血管內(nèi)皮生長因子、單核細(xì)胞趨化蛋白1、分化抑制因子1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與血管生成的相關(guān)性分析*

吳佩濤，丁凡，歐陽偉，王少兵

（1.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北武漢 430000；2.武漢普仁醫(yī)院脊髓病中心，湖北武漢 430081）

腦膠質(zhì)瘤屬于一種原發(fā)性顱腦腫瘤疾病，具有高度侵襲性、腫瘤生長無明確邊界、細(xì)胞無限增生三大特征[1]。流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)，惡性腦膠質(zhì)瘤的5年生存率＜5%，5年病死率僅次于胰腺癌、肺癌[2]。有研究證實，血管為腫瘤提供營養(yǎng)物質(zhì)并促進(jìn)代謝產(chǎn)物排出，而血管新生化程度與腫瘤細(xì)胞增殖、生物侵襲性、惡性程度、預(yù)后等密切相關(guān)[3-4]。因此，尋找一種對腫瘤早期診斷、血管生成評估、預(yù)后判斷的可靠方法尤為關(guān)鍵。

腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞可產(chǎn)生或通過旁分泌方式與腫瘤細(xì)胞或血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）受體特異性結(jié)合，直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少血管密度，促進(jìn)血管生成[5]。作為轉(zhuǎn)錄因子的共同作用分子，分化抑制因子（inhibitor of differentiation 1, Id1）高表達(dá)可激活VEGF 轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，進(jìn)而抑制膠質(zhì)瘤生長[6]。單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemotactic protein-1, MCP-1）是CC 類趨化因子之一，可由內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、腫瘤組織等分泌，在維持腫瘤細(xì)胞生長等生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用[7]。本研究進(jìn)一步分析VEGF、MCP-1、Id1 在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及與血管生成的相關(guān)性，為臨床防治本病提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年4月—2020年5月湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院腦膠質(zhì)瘤患者150 例作為病例組。其中男性82 例，女性68 例；年齡33～62 歲，平均（51.43±6.58）歲；體質(zhì)量指數(shù)（22.46±2.15）kg/m2；腫瘤直徑：＜5 cm 79 例，≥5 cm 71 例；腫瘤部位：小腦幕下70 例，小腦幕上80 例；分化程度：低分化61 例，中高分化89 例；腦膠質(zhì)瘤Kemohan 分級：Ⅰ、Ⅱ級59 例患者作為低級別組，Ⅲ、Ⅳ級91 例患者作為高級別組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《臨床神經(jīng)外科學(xué)》[8]的腦膠質(zhì)瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)；②原發(fā)腦膠質(zhì)瘤；③鏡下接受腦膠質(zhì)瘤切除術(shù)治療；④經(jīng)手術(shù)病理學(xué)及術(shù)前影像學(xué)明確病情；⑤未接受放化療；⑥卡氏評分＞70分。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他惡性腫瘤；②合并免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病；③重要臟器功能嚴(yán)重受損，如心、肝、腎等；④入組前接受放化療、激素治療；⑤預(yù)計生存時間＜1年。另選取本院因腦外傷后行顱內(nèi)減壓術(shù)的50 例非腫瘤患者作為對照組。其中男性29例，女性21例；年齡32～68 歲，平均（52.64±7.02）歲；體質(zhì)量指數(shù)（22.03±2.67）kg/m2；經(jīng)手術(shù)病理證實為正常腦組織。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可對比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 血清指標(biāo)檢測術(shù)前采集所有患者空腹靜脈血4 mL，常溫靜置30 min，2 000 r/min離心15 min，取上層血清，置于-80℃冰箱冷凍保存。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗（廣東固康生物科技有限公司）測定血清VEGF、MCP-1 水平，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（上海羽哚生物科技有限公司）測定血清Id1 水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書執(zhí)行。

1.2.2 腫瘤微血管密度（MVD）計數(shù)術(shù)后采集所有患者腦組織標(biāo)本，置于-80℃冰箱冷凍保存，用10%濃度的甲醇浸泡腦組織，石蠟包埋，切片。將腦組織切片置于光學(xué)顯微鏡（CX21 型，日本Olympus株式會社）下觀察，并確定獨立微血管，以CD105為特異性標(biāo)志物，取5 個視野的微血管數(shù)平均值作為MVD 值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；比較用t檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 法； 繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲線。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者血清VEGF、MCP-1、Id1水平比較

兩組患者血清VEGF、MCP-1、Id1 水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），病例組血清VEGF、Id1水平較對照組高，MCP-1 水平較對照組低。見表1。

表1 兩組患者血清VEGF、MCP-1、Id1水平比較 （±s）

表1 兩組患者血清VEGF、MCP-1、Id1水平比較 （±s）

組別對照組病例組t 值P 值n 50 150 VEGF/（pg/mL）202.62±50.23 315.75±46.98 9.887 0.000 MCP-1/（pg/mL）428.84±96.19 327.97±86.96 6.915 0.000 Id1/（μg/L）29.31±5.53 39.96±5.49 11.851 0.000

2.2 血清VEGF、MCP-1、Id1 水平預(yù)測腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的價值

ROC 曲線結(jié)果顯示，血清VEGF、MCP-1、Id1 水平及3 者聯(lián)合預(yù)測膠質(zhì)瘤發(fā)生的AUC 分別為0.873（95% CI：0.823，0.923）、0.776（95% CI：0.699，0.853）、0.898（95% CI：0.850，0.946）、0.908（95% CI：0.851，0.978）。見表2 和圖1、2。

表2 血清VEGF、MCP-1、Id1水平預(yù)測腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的價值

圖1 血清VEGF、Id1水平及聯(lián)合預(yù)測膠質(zhì)瘤發(fā)生的ROC曲線

圖2 血清MCP-1水平預(yù)測膠質(zhì)瘤發(fā)生的ROC曲線

2.3 不同級別腦膠質(zhì)瘤患者血清VEGF、MCP-1、Id1水平及MVD比較

不同級別腦膠質(zhì)瘤患者血清VEGF、MCP-1、Id1水平及MVD 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），高級別組血清VEGF、Id1 水平及MVD 較低級別組高，MCP-1 水平較低級別組低。見表3。

表3 不同級別腦膠質(zhì)瘤患者血清VEGF、MCP-1、Id1水平及MVD比較 （±s）

表3 不同級別腦膠質(zhì)瘤患者血清VEGF、MCP-1、Id1水平及MVD比較 （±s）

組別低級別組高級別組t 值P 值n 59 91 VEGF/（pg/mL）284.65±43.77 367.74±59.35 9.243 0.000 MCP-1/（pg/mL）374.45±59.75 300.48±43.77 8.740 0.000 Id1/（μg/L）34.18±4.76 43.85±6.29 10.080 0.000 MVD/（個/視野）24.96±8.05 57.65±9.72 21.487 0.000

2.4 腦膠質(zhì)瘤患者血清VEGF、MCP-1、Id1 水平與MVD的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析顯示，腦膠質(zhì)瘤患者M(jìn)VD 與血清VEGF 水平、Id1 水平呈正相關(guān)（r=0.532、0.697，均P=0.000），與MCP-1 水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.395，P=0.003）。

3 討論

VEGF 是血管生成的主要調(diào)控因子，具有刺激內(nèi)皮細(xì)胞分化、提高血管通透性、抑制成熟樹突細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分化及遷移、介導(dǎo)血管形成等生物學(xué)作用[9]。有研究報道，由VEGF 介導(dǎo)的沿血管基底膜侵襲是腦膠質(zhì)瘤最常見的侵襲途徑，間接證實了VEGF 在膠質(zhì)瘤血管新生、細(xì)胞增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[10]。SEYEDMIRZAEI 等[11]在1 項Meta 分析中提到，腦膠質(zhì)瘤患者血清VEGF 水平比健康者高，且不同級別腦膠質(zhì)瘤患者的血清VEGF水平存在明顯差異。SHAMSDIN 等[12]研究報道，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤患者血清VEGF 水平升高，且VEGF 水平與腦膠質(zhì)瘤患者炎癥反應(yīng)、預(yù)后密切相關(guān)。本研究中，病例組血清VEGF 水平較對照組高，預(yù)測腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的AUC 為0.873，且高級別組血清VEGF 水平比低級別組高，再次證實VEGF 高表達(dá)可能會增加腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生風(fēng)險，加重病情程度及細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，其原因在于高表達(dá)的VEGF 可增加血管通透性，誘導(dǎo)血管持續(xù)生成，促進(jìn)血液纖維蛋白原外滲，形成腫瘤周圍水腫，為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞快速生長及細(xì)胞侵襲提供了血液、營養(yǎng)供應(yīng)，加劇腦膠質(zhì)瘤病情[13]。

MCP-1 可由諸多組織細(xì)胞分泌，可調(diào)節(jié)記憶性T 細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的浸潤、遷移[14]。張景杰等[15]研究發(fā)現(xiàn)，腦膠質(zhì)Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級患者血清MCP-1 水平低于健康對照組，且動態(tài)觀察血清MCP-1 水平有利于判斷微創(chuàng)手術(shù)效果及評估預(yù)后。本研究中病例組血清MCP-1 水平比對照組低，高級別組血清MCP-1 水平比低級別組低，表明腦膠質(zhì)瘤患者血清MCP-1 水平下調(diào)，且與級別程度呈負(fù)相關(guān)，分析其原因可能與MCP-1 具有抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、趨化炎癥細(xì)胞浸潤等機(jī)制有關(guān)；同時MCP-1 可對腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生趨化作用，促使其分泌VEGF、IL-8 等因子誘導(dǎo)血管生成，刺激局部組織血管化；此外，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可分泌降解細(xì)胞外基質(zhì)的金屬蛋白酶2、金屬蛋白酶9 等，從而損傷細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)定性，促進(jìn)腫瘤侵襲、生長；而高級別膠質(zhì)瘤可破壞血腦屏障，進(jìn)一步促使MCP-1更容易穿過血腦屏障而進(jìn)入腫瘤組織內(nèi)部[16]。

Id1 是轉(zhuǎn)錄因子的共同作用分子，其異常升高可通過多條信號通路控制Rb 蛋白活性以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[17]。SOROCEANU 等[18]實驗發(fā)現(xiàn)，Id1 表達(dá)上升與培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲性呈正比，而沉默Id1表達(dá)可延長腦膠質(zhì)瘤模型大鼠的生存期，降低腫瘤細(xì)胞侵襲性。周保丹[19]研究報道，腦膠質(zhì)瘤中Id1 蛋白過表達(dá)，且其表達(dá)與患者臨床病理分級、侵襲程度、預(yù)后有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤患者血清Id1 水平上升，且與級別程度呈正相關(guān)，與上述研究相似，故推測Id1 可能成為腦膠質(zhì)瘤治療的潛在分子靶點，作用機(jī)制可能與Id1 可通過降低腫瘤細(xì)胞黏附力，促進(jìn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及血管內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖，從而加劇腫瘤侵襲有關(guān)。

MVD 是用免疫組織化學(xué)法標(biāo)記腫瘤組織中的微血管，可間接反映腫瘤血管生成能力。本研究發(fā)現(xiàn)，高級別組MVD 比低級別組高，支持腦膠質(zhì)瘤的富血管性的說法，且病理學(xué)分級惡性程度越高，其MVD 越高，新生血管數(shù)量越多。Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，腦膠質(zhì)瘤患者M(jìn)VD 與血清VEGF、Id1 水平呈正相關(guān)，與MCP-1 水平呈負(fù)相關(guān)，提示血清VEGF、Id1 水平高表達(dá)及MCP-1 水平低表達(dá)可分別促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤新生血管生成，為腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、增殖、浸潤等惡性生物學(xué)行為提供充足的血液、營養(yǎng)供應(yīng)。進(jìn)一步繪制ROC 曲線發(fā)現(xiàn)，血清VEGF、MCP-1、Id1 水平及聯(lián)合預(yù)測腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的AUC 分別為0.873、0.776、0.898 和0.908，提示臨床應(yīng)密切監(jiān)測血清VEGF、MCP-1、Id1 水平變化，識別腦膠質(zhì)瘤高危人群，指導(dǎo)抗血管生成治療方案，以抑制腦膠質(zhì)瘤新生血管生成，預(yù)防細(xì)胞侵襲、浸潤。

綜上所述，腦膠質(zhì)瘤患者血清VEGF、Id1 水平上調(diào)，MCP-1 水平下調(diào)，三項指標(biāo)與腫瘤血管生成密切相關(guān)，且可有效預(yù)測腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生。但由于例數(shù)有限、隨訪時間有限，腫瘤血管生成受諸多因素影響，故針對VEGF、MCP-1、Id1 在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、血管生成中的確切意義仍需進(jìn)一步探討。