紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料的研制及功效評估

馮艷鈺，范群艷,2，王德華，王培鑫，胡嘉淼*，張怡*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州 350000）

（2.廈門市燕之屋絲濃食品有限公司，福建廈門 361000）

隨著國民生活節(jié)奏的不斷加快，以及工作壓力的增加，失眠人群比例正在逐年升高。失眠是指患者對睡眠時間不足和質(zhì)量下降間接影響日間社會功能的一種慢性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，失眠能夠造成記憶力減退，注意力不集中等現(xiàn)象，并對大腦造成不可逆的損傷[1]。同時失眠也是各類心腦血管疾病、神經(jīng)退行性疾病的重要誘因之一。失眠不僅與個體自身的生理原因相關(guān)，與整個社會形態(tài)、生活形態(tài)的變遷也有密切聯(lián)系[2]。在睡眠時長越縮越短的情況下，睡眠質(zhì)量就顯得至關(guān)重要。《2020年中國睡眠指數(shù)報告》調(diào)查研究表明，目前我國65%成年人受失眠困擾，79.3%的人高度關(guān)注睡眠，助眠產(chǎn)品消費率達(dá)到67.4%，人們對于改善睡眠質(zhì)量的欲望顯著增強。目前，治療失眠的藥物主要包括地西泮、抗抑郁藥或抗精神病類的藥物等。但由于失眠成因復(fù)雜，治療難度大，用藥周期長，會出現(xiàn)藥物依賴和反跳等副作用[3]。

作為一種神經(jīng)氨酸的燕窩酸是燕窩中具有生物活性的主要成分，其廣泛存在動物組織和微生物當(dāng)中。大腦中神經(jīng)細(xì)胞的信息傳遞及神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)必須通過突觸來實現(xiàn)，而燕窩酸可以利用與腦細(xì)胞膜及突觸的相互調(diào)節(jié)，來加快腦神經(jīng)細(xì)胞突觸的響應(yīng)。因此，燕窩酸是神經(jīng)細(xì)胞信息傳遞的重要遞質(zhì)[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞膜中的燕窩酸含量是其它細(xì)胞的20倍，同時人體腦細(xì)胞中的燕窩酸含量是其它動物腦細(xì)胞的2～4倍。

紅參和熟酸棗仁是我國醫(yī)學(xué)典籍中具有安神利眠功效的傳統(tǒng)天然原料[6]。中醫(yī)表明，紅參可以滋補人體五臟、除濕，長期攝入紅參可達(dá)到安神補腦的功效[7]。紅參有著改善失眠的作用是由于紅參里面有大量的皂苷能直接作用于人類中樞神經(jīng)，可營養(yǎng)神經(jīng)元也能雙向調(diào)節(jié)神經(jīng)功能，在人們神經(jīng)保持興奮時，它能讓神經(jīng)安靜下來，而在神經(jīng)過于安靜時，它則能讓神經(jīng)興奮，當(dāng)出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)失眠、疲勞等癥狀時，適量食用紅參就能使癥狀得到緩解[8]。酸棗仁為鼠李科植物酸棗的干燥成熟種子，味甘性平，入心肝二經(jīng)，是常用中藥，臨床具有養(yǎng)肝、寧心、安神的功效[9]?，F(xiàn)代藥理研究表明，酸棗仁含有酸棗仁皂苷等活性成分，因此，能夠有效鎮(zhèn)靜安神，對失眠者療效顯著。酸棗仁主要是通過影響慢波睡眠的深睡階段，使深睡的平均時間延長，發(fā)作頻率增加，達(dá)到改善睡眠的目的[10]。

本研究以紅參、燕窩、熟酸棗仁為主要原料，充分利用其的活性物質(zhì)的功能性，經(jīng)打漿、調(diào)配等優(yōu)化飲品配方來有效提高復(fù)合飲品的質(zhì)量，研制出一種質(zhì)地均勻、品質(zhì)優(yōu)良的新型紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料。再以健康雄性小鼠為實驗對象，用紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料（高、中、低劑量）對連續(xù)灌胃30 d，通過直接睡眠實驗、延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期，及對小鼠腦組織血清素系統(tǒng)指標(biāo)和神經(jīng)遞質(zhì)指標(biāo)檢測實驗，全面系統(tǒng)的研究紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料改善睡眠的功效。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

燕窩、紅參、黃精粉、熟酸棗仁粉均購于廈門市燕之屋絲濃食品有限公司；SPF級Balb-c健康雄性小鼠購于閩侯縣吳氏實驗動物貿(mào)易有限公司[許可證號SCXK（滬）2017-0012]。乙腈，Dikma pure Dima technology INC，美國；氯霉素，北京索萊寶科技有限公司；酸棗仁皂苷、燕窩酸和紅參皂苷均購于中國藥品生物制品檢定所；水為超純水，其他試劑均為分析純；5-HT、TPH、Glu、GABA試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

PI4000型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源（ESI），美國AB公司；1200液相色譜系統(tǒng)，美國Agilent公司。JL-UPK-I-5T超純水機，四川金瀾科技有限公司；DL-360A超聲波清洗器，上海之信儀器有限公司；HZT-A+100電子天平，美國康州HZ電子有限公司。

1.2 紅參-燕窩參復(fù)合飲品制備

1.2.1 單因素實驗

（1）紅參粉添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的確定：燕窩原汁0.5%、熟酸棗仁粉4.0%、黃精粉1.5%，考察不同的紅參粉添加量（0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.5%）對復(fù)合飲品品質(zhì)的影響。

（2）燕窩原汁添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的確定：紅參粉0.5%、熟酸棗仁粉4.0%、黃精粉1.5%，考察不同的燕窩原液添加量（0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.5%）對復(fù)合飲品品質(zhì)的影響。

（3）熟酸棗仁粉添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的確定：紅參粉原汁0.5%、燕窩原汁0.5%、黃精粉1.5%，考察不同的熟酸棗仁粉添加量（3.0%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%）對復(fù)合飲品品質(zhì)的影響。

（4）黃精粉添加量（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的確定：燕窩原汁0.5%、熟酸棗仁粉4.0%、燕窩原汁0.5%，考察不同的黃精粉添加量（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%）對復(fù)合飲品品質(zhì)的影響[11]。

1.2.2 正交試驗

結(jié)合單因素實驗結(jié)果，以紅參粉添加量、燕窩原汁添加量、熟酸棗仁粉添加量和黃精粉添加量作為四個因素，設(shè)計L9（34）正交實驗，確定各因素對紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料感官品質(zhì)影響的大小，得出最佳配方[12]。正交試驗因素水平見表1。

1.2.3 產(chǎn)品感官評定

依據(jù)紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料的品質(zhì)風(fēng)味制定出符合本復(fù)合飲品的感官評定標(biāo)準(zhǔn)（表2），組織15名經(jīng)過特定感官評定培訓(xùn)的大學(xué)生作為符合飲品評定小組，分別對飲品的色澤、風(fēng)味、組織狀態(tài)及口感進(jìn)行感官評定。

1.2.4 復(fù)合飲料中燕窩酸含量的測定

取飲品3 mL于燒杯中，加入甲醇補滿，用0.45 μm有機濾膜后，采用高效液相色譜法測定復(fù)合飲料中燕窩酸含量。色譜柱為Waters Atlanti T3 5 μm（4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液（1:9，V/V）；流速為0.5 mL/min；柱溫30 ℃。每份樣品溶液進(jìn)樣3次，記錄峰面積，另取燕窩酸對照品溶液同法記錄峰面積，以峰面積的3次平均值計算含量，外標(biāo)法定量。按上述色譜條件和質(zhì)譜條件測定峰面積，并以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=22 307x+7 511，R＝0.999 6。

1.2.5 復(fù)合飲料中紅參皂苷含量的測定

取飲品3 mL于燒杯中，加入甲醇補滿，用0.45 μm有機濾膜后，采用高效液相色譜法測定復(fù)合飲料中紅參皂苷含量。采用 Phenomenex Gemini C18（50 mm×2.0 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行分析，乙腈-0.2%磷酸（35:65）為流動相，流速為1 mL/min，柱溫35 ℃。每份樣品溶液進(jìn)樣3次，記錄峰面積，另取紅參皂苷對照品溶液同法記錄峰面積，以峰面積的3次平均值計算含量，外標(biāo)法定量。按上述色譜條件和質(zhì)譜條件測定峰面積，并以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=22 435x+8 633，R=0.999 7。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

表2 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料感官品質(zhì)評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory quality scoring standard of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage

1.2.6 復(fù)合飲料中酸棗仁皂苷含量的測定

取飲品3 mL于燒杯中，加入甲醇補滿，用0.45 μm有機濾膜后，采用高效液相色譜法測定復(fù)合飲料中酸棗仁皂苷含量。采用Phenomenex Gemini C18（50 mm×2.0 mm，5 μm）色譜柱進(jìn)行分析，流動相為甲醇（5 mmol/L-甲酸銨-0.1%甲酸緩沖液），采用梯度洗脫，流速為0.25 mL/min，柱溫40 ℃。每份樣品溶液進(jìn)樣3次，記錄峰面積，另取酸棗仁皂苷對照品溶液同法記錄峰面積，以峰面積的3次平均值計算含量，外標(biāo)法定量。按上述色譜條件和質(zhì)譜條件測定峰面積，并以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=30 111x+79 555，R＝0.999 6。

1.3 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)

取240只SPF級Balb-c健康雄性小鼠（8周齡，18～20 g）飼養(yǎng)于動物實驗室，室溫25±2 ℃，相對濕度55%±2%，12 h/12 h光照/黑暗循環(huán)，自主進(jìn)食和飲水。

1.4 小鼠分組灌胃及體質(zhì)量稱量

適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，剔除了體質(zhì)量過輕和過重的小鼠，按照實驗設(shè)篩選出200只健康小鼠進(jìn)行試驗。將小鼠分為5大組，分別是空白組、陽性對照（地西泮）組、燕窩靜心飲低劑量組、燕窩靜心飲中劑量組、燕窩靜心飲高劑量組，每大組40只，每大組里平均分為4小組，每小組10只，各組體質(zhì)量無統(tǒng)計學(xué)差異。灌胃劑量和藥品如下表3所示。連續(xù)灌胃30 d，分別對其進(jìn)行睡眠實驗。其中，每大組的第1小組進(jìn)行直接睡眠實驗；第2小組進(jìn)行延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗；第3小組進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗；第4小組進(jìn)行巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗。所有小組小鼠每周測量一次體質(zhì)量。

表3 實驗小鼠灌胃劑量表Table 3 Intragastric dosimetry of experimental mice

1.5 小鼠睡眠實驗

1.5.1 直接睡眠實驗

各組動物每天分別給予相應(yīng)的受試物，觀察灌胃后60 min內(nèi)，小鼠是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象，以動物的翻正反射消失超過60 s判為進(jìn)入睡眠，翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒。記錄各組入睡動物數(shù)及睡眠時間，觀察受試物對小鼠是否有直接睡眠作用[14]。

1.5.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

動物持續(xù)灌胃干預(yù)30 d，末次給藥30 min，以50 mg/kg劑量（以小鼠體質(zhì)量計，小鼠100%入睡但睡眠時間不長）腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失60 s為睡眠指標(biāo)，小鼠翻正反射消失至恢復(fù)之間的時間為睡眠時間，觀察受試物對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響[15]。

1.5.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

動物持續(xù)灌胃干預(yù)30 d，末次給藥30 min，以30 mg/kg劑量（以小鼠體質(zhì)量計，小鼠80%～90%未入睡劑量）腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失60 s為指標(biāo)，記錄腹腔注射開始30 min內(nèi)模型對照組和實驗組小鼠入睡數(shù)量[16]。

1.5.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

動物持續(xù)灌胃干預(yù)30 d，末次給藥20 min，以280 mg/kg劑量（以小鼠體質(zhì)量計，小鼠100%入睡）腹腔注射戊巴比妥鈉，以翻正反射消失60 s為指標(biāo)，記錄腹腔注射至小鼠翻正反射消失之間的時間作為睡眠潛伏期，比較模型對照組和實驗組睡眠潛伏期的差別[17]。

1.6 小鼠臟器指數(shù)檢測實驗

處死小鼠（處死前1 d禁食不禁水），取小鼠肝、肺、心、腎、腦用生理鹽水沖掉血液，濾紙擦干后稱重。切割腦組織后，用生理鹽水沖掉血液，濾紙擦干后稱重，放入含有一定量的生理鹽水tube管，用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，后可將?biāo)本放于-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.7 腦組織中5-HT、TPH、GABA、Glu含量檢測實驗

1.7.1 收集腦組織上清

將腦組織加入適量加9倍量（m/V）的4 ℃生理鹽水勻漿器搗碎。離心20 min左右（2 000～3 000 r/min），仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測，其余-20 ℃冷凍備用。

1.7.2 5-HT、TPH、GABA、Glu含量的測定將待測樣品（腦組織勻漿液上清）及小鼠5-HT標(biāo)準(zhǔn)品（0、15、30、60、120、240 ng/mL）、TPH標(biāo)準(zhǔn)品（0、30、60、120、240、480 pg/mL）、GABA標(biāo)準(zhǔn)品（0、0.5、1、2、4、8 μmol/L）、Glu標(biāo)準(zhǔn)品（0、3、6、12、24、48 mg/L）分別按照ELISA操作步驟測定其5-HT、TPH、GABA、Glu含量。具體操作步驟如下：從室溫平衡60 min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4 ℃。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL；待測樣本孔先加待測樣本10 μL，再加樣本稀釋液40 μL；隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100 μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37 ℃水浴鍋或恒溫箱溫育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，15 min內(nèi)，在450 nm波長處測定各孔的OD值。以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度設(shè)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式。5-HT標(biāo)準(zhǔn)曲線和TPH標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=334.42x-8.83（R2=0.8963）和y=392.7x-2.062（R2=0.8996）。GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線和Glu標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=0.4011x-0.222（R2=0.9253）和y=0.3256x-0.1554（R2=0.9236）

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果均為計量資料，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用GraphPad Prism 6.02統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料配方及感官評定

根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果確定各因素添加水平為：紅參粉添加量（0.2%、0.5%、1%）、燕窩原汁添加量（0.5%、0.8%、1%）、熟酸棗仁粉添加量（3.5%、4.5%、5.0%）和黃精粉（1.0%、2.0%、2.5%）。為了優(yōu)化產(chǎn)品的配方，在單因素實驗的基礎(chǔ)上選擇對產(chǎn)品品質(zhì)影響較大的4個因素，紅參粉、燕窩原汁、熟酸棗仁粉和黃精粉進(jìn)行L9(34)正交試驗。采用感官評定的方法進(jìn)行評價，結(jié)果顯示，有53.00%的評價者認(rèn)為其感官品質(zhì)為85分以上（良好），37.00%的評價者認(rèn)為該產(chǎn)品品質(zhì)為60分以上（一般），另外，10.00%的人評價其感官品質(zhì)為60分以下（較差）。評定產(chǎn)品感官品質(zhì)為“良好”的人最多，評定產(chǎn)品品質(zhì)為“較差”的人數(shù)相對較少，因此評定小組綜合判定該組產(chǎn)品感官品質(zhì)為良好。紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料風(fēng)味口感最優(yōu)的配方組合為：黃精粉2.5%、燕窩0.5%、熟酸棗仁粉4.5%、紅參粉0.5%。該配方研制的紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料色澤均勻，呈紫黑色，具有紅參、燕窩及酸棗仁特有味道，氣味均衡，無異味，組織細(xì)膩、均一清透，無雜質(zhì)、沉淀，無分層、穩(wěn)定性好，酸甜適口，口感協(xié)調(diào)，無苦澀。

2.2 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料中活性物質(zhì)的含量測定

將紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料在最佳色譜條件下測定，樣品的測定結(jié)果見表4。燕窩酸在50～1 000 ng/mL、紅參皂苷在25～500 ng/mL和酸棗仁皂苷B在12.5～500 ng/mL范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系，R＞0.9995。紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料中燕窩酸的平均含量分別為0.121 mg/g，RSD為1.61%；紅參皂苷的平均含量分別為0.008 mg/g，RSD為2.38%；酸棗仁皂苷的平均含量分別為0.04 mg/g，RSD為2.07%，平均加樣回收率均在99.35%～101.10%之間，加樣回收率良好。紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料中燕窩酸、紅參皂苷、酸棗仁皂苷的含量分別為0.12、0.01和0.04 mg/g，揭示該紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料可能具有燕窩酸和紅參皂苷的改善睡眠活性，分析原因如下：其一，燕窩所含的燕窩酸進(jìn)入人體后轉(zhuǎn)化為5-HT，是大腦神經(jīng)節(jié)苷脂的重要組成部分，能有效調(diào)理神經(jīng)衰弱、精神勞損造成的神經(jīng)性失眠[18]。其二，生酸棗仁粉味道酸澀，收斂的作用比較強，主要用于止汗、生津等；熟制后的酸棗仁粉藥性溫和，中醫(yī)治療過程中常常被用于治療心悸心煩、失眠多夢等癥狀[19]。其三，紅參中含有的皂苷，可以調(diào)節(jié)荷爾蒙平衡，鎮(zhèn)靜精神和神經(jīng)，但紅參藥性偏熱，具有火大、勁足、功效強。因此，將進(jìn)一步通過動物實驗對該復(fù)合飲品進(jìn)行改善睡眠功能評價[20]。

表4 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料中活性成分測定結(jié)果Table 4 Determination results of active ingredients in red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage

表5 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠體質(zhì)量的影響Table 5 Effects of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on body weight of mice (g, X±S, n=10)

2.3 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠體質(zhì)量的影響

對實驗動物體質(zhì)量進(jìn)行分析。由表5可知，實驗前各組小鼠初始體質(zhì)量無顯著性差異（p＞0.05）；灌胃給予不同劑量的配方7、14、21、30 d后，各組小鼠體質(zhì)量均無顯著性差異（p＞0.05），表明不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠體質(zhì)量無影響。

2.4 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠直接睡眠的影響

研究表明，用于改善睡眠的成分對小鼠均直接睡眠作用。五味子酒、人參棗仁顆粒、酸棗仁復(fù)配制劑均對小鼠直接睡眠無影響[21-23]。本實驗通過觀察各組小鼠灌胃60 min內(nèi)的活動情況。由表6可知，各組小鼠活動正常，均無出現(xiàn)翻正消失，未出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象，入睡率和睡眠時間均為0，即紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料是在正常睡眠過程中進(jìn)行睡眠質(zhì)量的改善，而非通過使小鼠直接進(jìn)入催眠狀態(tài)來達(dá)到改善睡眠質(zhì)量的目的。

表6 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠直接睡眠的影響Table 6 Influence of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on direct sleep of mice (n=10)

2.5 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

研究表明，高劑量組和中劑量組人參棗仁顆粒能延長戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間40%和48%[19]。本實驗睡眠時間經(jīng)統(tǒng)計分析滿足正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗要求，采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。陽性對照組較空白組能顯著延長小鼠睡眠時間。與空白組比較，低、中、高劑量的紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料均能不同程度的延長小鼠睡眠時間，分別延長了24.72%、66.11%、85.12%，且睡眠延長時間與劑量呈正相關(guān)。低、中、高劑量組之間小鼠睡眠時間比較：中劑量組和高劑量組較低劑量組睡眠時間顯著提高（表7）。

表7 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響Table 7 Effects of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on prolonging the sleep time of pentobarbital sodium in mice (X±S, n=10)

2.6 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

張璐等[21]經(jīng)口給予小鼠不同劑量的酸棗仁復(fù)配制劑后，較對照組的入睡率分別增加20%、34%和47%，入睡率隨劑量增加而提高。本實驗采用預(yù)實驗摸索確定戊巴比妥鈉閾下催眠劑量，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大閾下劑量30 mg/kg（以小鼠體質(zhì)量計）。由表8可知，陽性對照組睡眠率為90.00%，較空白組提高（p＜0.05）；與空白組比較，低劑量率組睡眠率為70.00%，中、高劑量組睡眠率為80.00%，分別增加了20.00%、30.00%、30.00%。紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料能提高小鼠睡眠率，且入睡率也呈劑量依賴性。

表8 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響Table 8 Effects of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on subthreshold hypnosis of pentobarbital sodium in mice (n=10)

2.7 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

睡眠指由清醒進(jìn)入睡眠狀態(tài)所需要的時間，縮短睡眠潛伏期可以達(dá)到改善睡眠的目的[24]。陳素華等[25]采用外部干預(yù)進(jìn)行實時控制的策略抑制有害認(rèn)知活動達(dá)到縮短入睡潛伏期的方法將入睡潛伏期減小到10～15 min。劉瑩等[26]用高劑量和中劑量的人參棗仁顆粒能使小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期明顯縮短巴比妥鈉小鼠睡眠潛伏期5～7 min。低劑量雖能減少小鼠睡眠潛伏期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意。相似的，經(jīng)過睡眠時間經(jīng)統(tǒng)計分析滿足正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗要求，采用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計處理。結(jié)果表明與空白組比較，陽性對照組和紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料的低、中、高劑量組睡眠潛伏期時間均顯著縮短，小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的趨勢為：空白組＞低劑量組＞中劑量組＞高劑量組＞陽性對照（表9），高劑量組可將睡眠潛伏期時間縮短14.37 min。

表9 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響Table 9 Effects of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on the sleep latency of barbiturate sodium in mice (X±S, n=10)

2.8 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠臟器毒理作用

前期睡眠實驗過程中有小鼠在戊巴比妥鈉誘導(dǎo)的時候死亡或者注入時沒有進(jìn)入睡眠狀態(tài)，因此通過數(shù)據(jù)處理后剔除了此狀態(tài)小鼠，解刨小鼠數(shù)量為每組8只。由表10可知，紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料低、中、高劑量組小鼠與正?？瞻捉M小鼠心、肝、肺、腎和腦組織的臟器指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05），表明紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠臟器無毒害作用。

表10 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 10 Effects of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on viscera index of mice(mg/g, X±S, n=8)

2.9 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠腦組織的影響

2.9.1 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠腦組織5-HT與TPH含量的影響

5-HT又名血清素，研究表明，其作為腦內(nèi)主要的單胺類神經(jīng)遞5-HT及其代謝產(chǎn)物可調(diào)節(jié)睡眠-覺醒電路[27]。早在1984年，Sakumoto等[28]研究發(fā)現(xiàn)藥物拮抗或手術(shù)切除5-HT能細(xì)胞會導(dǎo)致失眠的發(fā)生，并簡單得出5-HT可促進(jìn)睡眠的結(jié)論。通過近年來得不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)5-HT在調(diào)睡眠-覺醒周期中起到關(guān)鍵作用，其含量增加可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮，起到促進(jìn)睡眠的作用[29]。而色氨酸羥化酶（TPH）作為5-HT生物合成中的起始酶和限速酶，被認(rèn)為對調(diào)節(jié)5-HT濃度有關(guān)鍵作用[30-32]。本實驗繪得5-HT標(biāo)準(zhǔn)品和TPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式分別是y=334.42x-8.83（R2=0.896 3）和y=392.7x-2.062（R2=0.899 6），小鼠腦組織5-HT與TPH含量如表11所示，紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料劑量（低劑量組2 633.94 ng/mL、中劑量組2 978.64 ng/mL、高劑量組3 065.74 ng/mL）組較空白組小鼠腦組織中5-HT含量（2 235.66 ng/mL）顯著升高，分別提高了398.28、742.34、830.08 ng/mL，同時紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料中劑量組（2 963.60 pg/mL）、高劑量組（3 193.44 pg/mL）較空白組小鼠腦組織中TPH含量（2 529.78 pg/mL）顯著升高，分別提高433.82、663.74 pg/mL。

表11 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠腦組織5-HT與TPH含量的影響Table 11 Effects of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on the contents of 5-HT and TPH in the brain of mice (X±S, n=8)

2.9.2 紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠腦組織Glu與GABA含量的影響

表12 不同劑量紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料對小鼠腦組織Glu與GABA含量的影響Table 12 Effects of different doses of red ginseng- bird's nest-jujube seed compound sleeping beverage on the contents of Glu and GABA in the brain tissues of mice (X±S, n=8)

研究表明，氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與受體GABAA、GABAB受體結(jié)合起到鎮(zhèn)靜、抗焦慮的作用，是臨床上用于治療失眠癥的部分藥物的目標(biāo)靶點[33-35]。而Glu作為興奮性氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)，能夠在谷氨酸脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)化為GABA[36,37]。此外，GABA與Glu作為腦內(nèi)主要的抑制性與興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，維持它們之間的穩(wěn)態(tài)平衡對改善睡眠也是至關(guān)重要的[38]。本實驗繪得GABA和Glu標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程式y(tǒng)=0.401 1x-0.222（R2=0.925 3）和y=0.325 6x-0.155 4（R2=0.923 6），小鼠腦組織Glu與GABA含量如表12所示，與空白組比較，紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料中、高劑量組與陽性對照組GABA含量顯著升高，分別提高了0.04、0.06 μmol/L，同時Glu含量也顯著增加，分別提高了0.20、0.50 μmol/L。

3 結(jié)論

綜上所述，以紅參、燕窩和酸棗仁為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料的配方進(jìn)行優(yōu)化。本研究結(jié)果表明紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料的配方為燕窩0.5%、紅參粉0.5%、酸棗仁粉4.5%、黃精粉2.5%，改善睡眠效果最好。使用紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料30 d后，能顯著延長戊巴比妥鈉作用下小鼠的睡眠時間，增加戊巴比妥鈉閾下劑量作用下小鼠的入睡率，并能有效縮短巴比妥鈉催眠下小鼠的睡眠潛伏期。同時，研究結(jié)果還提示紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料其作用途徑可能是通過調(diào)節(jié)腦組織中血清素系統(tǒng)，提高5-HT和TPH含量；以及調(diào)節(jié)腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)Glu與GABA含量，并維持興奮性神經(jīng)遞質(zhì)與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)之間的穩(wěn)態(tài)平衡，從而發(fā)揮改善睡眠的作用。本次實驗結(jié)果表明紅參-燕窩-酸棗仁復(fù)合助眠飲料具有較好的改善睡眠功能，這一作用可能與復(fù)合飲品中含有調(diào)節(jié)神經(jīng)活性的燕窩酸、紅參皂苷和酸棗仁皂苷成分有關(guān)。