetal.，2013)。參照Feldlaufer等(2014)的描述，本研究采用金屬蓋果醬瓶作為飼養(yǎng)容器，將不銹鋼編織網(wǎng)(80目)用免釘膠固定在金屬蓋內(nèi)，將裁減到適宜尺寸的長(zhǎng)方形濾紙折疊后放入罐內(nèi)(圖1)作為臭蟲棲息點(diǎn)。本研究利用商品化果醬瓶加以改進(jìn)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，完全達(dá)到了臭蟲的吸血、繁殖以及有效防止低齡若蟲逃逸的目的。根據(jù)觀察，每個(gè)飼養(yǎng)罐中臭蟲密度維持在200只左右可達(dá)到較好的吸血與繁殖狀態(tài)。

圖1 臭蟲飼養(yǎng)罐

2.3 馴化方式

臭蟲飼養(yǎng)主要有活體動(dòng)物飼喂和人工膜飼喂2種方式(Aaketal., 2014；Montesetal., 2002；王磊等，2016)，前者主要使用實(shí)驗(yàn)用小白鼠，后者采用人工膜系統(tǒng)配合兔血、雞血、羊血和牛血等血源。按照本研究馴化策略，對(duì)照組臭蟲一直采用活體小白鼠飼喂；實(shí)驗(yàn)組試蟲每次先采用人工膜飼喂，發(fā)現(xiàn)F0～F1代臭蟲基本不吸血，然后用小白鼠飼喂，雖然吸血率較低，但可維持種群的正常繁殖。從F2代開始，1齡若蟲開始取食人工膜血，便以F2代的3～4齡若蟲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以飽血率為指標(biāo)，比較小白鼠供血、人工膜與小白鼠混合供血兩種喂血方式的吸血情況。結(jié)果顯示，以人工膜飼喂時(shí)，在5 h后臭蟲飽血率維持在72.84%±4.62%，至6 h并不再繼續(xù)取食，6 h后改為小白鼠持續(xù)飼喂至24 h；20 h時(shí)吸血率達(dá)到92.84%±3.04%，且至24 h不再吸血。對(duì)照組試蟲的F2代以活體小白鼠為血源，在5 h后飽血率為51.11%±10.86%，20 h飽血率可達(dá)到93.33%±2.72%，同樣至24 h不再吸血(圖2)。

圖2 野外采集臭蟲種群F2代(3～4齡若蟲)不同喂血方式飽血率比較

3 討論

3.1 環(huán)境參數(shù)

臭蟲生活史與環(huán)境溫度有重要關(guān)系，其不同溫度下發(fā)育時(shí)間存在較大差異性，23 ℃時(shí)生活史周期為46 d，28 ℃時(shí)生活史周期為31 d(姜志寬等，2012)，不同研究中飼養(yǎng)溫度多為26～28 ℃，光周期多為12 L∶12 D。本研究中臭蟲飼養(yǎng)環(huán)境溫度和光周期的參數(shù)主要來(lái)源于參考文獻(xiàn)。相對(duì)濕度低時(shí)不利于臭蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，但相對(duì)濕度過(guò)高時(shí)，易導(dǎo)致飼養(yǎng)罐內(nèi)孳生霉菌。綜合不同來(lái)源文獻(xiàn)中臭蟲飼養(yǎng)環(huán)境參數(shù)，本研究將溫度設(shè)定為26 ℃，相對(duì)濕度50%，光周期為12 L∶12 D。

3.2 飼養(yǎng)容器

本研究最初用圓柱狀玻璃標(biāo)本缸作為飼養(yǎng)容器，將野外采集的臭蟲移至折疊的濾紙條上，放入標(biāo)本缸內(nèi)，將小白鼠用可折疊的網(wǎng)狀固定夾固定后放入玻璃標(biāo)本缸中供臭蟲吸血。連續(xù)觀察吸血情況發(fā)現(xiàn)，使用該喂血方式臭蟲基本不吸血，10 d后野外采集的臭蟲死亡率達(dá)30%。對(duì)于野外采集的臭蟲種群，其寄主由人轉(zhuǎn)換到小白鼠，加之采集的蟲量有限，在空間相對(duì)大的昆蟲飼養(yǎng)缸中，臭蟲吸血效率極低，甚至無(wú)法完成吸血，因此，該容器并不適合于野外臭蟲種群前期在實(shí)驗(yàn)室馴化飼養(yǎng)。

為此，本研究轉(zhuǎn)為使用國(guó)外文獻(xiàn)中最為常用的果醬瓶，并對(duì)瓶蓋加以改進(jìn)。參考文獻(xiàn)中的飼養(yǎng)容器(Feldlauferetal., 2014)，將尼龍紗網(wǎng)更換為不銹鋼紗網(wǎng)(80目，絲徑0.1 mm，孔徑0.21 mm)，并將之粘固在金屬蓋內(nèi)，同時(shí)使用硅膠墊圈(厚度1 mm)加固。既避免了在試蟲轉(zhuǎn)移過(guò)程中附著在紗網(wǎng)上的臭蟲逃逸，又能避免使用固定夾進(jìn)行小白鼠活體喂血時(shí)鼠爪破壞尼龍網(wǎng)而引起的臭蟲逃逸。研究最后選用的飼養(yǎng)容器為180 mL果醬瓶，在該容器中飼養(yǎng)臭蟲種群數(shù)量既能滿足實(shí)驗(yàn)需要，又便于飼養(yǎng)罐的日常清理和試蟲挑選。

3.3 馴化方式

在寄主搜索過(guò)程中，寄主源物質(zhì)如CO2、揮發(fā)性氣味和寄主體溫能夠?qū)Τ粝x起到定向吸引作用(Marx，1955)。研究表明，CO2本身或與人類的氣味和熱量相結(jié)合，是臭蟲最重要的宿主覓食線索(Marx, 1955; Andersonetal., 2009; Wangetal., 2009)。臭蟲的飼養(yǎng)方式主要有活體動(dòng)物和人工膜飼喂兩種方式。在70份臭蟲實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的調(diào)查報(bào)告中，50%采用人工膜供血，23%采用實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，10%采用人體作為血液來(lái)源，7%采用人工膜和自然飼養(yǎng)相結(jié)合的方式，還有10%未描述其飼養(yǎng)方法(Aaketal., 2014)。因此，寄主的改變是野外采集的臭蟲種群在實(shí)驗(yàn)室馴化飼養(yǎng)的主要影響因素，這也部分解釋了野外采集臭蟲在前2代無(wú)法準(zhǔn)確定位人工喂血器的原因。采用活體飼喂，具有血源易得、血液新鮮等優(yōu)點(diǎn)，但由于小白鼠備皮、固定等操作方式，導(dǎo)致臭蟲吸血情況不穩(wěn)定，且可能有不符合動(dòng)物福利和倫理審查等問(wèn)題。而人工膜飼喂法具有操作方便、效果穩(wěn)定、易標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)。本研究主要采用較為普遍的脫纖維兔血作為人工膜血源與活體小白鼠兩種喂血方式進(jìn)行比較分析，野外采集到的F0代試蟲采用人工膜喂血時(shí)，基本不吸血，這可能與寄主的突然改變有關(guān)，進(jìn)而采用小白鼠活體飼喂，飽血率也相對(duì)較低，F(xiàn)1也存在上述現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)時(shí)間短的野外采集臭蟲種群，采用人工膜飼喂吸血效果不佳(Kilpinenetal.，2011)，也有文獻(xiàn)報(bào)道在實(shí)驗(yàn)室用活體動(dòng)物和人工膜飼喂，臭蟲均可正常繁殖(Montesetal.，2002；Chin-Headyetal.，2013)。以1%肝素抗凝的人血和活鼠為血源飼喂的臭蟲，隨著時(shí)間的推移，其生命周期與死亡率沒(méi)有顯著差異(Aaketal., 2014)，但這些實(shí)驗(yàn)所用臭蟲種群均已在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)馴化養(yǎng)殖2年以上。

本研究中，野外臭蟲種群F0和F1代在實(shí)驗(yàn)室無(wú)法使用人工膜飼喂，但從F2代開始逐步接受人工膜飼喂方式，且在6 h內(nèi)飽血率可達(dá)到72.84%±4.62%，而以小白鼠為血源的對(duì)照組在6 h內(nèi)飽血率僅為54.44%±12.45%。這可能與小白鼠被吸血時(shí)的身體震顫影響臭蟲取食有關(guān)，但是隨著時(shí)間延長(zhǎng)至24 h其飽血率可達(dá)到93.33%±2.72%。因此，為了確保種群馴化效果，本研究從F2代開始采用混合飼喂的方式，即首先用人工膜飼喂(時(shí)間大約4 h)，然后用小白鼠針對(duì)不適應(yīng)人工膜的臭蟲個(gè)體進(jìn)行補(bǔ)充喂血。通過(guò)該方式使得該種群的整體飽血率與單純用小白鼠供血的對(duì)照組基本保持一致。需要指出的是，由于脫纖維動(dòng)物血液靜置易產(chǎn)生溶血和紅細(xì)胞沉淀，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明，臭蟲在飼喂4 h后飽血率基本保持不變。因此，在人工飼喂中觀察飽血率的時(shí)間上限為4 h。

根據(jù)本研究中飽血率實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，野外臭蟲F0和F1代最好使用小白鼠進(jìn)行活體飼喂；對(duì)于不同的野外種群，需要持續(xù)用小白鼠飼養(yǎng)的代數(shù)取決于種群的特點(diǎn)，本研究結(jié)果是針對(duì)該種群，可以為其他研究者提供參考思路。雖然F2代的3～4齡若蟲采用人工飼喂在6 h內(nèi)的吸血率顯著高于采用活體小白鼠飼喂，但連續(xù)活體飼喂20 h后臭蟲飽血率可達(dá)92.84%±3.04%。因此，在野外臭蟲種群的實(shí)驗(yàn)室馴化初期，采用小白鼠進(jìn)行連續(xù)活體飼喂，后續(xù)采用活體飼喂與人工膜飼喂混合飼養(yǎng)，并逐步過(guò)渡到純?nèi)斯つわ曃沟姆绞?，有助于快速穩(wěn)定地完成野外臭蟲種群的實(shí)驗(yàn)室馴化。