微小RNA-221和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子及血栓調(diào)節(jié)蛋白與心房顫動合并缺血性腦卒中的相關(guān)性

郭泉，張怡，李海軍，高珊

咸陽市中心醫(yī)院干部保健科1、老年病科2、臨床營養(yǎng)科3，陜西 咸陽 712000

心房顫動(房顫)是一種以持續(xù)性心房電活動紊亂為主要形式的心律失常，可明顯增加腦卒中和左心室功能不全風(fēng)險(xiǎn)，致殘致死率較高，威脅患者生命安全[1]。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factors，MIF)主要由巨噬細(xì)胞分泌，參與機(jī)體炎性反應(yīng)[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MIF具有調(diào)節(jié)其他促炎因子釋放的功能，并能促進(jìn)炎性細(xì)胞聚集，在動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生和進(jìn)展中起到重要作用[3]。還有報(bào)道指出，房顫患者血漿微小RNA(microRNA，miR)-221水平相對于正常人群較高，認(rèn)為miR-221參與房顫的發(fā)生過程[4]。血栓調(diào)節(jié)蛋白(thrombomodulin，TM)是反映血栓形成的重要指標(biāo)，心血管疾病患者往往TM水平明顯升高，提示TM參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[5]。上述研究均顯示，MIF、miR-221及TM與房顫發(fā)生密切相關(guān)，但具體發(fā)生機(jī)制尚未完全明確[6]。因此為進(jìn)一步探討上述因子參與房顫的具體機(jī)制，本研究對上述因子與房顫的心房重構(gòu)相關(guān)性進(jìn)行分析，以期了解上述因子在房顫患者心房重構(gòu)時(shí)的機(jī)制，為臨床治療房顫提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2020年1月至2021年5月在咸陽市中心醫(yī)院住院治療且符合以下納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的83例房顫合并缺血性腦卒中患者作為研究組，其中男性44例，女性39例；年齡63～84歲，平均(70.33±1.25)歲；發(fā)病至入院3～9 h，平均(5.87±1.01)h；TOAST分型：小動脈閉塞型16例，大動脈粥樣硬化型25例，心源性腦栓塞20例，其他22例；小學(xué)至初中27例，高中34例，大專至以上22例。研究組患者根據(jù)房顫性質(zhì)分為陣發(fā)性房顫組45例，持續(xù)性房顫組38例；同時(shí)根據(jù)改良的Rankin量表(mRS)評分分為兩組，其中22例＞3分者納入預(yù)后不良組，余61例≤3分者納入預(yù)后良好組[7]。將同期我院收治的60例缺血性腦卒中患者作為對照組，其中男性33例，女性27例；年齡64～85歲，平均(70.59±1.20)歲；發(fā)病至入院3～8 h，平均(5.62±1.08)h；TOAST分型：小動脈閉塞型14例，大動脈粥樣硬化型18例，心源性腦栓塞16例，其他12例；小學(xué)至初中20例，高中23例，大專至以上17例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2018》[8]、《心房顫動基層診療指南(2019年)》[9]診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)過心電圖等檢查確診；(2)病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)聽力或者交流障礙者；(2)合并甲狀腺功能亢進(jìn)、重度貧血、風(fēng)濕性心臟病、惡性腫瘤、精神類疾??；(3)具備出血傾向的抗凝禁忌證。將50例在我院體檢的健康人群作為健康組，其中男性28例，女性22例；年齡61～82歲，平均(70.69±1.36)歲；小學(xué)至初中13例，高中20例，大專至以上17例。研究組、對照組和健康組受檢者的性別、年齡和文化水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 檢測方法抽取各組研究對象的靜脈血6 mL，在4℃條件下3 000 r/min離心10 min，取上層血清待檢。其中3 mL用于TRIZOL試劑盒提取血清總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提取RNA反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，選擇ABI 7500定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR，miR-221上游引物：5'-CCGCAGCTACATCTGGCTACTG-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'，反應(yīng)條件：95℃條件下10 min預(yù)變性；95℃時(shí)15 s變性；69℃時(shí)1 min退火，重復(fù)40次，選擇2-△△Ct法計(jì)算miR-221的相對表達(dá)量。剩余3 mL通過酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20190105)、TM檢測試劑盒(美國Neomarker公司，批號20181205)、酶聯(lián)免疫分析儀(日本東曹株式會社，AIA-2000ST)，首先將樣品置于冰上緩慢融化，依據(jù)要求稀釋，每孔放入空白對照，帶側(cè)孔設(shè)立復(fù)孔，利用封板膠紙堵住反應(yīng)孔，置于室溫環(huán)境下，清除膠膜與孔內(nèi)液體，重復(fù)緩沖4次，每孔中添加檢測抗體，堵住反應(yīng)孔，室溫保存2 h。清除膠膜與孔內(nèi)液體，重復(fù)緩沖4次，每孔中添加標(biāo)記鏈酶親和素，封閉反應(yīng)孔，室溫保存30 min，清除膠膜與孔內(nèi)液體，重復(fù)緩沖4次，再次添加標(biāo)記鏈酶親和素，避光室溫下保存20 min，等待變色，最后在每孔中添加終止液，測定數(shù)值。嚴(yán)格依據(jù)說明書要求測定MIF、TM。

1.3 觀察指標(biāo)(1)比較研究組、對照組和健康組受檢者的miR-221、MIF、TM水平；(2)比較陣發(fā)性房顫組與持續(xù)性房顫組患者的miR-221、MIF、TM水平；(3)比較預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的一般臨床資料，分析影響房顫合并缺血性腦卒中患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素；(4)評價(jià)心房增大、左房直徑、射血分?jǐn)?shù)、miR-221、MIF、TM與房顫合并缺血性腦卒的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析心房增大、左房直徑、射血分?jǐn)?shù)、miR-221、MIF、TM與房顫合并缺血性腦卒的相關(guān)性；采用多因素Logistic回歸方程分析影響房顫合并缺血性腦卒中患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。均以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組、對照組和健康組受檢者的各項(xiàng)指標(biāo)比較研究組患者的miR-221、MIF、TM水平明顯高于對照組和健康組，而健康組體檢者的miR-221、MIF、TM水平明顯低于研究組和對照組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表1。

表1 研究組、對照組和健康組受檢者的各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

表1 研究組、對照組和健康組受檢者的各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與研究組比較，bP＜0.05。

組別研究組對照組健康組F值P值TM(μg/L)48.59±6.17a 30.26±4.22ab 17.88±1.61b 692.300 0.001例數(shù)83 60 50 miR-221 1.42±0.37a 1.06±0.25ab 0.67±0.12b 108.290 0.001 MIF(ng/L)1 469.23±50.20a 1 087.56±42.18ab 582.46±20.53b 7 043.040 0.001

2.2 陣發(fā)性房顫組與持續(xù)性房顫組患者的各項(xiàng)指標(biāo)比較陣發(fā)性房顫組患者的miR-221、MIF、TM水平明顯低于持續(xù)性房顫組，差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，見表2。

表2 陣發(fā)性房顫組與持續(xù)性房顫組患者的各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

表2 陣發(fā)性房顫組與持續(xù)性房顫組患者的各項(xiàng)指標(biāo)比較(±s)

注：與健康組比較，aP＜0.05；與研究組比較，bP＜0.05。

組別陣發(fā)性房顫組持續(xù)性房顫組t值P值TM(μg/L)44.20±5.80 50.38±6.59 4.494 0.001例數(shù)45 38 miR-221 1.33±0.30 1.62±0.44 3.442 0.001 MIF(ng/L)1 309.46±45.29 1 577.84±48.01 26.168 0.001

2.3 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組患者的臨床資料比較兩組患者合并糖尿病、感染、高脂血癥、高血壓、肥胖比例比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；預(yù)后良好組患者的年齡、女性、心房增大、左房直徑、射血分?jǐn)?shù)、miR-221、MIF、TM水平明顯低于預(yù)后不良組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，見表3。

表3 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組患者的一般臨床資料比較[±s，例(%)]

表3 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組患者的一般臨床資料比較[±s，例(%)]

2.4 各項(xiàng)指標(biāo)與房顫合并缺血性腦卒中的相關(guān)性經(jīng)Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，心房增大、左房直徑、射血分?jǐn)?shù)、miR-221、MIF、TM與房顫合并缺血性腦卒中呈正相關(guān)(P＜0.05或P＜0.01)，見表4。

表4 各項(xiàng)指標(biāo)與房顫合并缺血性腦卒中的相關(guān)性

2.5 影響房顫合并缺血性腦卒中預(yù)后的危險(xiǎn)因素分別以房顫合并缺血性腦卒中患者預(yù)后是否良好(是為1，否為0)為因變量，miR-221、MIF及TM為自變量，經(jīng)多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-221、MIF、TM是房顫合并缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素(P＜0.05)，見表5。

表5 影響房顫合并缺血性腦卒中預(yù)后危險(xiǎn)因素的多因素Logistic回歸分析

3 討論

房顫是快速型心律失常之一，其中心房因?yàn)轭潉涌赡苁ビ行У氖湛s節(jié)律，從而使泵血能力減低甚至喪失，增加淀粉沉積、心房纖維化、心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)概率，最終導(dǎo)致心房增大。隨著心房不斷擴(kuò)大，血液聚集，局部產(chǎn)生渦流，牽連內(nèi)皮細(xì)胞受損，并刺激凝血機(jī)制，形成血栓[10]。而左心房血栓脫落引發(fā)的缺血性腦卒中是房顫中最為常見且嚴(yán)重的并發(fā)癥，具備較高的致殘率與病死率。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，缺血性腦卒中占全部腦卒中的85%，是世界范圍內(nèi)第二位死亡原因[11]。若未能夠盡早診斷并及時(shí)選擇合理治療方案，隨著房顫合并缺血性腦卒中的持續(xù)發(fā)展，相應(yīng)癥狀明顯加重，給患者帶來極大傷害，因此盡早準(zhǔn)確診斷具有重要意義。目前臨床多選擇心電圖、頭顱CT等檢查來診斷該疾病，雖然取得一定的應(yīng)用價(jià)值，但其檢出率較低，尤其是臨床將房顫類型劃分成陣發(fā)性與持續(xù)性兩大類，其治療方式存在較大差異，因此準(zhǔn)確鑒別在治療方案的抉擇上具有重要作用[12]。近些年隨著醫(yī)療水平的完善發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)miR-221、MIF、TM與房顫合并缺血性腦卒中的關(guān)系密切，若能夠完全了解其相關(guān)性，可對臨床治療起到一定指導(dǎo)意義。

miR作為新型非編碼小分子RNA，可在轉(zhuǎn)錄后防止基因表達(dá)，同時(shí)產(chǎn)生相關(guān)生物學(xué)作用，其中miR-221作為miR中常見類型。經(jīng)動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-221在腦卒中大鼠腦組織中表達(dá)升高，而減低miR-221可避免缺血腦組織出現(xiàn)炎性反應(yīng)，還可降低腦組織缺血缺氧造成的損傷，提示miR-221與缺血性腦卒中的發(fā)生進(jìn)展存在密切關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，房顫患者存在較多表達(dá)失調(diào)的基因，mRNA、蛋白表達(dá)差異較大，從而使研究目標(biāo)轉(zhuǎn)變成miR這類新型基因表達(dá)調(diào)控因子，轉(zhuǎn)錄后水平能夠?qū)虮磉_(dá)進(jìn)行控制[13]。以往臨床試驗(yàn)證實(shí)，房顫患者miR-221水平較正常者升高。本文研究發(fā)現(xiàn)，陣發(fā)性房顫組患者的miR-221水平明顯低于持續(xù)性房顫組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)槌掷m(xù)性房顫患者病情更為嚴(yán)重，機(jī)體的炎性反應(yīng)更顯著，且腦組織缺血缺氧程度更嚴(yán)重，因此其表達(dá)較陣發(fā)性房顫患者更高。另外本次試驗(yàn)的結(jié)果顯示，研究組的miR-221水平明顯高出對照組、健康組。此結(jié)果與相關(guān)研究結(jié)果相符[14]，表明miR-221通過調(diào)控基因表達(dá)，能夠使蛋白、mRNA表達(dá)差異變大，并通過影響膠原代謝，導(dǎo)致心房重構(gòu)，引發(fā)房顫。同時(shí)炎性反應(yīng)在房顫發(fā)生與發(fā)展中意義重大，一旦受到炎癥、氧化應(yīng)激等刺激后，可導(dǎo)致纖維細(xì)胞產(chǎn)生胞外基質(zhì)，最終造成肌束間胞外基質(zhì)過度堆積，為心肌纖維化奠定基礎(chǔ)，增加房顫發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

MIF作為結(jié)構(gòu)特殊的多效免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，其主要是由T細(xì)胞、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)，可刺激T淋巴細(xì)胞的關(guān)鍵性趨化因子。研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者M(jìn)IF水平高于健康者，提示其表達(dá)與疾病發(fā)生發(fā)展存在一定相關(guān)性。臨床指出，健康者機(jī)體MIF水平通常處于2～4 μg/L，其分泌受到下丘腦-垂體的控制，呈現(xiàn)組成性表達(dá)，具備合成MIF能力的細(xì)胞將已經(jīng)合成的MIF分子保存在細(xì)胞池內(nèi)，一旦受到內(nèi)毒素影響后分泌MIF，加上胞外各類蛋白酶的作用出現(xiàn)變化，使MIF展現(xiàn)生物學(xué)活性，積極參與機(jī)體的炎性反應(yīng)中。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組MIF水平明顯高出對照組，而陣發(fā)性房顫組患者的MIF水平明顯低于持續(xù)性房顫組。本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致，表明MIF參與炎性反應(yīng)導(dǎo)致心房重構(gòu)，引起房顫。

TM是由內(nèi)皮細(xì)胞合成，分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的單鏈糖蛋白中，能夠引導(dǎo)抗凝因子蛋白C快速活化，導(dǎo)致凝血酶底物出現(xiàn)特異性變化，積極參與機(jī)體抗凝反應(yīng)，一旦血漿水平升高后，可促進(jìn)血小板堆積，其表達(dá)與心腦血管疾病存在一定關(guān)聯(lián)。研究發(fā)現(xiàn)，TM作為內(nèi)皮細(xì)胞損傷的主要標(biāo)志，一旦血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，TM可從細(xì)胞中分泌，進(jìn)而提升其表達(dá)水平，因此房顫患者TM水平更高，尤其是持續(xù)性房顫患者[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，研究組患者的TM水平明顯高出對照組、健康組；陣發(fā)性房顫組患者的TM水平明顯低于持續(xù)性房顫組。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，表明TM通過提高表達(dá)水平，促進(jìn)抗凝反應(yīng)，從而使血小板堆積，心血管管徑縮小，心臟負(fù)荷提升，導(dǎo)致心房重構(gòu)，最終引起房顫。

最后本次研究中，預(yù)后良好組與預(yù)后不良組患者合并糖尿病、感染、高脂血癥、高血壓比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。預(yù)后良好組患者的年齡、女性、心房增大、左房直徑、射血分?jǐn)?shù)、miR-221、MIF、TM水平明顯低于預(yù)后不良組，通過多因素Logistic回歸方程發(fā)現(xiàn)，miR-221、MIF、TM是房顫合并缺血性腦卒中的危險(xiǎn)因素。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，心房增大、左房直徑、射血分?jǐn)?shù)、miR-221、MIF、TM與房顫合并缺血性腦卒中呈正相關(guān)，提示影響患者預(yù)后的因素較多，應(yīng)受到重點(diǎn)關(guān)注，尤其是老年、女性、心房增大、左房直徑、射血分?jǐn)?shù)、miR-221、MIF、TM水平異常者，盡早給予相關(guān)干預(yù)，為其預(yù)后提供保障。

綜上所述，miR-221、MIF、TM水平在房顫合并缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義，同時(shí)可成為評估房顫發(fā)生與持續(xù)的新指標(biāo)，為臨床后續(xù)治療方案的制定提供參考。